NEC-1 在大鼠腦出血后繼發性腦損傷中的作用研究

尹 劍 金許洪 呂慶平 張子彬 龐曉俊

自發性腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是我國最常見的破壞性腦血管疾病，具有很高的死亡率和致殘率。ICH 引起的腦水腫、神經炎癥、鐵超載、血腦屏障破壞、細胞凋亡、自噬等病理生理機制復雜，治療措施有限，療效不佳[1-2]。近年研究發現，壞死性凋亡受體抑制劑1（necrostain 1，NEC-1）與腦水腫關系密切，在腦挫傷研究中能減輕神經損傷程度[3]。但NEC-1 與ICH 后腦組織交互受體蛋白1/3（receptorinteracting protein 1/3，RIP1/RIP3）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）因子表達之間的關系尚未明確。本實驗制作大鼠腦出血模型，探討NEC-1 在ICH 后繼發性腦損傷中的作用及具體機制。

1 資料與方法

1.1實驗動物 選擇SPF 級SD 大鼠54 只，體質量250～300g，來源于浙江中醫藥大學動物實驗室。所有大鼠飼養在屏障環境內，溫度20～26℃，濕度（50%～70%），光照（每12h 明暗交替），換風（15～20 次/h）。動物生產許可證號：SCXK（滬）2013-2016，動物飼養許可證號：SYXK（浙）2013-0184，本實驗經浙江中醫藥大學動物管理與倫理委員會審核通過。

1.2主要試劑及儀器 磷酸鹽緩沖液（pH7.2～7.4，美國Hyclone，SH30256.01，AD22391274），BCA 試劑盒（Solarbio，pc0020，20180328），DAPI（中國碧云天，ZH3201、H762531），ECL 顯影液（Solarbio，PE0010，20181220），RIPA 裂解液（Beyotime，P0013D，10352），PVDF 膜（瑞典GE，106000023，A16954279），Trizol（Sangon Biotech，B548124-0500，E108KA7471），Anti-Rat TNF-α（美國PeproTech，500P72，AD3653623），二抗（美國Abcam，ab150076，GR2356152），NEC-1（美國Abcam，411880，ab141053），Anti-Rat RIP1（美國Cell Signaling，E7G60，53286），Anti-Rat RIP3[（美國Abcam，EPR9516（N）-25，ab240336）]，Anti-Rat IL-1β（美國Abcam，RM1009，ab283818）。電泳儀（天能，EPS300），電泳槽（天能，VE180C），轉膜儀（天能，VE186），立體定向儀（美國Stoelting，51600）。

1.3分組及造模 應用隨機數字表法將大鼠分為三組：假手術組（sham operation group，sham 組），ICH+生理鹽水組（ICH+normal saline group，ICH+NS 組），腦出血+NEC-1 組（ICH+NEC-1 group，ICH+NEC-1組），每組18 只。在無菌條件下，大鼠以3.6%水合氯醛（4g/kg）腹腔麻醉。頭部去毛，俯臥固定大鼠于動物頭顱立體定位儀，調節立體定位儀，將門齒固定，使前后囟在一條線上，頭皮丁字切開，在人字縫前方2mm、中線旁開2.5mm 處，骨鉆鉆開顱骨約1mm 小孔，不傷及硬腦膜及腦組織。用40℃溫水加熱消毒尾靜脈，待充血充分后消毒，使用微量注射器抽取不抗凝動脈血50μL 固定在定位以上，將微量注射器通過孔洞進針至6mm 尾狀核部，停留時間約5min 后緩慢退出注射器，完善止血后用骨蠟封閉骨窗?？p合皮膚后回籠飼養。Sham 組僅切開頭皮，開骨窗，不造成腦出血。模型制作成功的評分判斷：待大鼠清醒后按照Bederson 評分法[4]分為3 級，Ⅰ級：將大鼠尾巴提起，癱瘓側前肢回收后屈曲于腹下，正常側前肢向地面伸展。Ⅱ級：除Ⅰ級體征外，向癱瘓側推大鼠時阻力較對側明顯降低。Ⅲ級：除以上體征外，大鼠有向癱瘓側側旋的行為。ICH+NS 組以及ICH+NEC-1 組選擇蘇醒后出現上述癥狀和體征的大鼠，而且造模后各時間段均出現相似的神經功能缺損癥狀和體征的大鼠為腦出血模型成功者，進行后續實驗，否則棄之不用。Sham 組大鼠不出現神經功能缺損，活動正常。如有造模不成功或死亡，則隨機補充。

