花姜酮對急性肝損傷大鼠Nrf2/HO-1/NQO-1氧化應激損傷的影響

石洪林 余文勝

肝臟是人體重要的新陳代謝及排毒臟器，其主要通過肝酶對進入人體的藥物、酒精、蛋白質、脂肪等外源性物質進行氧化還原、水解催化等生化反應[1]。由于肝臟所負責的代謝功能較多，病毒感染、過量脂肪堆積、藥物濫用、酒精過量等原因易造成肝臟生理功能及生理結構的損傷，也是肝纖維化、肝硬化、肝癌等肝臟疾病的重要促發因素。肝臟損傷的發生和發展與其組織中線粒體結構被破壞、線粒體呼吸鏈活性被抑制、活性氧（ROS）異常堆積增多，從而加劇氧化應激損傷有著密切的關系[2-3]?；ń墙平獙僦参锛t球姜[Zingiberzerumbet（L.）Smith]根莖中的倍半萜化合物，具有消腫鎮痛、抗炎、抗氧化、抗帕金斯、抗肝損傷等藥理活性[4-5]。雖然近年來關于花姜酮對急性肝損傷的作用有了初步研究，但未深入闡明其具體的作用機制[6]。本研究通過四氯化碳誘導建立急性肝損傷大鼠模型，深入研究花姜酮對急性肝損傷小鼠的作用及其可能作用機制，為臨床應用花姜酮治療肝損傷提供科學的實驗數據。

1 材 料

1.1動物 SD 大鼠50 只，SPF 級，雌雄各半，體質量（200±20）g，由浙江大學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證：SYXK（浙）2018-0016，實驗動物生產許可證：SCXK（浙）2018-0006。大鼠飼養于通風良好的環境，室溫18～25℃，相對濕度40%～70%，12h光照晝夜循環。實驗開始前大鼠進行適應性喂養1周。該實驗屬于前期課題申請的基礎研究，完全遵照動物實驗的倫理要求進行。

1.2藥物 花姜酮：美國Sigma 有限公司，批號B 201541；聯苯雙酯滴丸：北京協和藥廠，批號20201206。

1.3試劑 四氯化碳（分析純）：成都市科隆化工試劑廠，批號20 191122；丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、丙二醛（MDA）、羥自由基（·OH）、活性氧（ROS）、三磷酸腺苷（ATP）、線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅲ（ComplexⅠ、Ⅲ）試劑盒：南京建成，批號20210504、20210507、20210513、20210523、20210527、20210514、20210612、20 210608；錳-超氧化物歧化酶（Mn-SOD）、過氧化氫酶（CAT）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒：晶美生物工程有限公司，批號20210613、20 210604；兔抗小鼠核因子E2 相關因子2（Nrf-2）、醌氧化還原酶-1（NQO-1）、血紅素加氧酶1（HO-1）多克隆抗體：美國Cell Signaling Technology 公司，批號21354、21476、21427；actin 多克隆抗體（中國Proteintech 公司，批號10586-BH）。

1.4主要儀器 UVmini-1240 型紫外-可見分光光度計（島津國際貿易上海有限公司）；TGL-16G 高速臺式冷凍離心機（杭州匯爾儀器設備有限公司）；9602A-酶標儀（北京艾普生設備有限公司）；垂直電泳儀、轉膜及顯影設備（美國BIO-RAD 公司）。

2 方 法

2.1動物分組及給藥 使用隨機數字表法將50 只SD 大鼠分為五組：空白組、模型組、聯苯雙酯組（40mg/kg）、花姜酮低劑量組（5mg/kg）、花姜酮高劑量組（10mg/kg），每組10 只。腹腔注射相對應藥物，每天1 次，每次注射0.8mL，連續注射5d?？瞻捉M、模型組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。

2.2急性肝損傷模型建立[7]末次注射給藥2h 后，模型組、聯苯雙酯組及花姜酮低、高劑量組腹腔注射0.2%四氯化碳花生油溶液（0.01mL/g），建立急性肝損傷大鼠模型?？瞻捉M予等體積花生油腹腔注射。

