荷斯坦公牛X和Y精子核形態差異及其影響因素分析

丁鳳玲，上官愛哨，周 揚，丁 瑞，孫 偉，李喜和，張淑君*

(1.華中農業大學 動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070；2.內蒙古賽科星繁育生物技術集團股份有限公司，呼和浩特 011517)

精子形態與受精能力、運動能力有關。射精中形態正常精子百分比的減少與其生育力降低有關[1-2]。在對伊比利亞鹿和公羊的研究中發現，頭小而細長的精子與快速運動密切相關，在高生育力雄性中更常見[3-4]。然而許多對精子的分析仍依賴于耗時和主觀的人工評分，缺乏準確性和可重復性，試驗操作人員之間的變異系數約為10%～80%，這限制了形態學評估作為精液質量預測指標的廣泛應用[5-7]。

利用家畜性別控制精子和人工授精極大地提高了畜牧業生產效率和經濟效益[8-10]。目前，流式分選在公牛精子性別分選中廣泛應用[11]，然而該技術仍存在精子受損較多和成本較高等不足之處[11-13]。研究還發現，流式分選可導致精子細胞膜磷脂紊亂[14]和蛋白質分布改變[15]等，從而使精子運動能力降低，頂體的完整性降低[16]。

精子的冷凍保存已成為繁殖、育種和保種的必要手段[17]。然而，隨著冷凍過程中溫度的急劇變化，細胞內發生了多種物理化學變化，嚴重損害精子質量和生育能力[18]。精子的結構和功能也都會受到冷凍的影響。細胞膜上的磷脂[19]和某些細胞骨架蛋白[20-21]的分布發生改變，鞭毛中與ATP代謝相關的蛋白質(HSP90)的豐度降低[22]。精子的遺傳物質在冷凍過程中也發生了改變[23-25]，包括DNA損傷和早期胚胎發育相關的精子mRNA轉錄活性下調[26]。冷凍保存還會誘導多種表觀遺傳變化，包括DNA甲基化水平增加和組蛋白修飾改變[27]。

哺乳動物X和Y精子的發生與成熟過程是相同的，但研究發現二者在DNA含量、運動能力等方面存在差異[28]。然而，荷斯坦公牛新鮮性控精子(X和Y精子)及其冷凍性控精子的核形態差異及其主要影響因素還不清楚。因此，本試驗擬分析性控X和Y精子核形態及其差異，研究流式分選和冷凍過程分別對公牛精子、性控X和Y精子核形態的影響，為流式分選、冷凍等精液生產技術的改進打下基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

1.1.1 主要儀器 SX型流式細胞儀(DakoCytomation，美國Fort Colllins公司)，移液槍(德國Eppendorf公司)，高速低溫離心機(德國Thermo centrifuge X3R公司)，電子天平(BL1500型，德國Sartorius公司)，低速離心機(F8AΦ6×30型，中國北京醫用離心機廠)，無菌操作臺(SW-CJ/2D型，中國江蘇凈化公司)，熒光顯微鏡(Ti2-U型，日本尼康)，數顯恒溫水浴鍋(中國常州諾基有限公司)。

1.1.2 主要試劑 Hoechst-33342(Sigma，St Louis，美國)；磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，GE Healthcare Life Sciences，美國)，4%多聚甲醛固定液，多聚賴氨酸(PDL)，DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)，抗熒光淬滅封片液，以上試劑均購于武漢碧云天生物技術公司。

1.2 精液處理及精子染色

于內蒙古賽科星繁育生物技術(集團)股份有限公司種公牛站選取15頭健康、年齡相當的種公牛。使用假陰道法采集精液樣本，原精送達實驗室后，將精液轉移到50 mL的離心管中，在室溫(18 ℃)下保存30～60 min。按照以下程序進行精子分離。首先，用Hoechst-33342熒光染料(106個精子用量為0.3 mmol·L-1)對1 mL精液進行染色，在35 ℃黑暗條件下孵育1 h；其次，將樣品通過30 mm尼龍網過濾器去除碎片及成團精子，在黑暗室溫下保持15 min；然后，使用高速SXXDP流式細胞儀分離精子。分離后的X精子的純度可達90%以上。將分離后的精液洗滌兩次(在PBS中20 ℃以700 r·min-1離心10 min)，去除上清保留精子沉淀。

