miR-19a 在鼻咽癌細胞上皮間質轉化中的作用

孫海力 林文巧 李紹霄 陳恩就

上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是惡性腫瘤轉移發生的重要因素，隨著EMT 進展，腫瘤細胞遷移和侵襲能力進一步增強，最終實現癌細胞轉移[1]。microRNAs（miRNAs）作為一類短鏈非編碼RNA，通過與靶向信使RNA 的3'非翻譯區（3'-UTR）的專一性結合，影響靶基因表達[2]。研究表明，miRNAs 參與調控各種對細胞正常發育至關重要的生物過程[3]，某些miRNAs 已被證明可以抑制或促進EMT[4]。例如miR-130a-3p 可通過靶向調控H19 抑制體外膠質瘤細胞EMT[5]；而miR-101-3p 可通過調控宮頸癌細胞遷移和侵襲，抑制EMT 過程和細胞遠處轉移[6]。然而，miR-19a 在鼻咽癌EMT 發生過程中的作用仍有待進一步證實。本研究探討miR-19a 在鼻咽癌細胞EMT 過程中的作用，為揭示鼻咽癌細胞轉移的分子生物學機制提供參考證據。

1 實驗材料

1.1細胞 鼻咽癌細胞株CNE2、SUNE-1、HNE1、58F 及人正常鼻咽上皮細胞株NP69 購自中科院細胞庫。

1.2試劑和儀器 1640 培養基購于上海微科生物技術有限公司（批號P875-N10）；胎牛血清購于上海素爾生物科技有限公司（批號XC45632）；LipofectamineTM2000 購自美國Invitrogen 公司（批號L3287）；miR-19a 及內參U6 的引物和探針由廣州伯信生物公司設計；Trizol 購自美國Invitrogen 公司（批號12183555）；Takara One Step PrimeScript microRNA cDNA Synthesis Kit 和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ購自日本Takara 公司（批號D350A、DRR041A）；ECMatrix 膠和Transwell 小室購自美國Corning 公司（批號356234、3422）；BCA 蛋白測定試劑盒和超敏ECL 化學發光試劑盒購自南京凱基公司（批號EW-48-63、EW-6613）；熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國abcam 公司（批號ab228530）；抗E-cadherin、N-cadherin 和KRAS 抗體購自美國abcam 公司（批號 ab40772、ab76011、ab191595）；FAK、SRC 和 β -actin 抗體購自美國Santa Cruz 公司（批號sc-271126、sc-166860、sc-8432）；倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司（型號：IX71）；實時熒光定量PCR 儀購自美國伯樂公司（型號：9600）；凝膠成像儀購自北京廣開源商貿有限公司（型號：IAS-500）。

2 實驗方法

2.1細胞培養 運用1640 培養液對細胞進行培育，同時在1640 培養液中添加10%胎牛血清，細胞放置細胞培養箱環境中，使用含EDTA 胰蛋白酶消化，按照1∶3 的比例進行傳代。

2.2細胞轉染及分組 鼻咽癌細胞加入96 孔板中，每孔中分配2×104個細胞，完全遵循LipofectamineTM2000 試劑盒說明書進行下一步操作。實驗分為四組：mimics NC 組：每孔SUNE-1 細胞加入100nmol 的mimics NC 及5μL 轉染試劑；miR-19a mimics 組：每孔SUNE-1 細胞加入100nmol 的miR-19a mimics及5μL 轉染試劑；inhibitor NC 組：每孔HNE1 細胞加入100nmol 的inhibitor NC 及5μL 轉染試劑；miR-19a inhibitor 組：每孔HNE1 細胞加入100nmol的miR-19a inhibitor 及5μL 轉染試劑，轉染后48h收集細胞進行實行熒光定量PCR（quantitative realtime PCR，RT-qPCR）檢測，確定轉染效率后再進行細胞體外實驗。

2.3RT-qPCR 檢測miR-19a 表達 用Trizol 試劑提取總RNA 并按照說明操作，RNA 濃度由超微量分光光度計檢測，逆轉錄和熒光定量PCR 過程完全遵循試劑盒說明書進行，設置U6 作為內參，通過2-△△Ct法分析miR-19a 在鼻咽癌細胞中的含量，實驗重復3 次，取平均值。