2.3生化指標檢測 注射四氯化碳花生油溶液后16h 戊巴比妥鈉麻醉大鼠，大鼠腹主動脈取血，3500r/min 高速低溫離心機分離10min，吸取上清液。按試劑盒說明書操作，采用ELISA 法檢測大鼠肝功能指標AST、ALT 及抗氧化指標Mn-SOD、CAT、ComplexⅠ、Ⅲ活性、氧化因子MDA、·OH、ROS、ATP含量。

2.4Western blot 法檢測 Western blot 法檢測肝組織Nrf-2、NQO-1、HO-1 蛋白表達水平。冰浴下制備肝臟10%的勻漿液，12 000r/min，有效離心半徑8cm，4℃，高速離心5min，分離上清液。用BCA 法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，根據目的蛋白分子量的大小采用不同濃度的分離膠進行SDS-PAGE 凝膠電泳。將配置好的SDS-PAGE 膠置于電泳槽中，待用蛋白置于水鍋中煮沸5min 后，混勻，上樣孔中分別加入Marker 及樣品蛋白，轉移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉，洗膜，加入相對應的一抗，4℃孵育過夜，TBST 溶液洗膜，加入稀釋的二抗，水平搖床中孵育60min，TBST 溶液洗膜，暗室中曝光顯影。凝膠電泳成像分析系統掃描，Image J 軟件分析蛋白條帶。

2.5病理學檢測 切除部分肝臟，制作石蠟，將其切片在二甲苯中脫蠟，移入二甲苯與純乙醇（1∶1）的混合液中，乙醇逐級脫水，蘇木精染液染色，水洗玻片上多余的染液，0.5%鹽酸乙醇分色，蒸餾流水沖洗，0.5%伊紅染液染色，乙醇逐級脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡觀察肝組織病變程度。

2.6統計學方法 應用SPSS 16.0 軟件進行統計分析。所得實驗數據均符合正態分布，以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊性，進一步采用Bonferroni 法進行兩兩比較；若方差不齊，采用Kruska-Wallis H 秩和檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1各組大鼠血清ALT、AST 水平比較 與空白組比較，模型組大鼠血清ALT、AST 含量顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較，聯苯雙酯組及花姜酮高、低劑量組大鼠血清ALT、AST 含量均有所下降（P＜0.05）。與聯苯雙酯組比較，花姜酮高劑量組ALT 含量較高，AST 含量較低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清ALT、AST 水平比較（U/mL，）

表1 各組大鼠血清ALT、AST 水平比較（U/mL，）

注：空白組為健康SD 大鼠，予生理鹽水；模型組為肝損傷模型大鼠，予生理鹽水；聯苯雙酯組為肝損傷模型大鼠，予3.75mg/kg 聯苯雙酯混懸液；花姜酮高劑量組為肝損傷模型大鼠，予10mg/kg 花姜酮混懸液；花姜酮低劑量組為肝損傷模型大鼠，予5g/kg 花姜酮混懸液；ALT為天門冬氨酸氨基轉移酶；ALT 為丙氨酸氨基轉移酶；與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與聯苯雙酯組比較，cP＜0.05；與花姜酮高劑量組比較，dP＜0.05

3.2各組大鼠肝組織病理學結果比較 HE 染色結果顯示，空白組大鼠肝臟細胞結構完整，形態清晰且大小形態均一，排列整齊呈放射狀；模型組大鼠肝臟細胞大小不一，且呈不規律排列順序，有大面積空泡變性及出現大量炎癥細胞浸潤和肝細胞壞死；聯苯雙酯組肝組織細胞排列較模型組整齊且規律，細胞形態較好，空白變性較少，炎癥細胞浸潤減少；花姜酮高劑量組肝組織細胞結構較完整，排序基本呈放射狀排列，空泡數量及炎癥浸潤細胞較少；花姜酮低劑量組細胞結構損傷較嚴重，細胞形狀及大小不一，排列混亂，較模型組整齊，空泡數量及炎癥浸潤細胞較多。見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織病理學結果（HE 染色×400）

3.3各組大鼠肝組織Mn-SOD、CAT 活性及MDA含量比較 與空白組比較，模型組大鼠肝臟組織Mn-SOD、CAT 活性降低，MDA 含量增加（P＜0.05）。與模型組比較，聯苯雙酯組及花姜酮高、低劑量組大鼠肝組織Mn-SOD、CAT 的活性增加，MDA 含量減少（P＜0.05）。與聯苯雙酯組比較，花姜酮高劑量組CAT 活性較高、MDA 含量較多（P＜0.05），Mn-SOD 活性無明顯差異（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠肝組織氧化因子Mn-SOD、CAT 活性及MDA 含量比較（）