精液冷凍步驟：將緩沖液(主要成分:檸檬酸鈉、蛋黃、果糖、甘油、青霉素、鏈霉素)加入精液樣品中，從25 ℃緩慢冷卻至4 ℃，在4 ℃中平衡4 h。隨后將試管精液在8 min內從4 ℃冷卻至-140 ℃，轉移到液氮罐中保存。冷凍樣品在液氮中保存約10 h后，在37 ℃水浴解凍30 s，然后進行活力檢測，確保每根吸管中的精子活力大于0.35。

制片步驟：取適量精液，加入1 mL預冷的PBS洗2次，1 500 r·min-1離心5 min，棄上清；加入4%多聚甲醛固定10 min；加入1 mL預冷的PBS洗2次，1 500 r·min-1離心5 min，棄上清；向EP管中加入PBS，使精子濃度為105個·mL-1，取100 μL精液涂于經多聚賴氨酸處理過的載玻片上，通風晾置數分鐘，不能干透；加入DAPI染精子核10 min；加抗熒光淬滅劑封片，隨后置于熒光顯微鏡下觀察。

1.3 精子核形態分析

使用熒光顯微鏡(尼康，日本)觀察載玻片上的精子(100×物鏡，3.3×目鏡)，視頻信號是通過安裝在顯微鏡上的Sony CCD AVC-D7CE攝像機(索尼，日本)獲取的。視頻幀采集卡的陣列大小為512×512×8位，可提供262 144個像素和256個灰度的數字化圖像。圖像的水平和垂直軸分辨率均為每像素0.083 μm。僅考慮不與其他細胞重疊的精子進行分析。每個樣本拍攝至少10個顯微鏡的視野，每個樣本至少包含300個精子核。為了減少主觀誤差，載玻片中精子的處理和拍攝均由同一個人完成。

利用Image J軟件的插件(Nuclear Morphology Analysis，version 1.15.0)分析精子圖像。測定和分析精子核形態的8個參數，包括4個描述精子核大小的參數以及4個描述精子核形狀的衍生參數。描述大小的主要參數是面積(A，area以μm2為單位，作為邊界內所有像素區域的總和)、周長(P，perimeter以μm為單位，作為外部邊界的總和)、最小直徑(W，width，以μm為單位，Feret直徑的最小值)和最大直徑(L，length，以μm為單位，Feret直徑的最大值)。4個描述精子核形狀的衍生參數為橢圓度(ellipticity, L/W)、圓度(circularity, 4×π×A/P2)，伸長度為(elongation,(L-W)/(L+W))和規則度(regularity, π×L×W/4×A)。

1.4 數據處理和統計分析

分析使用的軟件是“Nuclear Morphology Analysis”(version 1.15.0)及R軟件相關的數據處理工具。經過調試，設定的精子核面積大小范圍是3 000～5 000(單位為像素)，精子核橢圓度的大小范圍為0.70～0.85，從而剔除掉有重疊的精子。統計結果用“平均值±標準誤”表示。使用非參數檢驗——Mann-Whitney U檢驗，然后使用Bonferroni進行多重檢驗，校正后的P<0.05則認為具有顯著性差異。

2 結 果

2.1 公牛精子核形態圖像的信息

采集15頭荷斯坦公牛的精子，通過流式分選和冷凍分別獲得6種精子樣本共3.7萬個精子核圖像(圖1)。由于在每類精子中剔除了精子圖像數量較少的公牛，故每種精子樣本公牛頭數不等，如表1所示。

A.染色后熒光顯微鏡拍攝照片；B.同一張圖Image J軟件識別的精子圖像

2.2 性控X和Y精子核形態差異的比較

對12頭荷斯坦公牛(因精子核圖像較少刪除了3頭公牛)X和Y精子共7 950個精子核圖像的大小(面積、周長、長和寬)與形狀(橢圓度、圓度，伸長度和規則度)進行比較分析，從精子核大小的變化發現，12頭公牛中有4頭公牛(4/12)X和Y精子的核面積、周長、長度和寬度存在顯著性差異(圖2A)；比較精子核形狀的變化，4頭(4/12)公牛X和Y精子的核伸長度和圓度有顯著性差異，2頭(2/12)公牛的精子核規則度和橢圓度有顯著性差異(圖2B)。

A.精子核面積、周長、長度和寬度；B.精子核圓度、伸長度、橢圓度和規則度。X軸為牛的個體編號，X軸的最后一項為所測牛只的均值；Y軸為各項參數的“平均值±標準誤”