2.4細胞體外侵襲實驗 每個Transwell 上室鋪有一層ECMatrix 膠模擬體內環境，收集鼻咽癌SUNE-1 和HNE1 細胞懸液，經冰PBS 緩沖液洗滌3 次，并將細胞懸液的密度調節至2×105/mL，將20μL 細胞懸液加至Transwell 上室，再將500μL 的DMEM 完全培養基加入Transwell 下室，Transwell 小室置于37℃中孵育過夜后加入1～2 滴結晶紫試劑，反應15min后在光學顯微鏡下觀察轉移至Transwell 小室背側的細胞，在200 倍放大視野下隨機計數5 個視野下的藍染細胞，實驗重復3 次，取平均值。

2.5熒光素酶報告基因檢測 將重組熒光素酶報告載體mut-psiCHECK-KRAS-3'-UTR 或wt-psi-CHECK-KRAS-3'-UTR 共轉染至SUNE-1 細胞中，再分別將miR-19a mimics 或mimics NC 轉染至SUNE-1 細胞中，轉染48h 后收獲細胞，樣品熒光素酶活性檢測過程完全遵循熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進行，每組樣本設5 個復孔。

2.6蛋白質印跡法 鼻咽癌細胞在細胞裂解液的作用下提取蛋白，總蛋白經勻漿、離心和變性等操作后，使用凝膠電泳分離后轉移至硝酸纖維素膜上，通過脫脂奶粉進行封閉操作，整體實驗環境為4℃，維持12h，硝酸纖維素膜通過Ⅰ抗、Ⅱ抗反應后，添加一定的化學發光液，完成顯色、曝光等處理。

2.7細胞免疫熒光檢測 收集胰蛋白酶消化后的SUNE-1 細胞以制備單細胞懸浮液，將消化好的細胞懸液密度調至3×104/mL，將0.5mL 細胞液滴加到24孔板中的多聚賴氨酸處理的細胞爬片上，藥物初步處理后放在37℃環境中12h，細胞經PBS 清洗和甲醛固定后加入KRAS 一抗在4℃溫度下孵育12h，經PBS 沖洗殘余一抗后加入熒光二抗在室溫下孵育1h，再次經PBS 沖洗3 次后加入Hoechst33342 染色液在室溫下孵育5min，在熒光顯微鏡下觀察并拍攝照片。

2.8統計學方法 應用SPSS 16.0 軟件進行統計分析并繪制統計圖。在本實驗中獲得的所有測量數據均符合正態分布，以均數±標準差（）表示，采用SNKq 檢驗分析兩個樣品之間的差異，設立P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1miR-19a 在鼻咽癌細胞系和正常鼻咽上皮細胞中的表達 NP69 細胞miR-19a 表達水平分別是CNE2、SUNE-1、HNE1 和58F 細胞的5.88、3.57、11.11 和6.67 倍，差異有統計學意義（P 均＜0.01）。miR-19a 在高轉移細胞株HNE1 和低轉移細胞株SUNE-1 中的表達分別為最低和最高，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.01），選擇這兩種細胞株作為后續實驗所用材料。

3.2轉染miR-19a mimics 和miR-19a inhibitor 對鼻咽癌細胞體外侵襲的影響 將miR-19a mimics轉染至鼻咽癌SUNE-1 細胞，同時將miR-19a inhibitor 轉染至鼻咽癌HNE1 細胞，RT-qPCR 結果表明，miR-19a mimics 組SUNE-1 細胞中的miR-19a表達水平明顯高于mimics NC 組（P＜0.01），而miR-19a inhibitor 組HNE1 細胞中的miR-19a 表達水平較inhibitor NC 組明顯減少（P＜0.01），見表1。

表1 各組miR-19a 表達水平比較（差異倍數，）

表1 各組miR-19a 表達水平比較（差異倍數，）

注：mimics NC 組為每孔SUNE-1 細胞加入100nmol 的mimics NC 及5μL 轉染試劑；miR-19a mimics 組為每孔SUNE-1 細胞加入100nmol的miR-19a mimics 及5μL 轉染試劑；inhibitor NC 組為每孔HNE1細胞加入100nmol 的inhibitor NC 及5μL 轉染試劑；miR-19a inhibitor組為每孔HNE1 細胞加入100nmol 的miR-19a inhibitor 及5μL 轉染試劑；與mimics NC 組相比，aP＜0.01；與inhibitor NC 組相比，bP＜0.01