1.4側腦室給藥干預方法 大鼠于制作模型成功為起點，Sham 組不給藥；ICH+NS 組經側腦室干預注射NS 1μL，ICH+NEC-1 組經側腦室干預注射NEC-1溶劑（80μmol/mL）1μL。

1.5大腦組織含水量（brain water content，BWC）測定 分別隨機取Sham 組、ICH+NS 組、ICH+NEC-1組大鼠各6 只，在干預給藥后24h 進行大鼠深麻醉后斷頸處死，并迅速取出腦組織，分別用電子分析天平稱量各只大鼠腦組織濕重，再置入105℃烤箱72h后取出，分別測量大腦組織干重。按照Elliot 公式[5]計算腦組織含水量=（濕重－干重）/濕重×100%。

1.6細胞凋亡的形態學檢測方法（TUNEL）測定 給藥后24h，分別隨機取Sham 組、ICH+NS 組、ICH+NEC-1 組大鼠各6 只，應用TUNEL 法檢測腦組織神經細胞凋亡情況。具體方法：各取切片，水浴鍋加熱抗原修復，投膜，加入抗體，PBS 清洗，DAPI 核染色，封片。采用灰度值（OD）測量，顯微鏡下觀察并計算神經細胞凋亡指數。

1.7蛋白質免疫印跡法（Western blot）測定 給藥后24h，分別隨機取Sham 組、ICH+NS 組、ICH+NEC-1 組大鼠各6 只，大鼠提取腦組織，采用Western blot法檢測腦組織中RIP1/RIP3、TNF-α、IL-1β 蛋白水平的表達情況。具體方法：各取適量腦組織加裂解液，勻漿后離心，取上清液，提取蛋白，用BAC 法測定蛋白濃度：放入100℃水浴鍋內煮5min，配置10%SDA-PAG 凝膠，每孔加入適量蛋白和Loading Buffer 混合液，電泳分離，然后將目標蛋白和GAPDH膠轉膜至PVDF 膜上，封閉1h，加入RIP1/RIP3、TNF-α、IL-1β 抗體稀釋液，4℃過夜，再加入二抗，溫室孵育1h，洗膜，用ECL 發光液顯影。通過應用軟件測OD，以目的蛋白和GAPDH 比值作為相對表達量進行結果分析。

1.8統計學方法 應用統計軟件SPSS 20.0 進行數據分析，實驗數據采用正態分布檢驗，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，采用完全隨機設計單因素方差分析（one-way ANVOVA），以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1NEC-1 對ICH 大鼠腦水腫的影響 與Sham 組比較，ICH+NS 組和ICH+NEC-1 組大鼠腦組織含水量顯著升高（P＜0.05）。與ICH+NS 組比較，ICH+NEC-1 組大鼠腦組織含水量減輕（P＜0.05）。見表1。

2.2NEC-1 對ICH 大鼠腦組織神經細胞凋亡指數的影響 與Sham 組比較，ICH+NS 組和ICH+NEC-1組凋亡指數均明顯升高（P＜0.05）。與ICH+NS 組比較，ICH+NEC-1 組神經細胞凋亡指數顯著減少（P＜0.05）。見表1。