2.3 流式分選對牛精子核形態的影響

對流式分選前后11頭荷斯坦公牛的精子核形態進行比較，分析了約1.13萬個精子核圖像(表1)。流式分選前后精子純度如圖3所示。

A.分選后Y精子純度；B.分選后X精子純度

2.3.1 流式分選對精子核大小的影響 對11頭公牛的精子核面積、周長、長和寬4個參數在流式分選前后的平均值和標準誤進行統計分析(圖4)，結果發現流式分選對精子核大小具有顯著性影響，其中8頭(8/11)公牛的精子核面積、周長和長度在流式分選后發生顯著性變化，6頭(6/11)公牛的精子核寬度在分選后發生顯著性變化。

A.精子核面積；B.精子核周長；C.精子核長度；D.精子核寬度

2.3.2 流式分選對精子核形狀的影響 比較11頭公牛流式分選前后的精子核形狀(圖5)，11頭公牛中有5頭(5/11)公牛精子核橢圓度、伸長度和規則度發生顯著性變化，3頭(3/11)公牛精子核圓度發生顯著性變化。但是11頭公牛精子核形狀參數的平均值在流式分選前后差異不顯著。

A.精子核橢圓度；B.精子核伸長度；C.精子核規則度；D.精子核圓度

2.4 冷凍對牛精子核形態的影響

本試驗分析了冷凍對14頭荷斯坦公牛精子核形態的影響，此外，為了研究冷凍對性控X和Y精子核形態的影響是否有差異，本試驗對公牛冷凍前后的X和Y精子也進行了比較分析。

2.4.1 冷凍對精子核形態的影響 采集14頭公牛冷凍前后約1.1萬個精子核圖像，分析冷凍對精子核形態的影響。11頭(11/14)公牛的精子核面積和周長存在顯著性差異，9頭(9/14)公牛的精子核長度有顯著性差異，10頭(10/14)公牛的精子核寬度存在顯著性差異，冷凍后精子核大小相關的4個參數發生顯著性變化的公牛數量比例均大于50%(圖6A)。而精子核形狀相關的4個參數具有顯著性差異的公牛個體比例均少于50%，其中有5頭(5/14)公牛的精子核圓度有顯著性差異，6頭(6/14)公牛的精子核規則度、伸長度和橢圓度有顯著性差異(圖6B)。

A.精子大小，包括核面積、周長、長度和寬；B.精子形狀，包括核橢圓度、圓度、伸長度和規則度

2.4.2 冷凍對X和Y精子核形態的影響 為比較冷凍對分選的X和Y精子核形態的影響是否有差異，本研究比較了12頭公牛精子核大小和形狀在冷凍前后的變化，結果發現，Y精子冷凍后精子核大小發生顯著性變化的公牛數量(11/12)比X精子(5/12)多6頭。

與未冷凍的X精子相比，少于50%公牛的X精子核大小在冷凍后發生顯著改變，5頭(5/12)公牛的精子核面積、周長和寬度發生顯著變化，3頭(3/12)公牛的精子核長度發生了顯著變化。同時，少數公牛的精子核形狀發生變化，4頭(4/12)公牛的精子核橢圓度、伸長度和規則度發生顯著變化，所有公牛的精子核圓度都沒有顯著變化。然而，Y精子冷凍后，超過50%公牛的精子核大小發生顯著變化，11頭(11/12)公牛的精子核面積、周長和寬度發生顯著變化，9頭(9/12)公牛的精子核長度有顯著變化。少數公牛Y精子的核形狀發生變化，4頭公牛(4/12)的精子核橢圓度和伸長度發生顯著變化，7頭公牛(7/12)的精子核圓度和2頭(2/12)公牛的規則度發生顯著變化。

為了更直觀地顯示X和Y精子大小在冷凍過程中變化差異，以分析兩者抗凍性的差異，本研究計算出了12頭公牛Y與X精子核大小的冷凍前后的差值，統計分析每頭公牛X和Y精子核大小差異(包括面積、周長、長和寬4個參數)的總和，并將其繪制為圖7，從圖中可知，精子核面積和周長是X和Y精子核大小差異的主要原因。為了更準確地反映X和Y精子核面積和周長在冷凍過程中變化差異，本研究進一步統計分析了12頭公牛X和Y精子核面積和周長；冷凍前X和Y精子核大小具有顯著差異的只有4頭公牛，冷凍后精子核大小具有顯著性差異的公牛增加到了8頭，如表2所示。