腫瘤細胞體外侵襲實驗結果顯示，轉染miR-19a mimics 后可明顯減少侵襲出Matrigel 基質膠的SUNE-1 細胞數量（見圖1），mimic NC 組和miR-19a mimics 組侵襲細胞數分別為（25.6±4.4）和（10.5±2.1），兩組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。轉染miR-19a inhibitor 后可顯著促進HNE1 細胞侵襲行為，inhibitor NC 組和miR-19a inhibitor 組侵襲細胞數分別為（16.9±2.5）和（34.2±4.9），兩組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖1 Transwell 小室實驗測定體外鼻咽癌細胞侵襲

3.3驗證miR-19a 的直接靶基因KRAS 為進一步研究miR-19a 在鼻咽癌細胞EMT 中的可能作用機制，通過檢索miRBase 數據庫獲得has-miR-19a 序列，并通過生物信息學工具TargetScan 對miR-19a可能存在的靶基因進行分析。如圖2A 所示，發現KRAS 與has-miR-19a 存在潛在的結合位點，為此，我們進一步應用熒光素酶報告檢測系統驗證體外SUNE-1 細胞miR-19a 對KRAS 的調控作用。

圖2 生物信息學工具預測KRAS 與has-miR-19a 潛在的結合位點（A），Western blot 檢測KRAS 蛋白的表達（B）

熒光素酶報告檢測結果如表2 所示，與共轉染wt-psiCHECK-KRAS-3'-UTR 和inhibitor NC 后細胞熒光素酶活性相比較，在SUNE-1 細胞中共轉染wt-psiCHECK-KRAS-3'-UTR 和miR-19a inhibitor后的熒光素酶活性明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；而共轉染mut-psiCHECK-KRAS-3'-UTR 和miR-19a inhibitor 后細胞熒光素酶活性值與共轉染mut-psiCHECK-KRAS-3'-UTR 和inhibitor NC 后的細胞熒光素酶活性相比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。用miR-19a mimics 和miR-19a inhibitor 分別轉染SUNE-1 和HNE1 細胞后，應用Western blot 分析鼻咽癌SUNE-1 和HNE1 細胞中KRAS 蛋白的表達，結果表明（見圖2B），miR-19a mimics 組KRAS表達較mimics NC 組明顯減少（P＜0.01），而miR-19a inhibitor 組中的KRAS 表達水平顯著高于inhibitor NC 組（P＜0.01）。以上結果提示，miR-19a 可與KRAS 的3'-UTR 結合，KRAS 是miR-19a 的直接靶向基因。

表2 各組熒光素酶活性比較（差異倍數，）

表2 各組熒光素酶活性比較（差異倍數，）

注：與wt-psiCHECK-KRAS-3'-UTR+inhibitor NC 組比較，aP＜0.01

3.4過表達KRAS 可挽救miR-19a 對鼻咽癌細胞EMT 過程的抑制作用 為證實miR-19a 對鼻咽癌細胞EMT 過程的抑制作用是否通過直接作用于其靶基因KRAS 而實現，將SUNE-1 細胞分為mimics NC 組、miR-19a mimics 組 和miR-19a mimics+KRAS mimics 組，細胞體外侵襲實驗結果如圖3A 所示，mimics NC 組、miR-19a mimics 組 和miR-19a mimics+KRAS mimics 組侵襲細胞數分別為（28.3±3.4）、（11.6±1.5）和（23.7±2.8），mimics NC 組和miR-19a mimics 組相比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。miR-19a mimics 組和miR-19a mimics+KRAS mimics 組相比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。

Western blot 結果如圖3B 所示，與mimics NC組比較，miR-19a mimics 組鼻咽癌細胞N-cadherin、p-FAK 和p-SRC 均表達下調，而E-cadherin 表達上調。另外，SUNE-1 細胞經轉染KRAS mimics 后，miR-19a mimics 對E-cadherin、N-cadherin、p-FAK和p-SRC 蛋白表達的調控作用明顯被削弱。表明miR-19a 對鼻咽癌細胞EMT 過程的抑制作用可能通過直接作用于其靶基因KRAS 來實現。