表1 NEC-1 對ICH 大鼠腦組織水腫及神經細胞凋亡指數的影響（）

表1 NEC-1 對ICH 大鼠腦組織水腫及神經細胞凋亡指數的影響（）

注：Sham 組為假手術組；ICH+NS 組為模型組，經側腦室干預注射NS；ICH+NEC-1 組為模型干預組，經側腦室干預注射NEC-1 溶劑；ICH 為自發性腦出血；NS 為生理鹽水；NEC-1 為壞死性凋亡因子-1；與Sham 組比較，aP＜0.05；與ICH+NS 組比較，bP＜0.05

2.3NEC-1 對ICH 大鼠腦組織RIP1/RIP3、TNF-α、IL-1β 蛋白表達的影響 與Sham 組比較，ICH+NS組和ICH+NEC-1 組RIP1/RIP3、TNF-α、IL-1β 蛋白表達均明顯升高（P＜0.05）。與ICH+NS 組比較，ICH+NEC-1 組RIP1/RIP3、TNF-α、IL-1β 蛋白表達顯著減少（P＜0.05）。見圖1、表2。

表2 NEC-1 對ICH 大鼠腦組織RIP1/RIP3、TNF-α、IL-1β蛋白表達的影響（）

表2 NEC-1 對ICH 大鼠腦組織RIP1/RIP3、TNF-α、IL-1β蛋白表達的影響（）

注：Sham 組為假手術組；ICH+NS 組為模型組，經側腦室干預注射NS；ICH+NEC-1 組為模型干預組，經側腦室干預注射NEC-1 溶劑；ICH 為自發性腦出血；NS 為生理鹽水；NEC-1 為壞死性凋亡因子-1；與Sham 組比較，aP＜0.05；與ICH+NS 組比較，bP＜0.05；RIP1 為交互受體蛋白1；RIP3 為交互受體蛋白3；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-1β為白介素-1β

圖1 NEC-1 對ICH 大鼠腦組織RIP1/RIP3、TNF-α、IL-1β蛋白表達的影響

3 討論

ICH 是常見的神經外科危急重癥，ICH 后繼發性腦損傷可誘發腦疝，危及患者生命。因此，如何有效控制繼發性腦損傷是改善ICH 患者預后的關鍵。目前，除了開顱清血腫、去骨瓣減壓手術等治療外，臨床上主要采用藥物治療，但療效不佳[6-7]。

交互受體蛋白家族（receptor-interacting proteinfamily，RIPs）是一類具有特異的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的蛋白，在免疫、炎癥反應、細胞死亡等信號傳導中發揮著重要作用。在RIPs 中，RIP1 和RIP3 在細胞壞死性凋亡通路中起到非常重要的作用。其中，RIP1 決定細胞生存或死亡，RIP3 是誘導細胞凋亡與壞死相互轉換的關鍵分子。RIP3 與RIP1 通過共有的同型互動域結構相互作用，使RIP1 磷酸化，形成Necrosis 誘導復合物[8-9]。通過RIP1/RIP3 復合體啟動下游的壞死性凋亡和炎性反應，復合體啟動因子TNF-α 及促神經炎癥因子IL-1β 的表達也明顯升高[10]。NEC-1 是RIP1 介導的NEC 特異抑制物，可抑制RIP3 表達，具有保護中樞神經細胞的作用，能減輕心腦血管缺血缺氧和缺血-再灌注的損傷程度[11-12]。前期研究發現，通過NEC-1 抑制RIP3 與RIP1 啟動的壞死性凋亡能明顯改善神經功能癥狀[3]。本實驗通過建立大鼠腦出血模型，經側腦室給藥NEC-1 干預后，腦組織中RIP1/RIP3、TNF-α 及IL-1β 表達明顯下調，明顯改善損傷皮質區神經元和星形膠質細胞狀態，減輕腦水腫，減少神經細胞凋亡，進一步發揮重要的神經保護作用。

綜上所述，NEC-1 通過抑制以RIP1/RIP3 為關鍵元件的下游因子，抑制TNF-α 及IL-1β 的表達，進一步減少神經細胞凋亡，具有顯著的保護作用，為腦出血后繼發性腦損傷的治療提供了新的思路。