表2 各組大鼠肝組織氧化因子Mn-SOD、CAT 活性及MDA 含量比較（）

注：空白組為健康SD 大鼠，予生理鹽水；模型組為肝損傷模型大鼠，予生理鹽水；聯苯雙酯組為肝損傷模型大鼠予3.75mg/kg 聯苯雙酯混懸液；花姜酮高劑量組為肝損傷模型大鼠予10mg/kg 花姜酮混懸液；花姜酮低劑量組為肝損傷模型大鼠予5g/kg 花姜酮混懸液；Mn-SOD為錳-超氧化物歧化酶；CAT 為過氧化氫酶；MDA 為丙二醛；與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與聯苯雙酯組比較，cP＜0.05；與花姜酮高劑量組比較，dP＜0.05

3.4各組大鼠肝組織ROS、·OH 含量比較 與空白組比較，模型組大鼠肝組織·OH、ROS 含量明顯增加（P＜0.05）。與模型組比較，聯苯雙酯組及花姜酮高、低劑量組大鼠肝組織·OH、ROS 含量顯著降低（P＜0.05）。與聯苯雙酯組比較，花姜酮高劑量組ROS、·OH 含量較低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠肝組織ROS、·OH 含量比較（nmol/mg，）

表3 各組大鼠肝組織ROS、·OH 含量比較（nmol/mg，）

注：空白組為健康SD 大鼠，予生理鹽水；模型組為肝損傷模型大鼠，予生理鹽水；聯苯雙酯組為肝損傷模型大鼠予3.75mg/kg 聯苯雙酯混懸液；花姜酮高劑量組為肝損傷模型大鼠予10mg/kg 花姜酮混懸液；花姜酮低劑量組為肝損傷模型大鼠予5g/kg 花姜酮混懸液；ROS 為活性氧；·OH 為羥自由基；與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與聯苯雙酯組比較，cP＜0.05；與花姜酮高劑量組比較，dP＜0.05

3.5各組大鼠肝組織ComplexⅠ、ComplexⅢ活性及ATP 含量比較 與空白組比較，模型組大鼠肝組織ComplexⅠ、Ⅲ活性降低，ATP 含量減少（P＜0.05）。與模型組比較，聯苯雙酯組及花姜酮高、低劑量組大鼠肝組織ComplexⅠ、Ⅲ活性提高ATP 含量增加（P＜0.05）。與聯苯雙酯組比較，花姜酮高劑量組ComplexⅠ、Ⅲ活性及ATP 含量較高（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠肝組織ComplexⅠ、ComplexⅢ活性及ATP 含量比較（）

表4 各組大鼠肝組織ComplexⅠ、ComplexⅢ活性及ATP 含量比較（）

注：空白組為健康SD 大鼠，予生理鹽水；模型組為肝損傷模型大鼠，予生理鹽水；聯苯雙酯組為肝損傷模型大鼠予3.75mg/kg 聯苯雙酯混懸液；花姜酮高劑量組為肝損傷模型大鼠予10mg/kg 花姜酮混懸液；花姜酮低劑量組為肝損傷模型大鼠予5g/kg 花姜酮混懸液；ComplexⅠ為線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ；ComplexⅢ為線粒體呼吸鏈復合物Ⅲ；ATP 為三磷酸腺苷；與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與聯苯雙酯組比較，cP＜0.05；與花姜酮高劑量組比較，dP＜0.05

3.6各組大鼠肝組織Nrf-2、NQO-1、HO-1 蛋白表達比較 與空白組比較，模型組大鼠肝組織Nrf-2、NQO-1、HO-1 蛋白表達減少（P＜0.05）。與模型組比較，聯苯雙酯組及花姜酮高、低劑量組大鼠肝組織Nrf-2、NQO-1、HO-1 蛋白表達增加（P＜0.05）。與聯苯雙酯組比較，花姜酮高劑量組Nrf-2、NQO-1、HO-1 蛋白表達較高（P＜0.05）。見表5，圖2。