圖3 Transwell 小室實驗檢測細胞侵襲（A），Western blot 測定E-cadherin、N-cadherin、KRAS、p-FAK 和p-SRC 的表達（B）

4 討論

EMT 作為一種自然發生的上皮細胞表現出間質細胞特征的過程，是胚胎分化成熟的基礎。癌細胞在自身分子改變或腫瘤微環境的刺激下發生EMT，得以侵入基底膜并從原發腫瘤脫落，進而發生遠處轉移[1]。miRNAs 與EMT 過程聯系緊密，miR-125b 通過靶向調控生長因子2 和生長因子4 的表達，同時負性調控EMT 過程，從而削弱肝癌細胞的轉移性和耐藥性[7]；上調miR-125b 的表達可逆轉惡性腫瘤細胞EMT，抑制腫瘤干細胞的生成[8-9]；SOX17/miR-371-5p/SOX2 軸可以抑制結直腸癌細胞EMT、干細胞特性和轉移傾向[10]。但miR-19a 與鼻咽癌轉移是否相關尚未見報道，本研究發現，miR-19a 通過直接靶向調控KRAS 的表達，從而有效抑制體外鼻咽癌細胞EMT 行為。

研究發現，miR-19a 在包括鼻咽癌在內的多種惡性腫瘤細胞中的表達下調，并且可作為重要的獨立預后標志物[11-12]。因此，我們假設miR-19a 能夠抑制鼻咽癌細胞的EMT 和轉移。RT-qPCR 分析發現，正常鼻咽上皮細胞系中miR-19a 的表達遠高于多種鼻咽癌細胞系；此外，miR-19a 在高轉移細胞株SUNE-1 中表達相對較低，在低轉移細胞株HNE1 中表達相對較高。以上結果表明，miR-19a 可能作為一種EMT 抑制劑。同時，沉默miR-19a 的表達增強了鼻咽癌細胞的侵襲性，而上調miR-19a 的表達可逆轉EMT 的發生。

KRAS 是EMT 相關事件的關鍵調節因子，下調KRAS 的表達能促進包括卵巢癌和鼻咽癌在內的多種實體瘤EMT 的發生[13-15]。然而，迄今為止，miR-19a與KRAS 之間的相互作用尚未研究，在我們的研究中，miR-19a 表達上調可以下調KRAS 在鼻咽癌細胞中的表達；此外，雙熒光素酶報告基因檢測進一步表明miR-19a 直接靶向KRAS 的3'-UTR 從而調控KRAS 的表達；最后我們通過挽救實驗證實，過表達KRAS 可逆轉miR-19a 對鼻咽癌細胞EMT 過程的抑制作用。上述結果說明，miR-19a 通過抑制其靶基因KRAS 翻譯水平的表達，在抑制鼻咽癌細胞EMT過程中發揮了重要作用。

FAK 是一種胞質非酪氨酸激酶受體，具有蛋白間交聯受體的功能[16]。研究表明，FAK 在多種侵襲性和轉移性腫瘤中表達上調[17]；鼻咽癌組織中FAK 活性與鼻咽癌細胞浸潤表型有關，FAK 表達上調與轉移性鼻咽癌中侵襲性表型關系密切[18]。FAK 的下游信號因子如SRC 和PI3K 等可誘導細胞轉移，由于FAK/SRC 通路激酶對細胞極性、黏附性、運動性和EMT 的潛在影響，被認為是實體腫瘤有效的治療靶點[19-20]。本研究顯示，上調miR-19a 可抑制SUNE-1細胞中磷酸化FAK/SRC 水平和EMT 過程，從而表明FAK/SRC 通路的磷酸化水平可能在miR-19a 發揮抗癌作用中起到一定作用。

綜上所述，本研究結合之前的研究報道表明，miR-19a 可能通過靶向KRAS 以及負性調控FAK/SRC 通路從而抑制鼻咽癌細胞EMT 過程，這種過表達miR-19a 的方式可為未來轉移性鼻咽癌治療提供一種特殊策略。