圖2 各組大鼠肝組織Nrf-2、NQO-1、HO-1 蛋白表達比較

表5 各組大鼠肝組織Nrf-2、NQO-1、HO-1 蛋白表達比較（相對表達量，）

表5 各組大鼠肝組織Nrf-2、NQO-1、HO-1 蛋白表達比較（相對表達量，）

注：空白組為健康SD 大鼠，予生理鹽水；模型組為肝損傷模型大鼠，予生理鹽水；聯苯雙酯組為肝損傷模型大鼠予3.75mg/kg 聯苯雙酯混懸液；花姜酮高劑量組為肝損傷模型大鼠予10mg/kg 花姜酮混懸液；花姜酮低劑量組為肝損傷模型大鼠予5g/kg 花姜酮混懸液；Nrf-2 為核因子E2 相關因子2；NQO-1 為醌氧化還原酶-1；HO-1 為血紅素加氧酶1；與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與聯苯雙酯組比較，cP＜0.05；與花姜酮高劑量組比較，dP＜0.05

4 討論

肝細胞對ROS 生成能力遠高于清除能力，引起產生與清除之間不平衡，而造成的肝臟氧化應激損傷在肝臟疾病的病理進程中起重要作用[8]。線粒體在正常呼吸過程中，會有一小部分氧氣不能完成傳輸電子，而形成具有細胞毒性的氧自由基。正常情況下，肝臟可通過酶系統和小分子抗氧化劑的抗氧化防御系統對所產生的氧自由基通過氧化還原平衡進行消除[9-10]。但當肝臟功能受損或障礙時，線粒體呼吸過程所產生的氧自由基會與具有完整電子分子的氧原子上的電子進行配對，使其成為新的氧自由基。同時肝臟對ROS 消除能力下降，細胞內大量的ROS 產生及堆積，對DNA 堿基反應進行破壞，并促使生物膜發生脂質氧化，進而形成氧化應激，觸發細胞內的凋亡聯級反應，引起肝細胞損傷及凋亡[11]。

Nrf-2 是重要的抗氧化轉錄因子，其與改善氧化應激引起的細胞損傷有著重要的關系[12]。研究表明，在病毒性肝炎、脂肪肝、肝纖維化等急慢性肝損傷中Nrf-2 是治療的關鍵調控因子[13-14]。Nrf-2 可通過環氧氯丙烷相關蛋白1（Keap1）依賴途徑和非依賴途徑被激活，使其由細胞質轉移到細胞核中，與特定的抗氧化反應元件（ARE）結合后，激活下游Mn-SOD、CAT 等抗氧化酶的活性，提高機體內源性抗氧化能力，增加機體對氧化自由基ROS、·OH 的清除效率，減少氧化應激對線粒體的損傷，進而改善線粒體的呼吸效能[15-16]。實驗結果表明，花姜酮能提高肝臟中CAT、Mn-SOD 的活性及ATP 含量，降低·OH、ROS、MDA 的含量，同時增加肝臟中ComplexⅠ、Ⅲ活性，提示花姜酮能提高機體的抗氧化防御系統功能，減緩氧化應激損傷。

HO-1、NQO-1 是Nrf-2 下游的Ⅱ相解毒酶。在氧化應激損傷過程中，HO-1、NQO-1 可催化血紅蛋白降解產生膽綠素和CO 等產物，減少脂質過氧化含量，發揮抗氧化、抗炎的作用。同時HO-1、NQO-1 也可防止細胞凋亡，降低肝臟損傷相關標志物表達，是抗氧化中重要的防御分子。故Nrf2/HO-1/NQO-1 信號通路是減少氧化應激對肝臟損傷的有效途徑。實驗結果表明，花姜酮能增加肝臟中Nrf-2、NQO-1、HO-1 蛋白表達。

綜上所述，花姜酮能改善急性肝損傷大鼠肝功能、增加抗氧化因子CAT、Mn-SOD 的活性及ATP 含量，增強對ROS、·OH、MDA 的清除能力，提高肝臟中ComplexⅠ、Ⅲ活性及Nrf-2、NQO-1、HO-1 蛋白表達，減緩氧化應激對肝臟的損傷，達到對急性肝損傷模型大鼠的保護作用，其作用機制與花姜酮調控Nrf2/HO-1/NQO-1 信號通路有著密切的關系。