表2 冷凍對公牛X和Y精子面積及周長的影響

A.新鮮的Y精子與X精子的差值；B.冷凍后Y精子與X精子的差值。藍色代表精子核面積，紅色代表周長，灰色代表精子核長度，黃色表示精子核寬度

3 討 論

為了獲得準確的研究結果，在文獻報道的不同物種X和Y精子核形態差異相關研究的基礎上，本研究特別采取了以下措施：1)采用較新的圖像處理插件Nuclear Morphology Analysis，能快速準確的采集和分析精子核二維圖像；2)對較多的精子樣本進行比較分析，為了比較荷斯坦公牛X和Y精子核形態及其差異，本研究采集了12頭公牛共7 950個精子圖像用于比較分析，大于現有研究報道的400～3 300個精子核圖像[29]；3)對精子核形態的8個參數進行了全面系統的比較分析，除了分析公牛X和Y精子核大小(精子核面積、周長、長度和寬度)的差異之外，還比較了其形狀(精子核圓度、橢圓度、伸長度和規則度)差異；4)在分析和統計方法上，不是直接比較12頭公牛X精子核的平均值與Y精子核的平均值的差異，本研究首先檢驗了數據的正態性和均方差性，發現精子核參數的分布不符合正態分布，所以選擇非參數檢驗——Mann-Whitney U檢驗，對同一頭牛的X和Y精子使用配對檢驗，然后使用Bonferroni進行多重檢驗，校正后的P<0.05認為具有顯著性差異。本研究在比較了12頭荷斯坦公牛X和Y精子核形態差異后，發現4頭公牛性控X和Y精子核大小及形狀存在顯著差異，但X和Y精子核形態具有顯著性差異的公牛數量比例(4/12)少于50%，12頭公牛性控X和Y精子形態相關參數的平均值不存在顯著性差異。因此，流式分選后的公牛X和Y精子核形態存在一定的差異，但是只有少數公牛的X和Y精子核形態存在顯著差異。

本研究分析了流式分選、冷凍2種因素對荷斯坦公牛精子核形態(大小和形狀)的影響，結果發現流式分選和冷凍對牛精子核大小具有顯著性影響，對核形狀的影響相對較小?，F有文獻只報道了冷凍顯著影響精子核大小[30]，沒有關于冷凍對精子核形狀影響的研究報道，有關流式分選對精子核大小和形狀影響的研究報道也不多。

通過比較流式分選前后11頭荷斯坦公牛的精子核形態，分析了約1.13萬個精子核圖像，結果顯示流式分選后的精子核大小和形狀都發生了變化，而精子核形狀發生顯著性變化的牛只數少于精子核大小發生顯著性變化的牛只數。此前在針對牛、小鼠和豬的研究中發現，流式分選過程可以導致分選的細胞發生明顯變化[31]，包括精子細胞膜磷脂紊亂[14]、蛋白質分布改變[15]等。在牛中，研究者發現流式分選的精子運動能力降低，精子頂體的完整性降低，這些都會影響精子的生育能力。原因可能是機械[32]和化學物質相關的流式分選過程會影響精子與輸卵管的結合[33]以及線粒體的完整性[34]，從而影響精子的運動能力和活力。

通過比較14頭荷斯坦公牛冷凍前后精子核形態(大小和形狀)的變化，發現冷凍后11頭(11/14)公牛精子核大小和6頭(6/14)公牛精子核形狀發生顯著變化。與流式分選對精子核形態的影響結果類似，相對于精子核大小的變化而言，精子核形狀的穩定性較高。除此之外，通過比較冷凍對X和Y精子核形態的差異影響，發現冷凍后Y精子核大小發生顯著性變化的公牛數量(11/12)比X精子(5/12)多6頭，在冷凍過程中Y精子核大小變化較大，以上結果顯示，冷凍對性控X和Y精子核大小影響存在顯著性差異?，F有研究認為，精子的抗冷凍性與多種因素有關，不同亞群的精子具有不同的運動、功能和形態特征[35]；能夠快速運動且頭部面積較小的精子亞群更能抵抗冷凍保存損傷。然而，由于用傳統的分子方法難以單獨分析存在于精液中的不同精子群，因此冷凍保存期間精子亞群之間存在差異的分子機制仍然不清楚，有研究者提出這些亞群之間的運動學和功能差異可能歸因于不同的蛋白質譜[36]。本研究發現，冷凍對Y精子核大小的影響大于對X精子的影響，推測X精子比Y精子具有更強的抗凍能力。目前還沒有關于X和Y精子抗凍能力差異的研究報道?，F有報道認為，冷凍過程中X和Y精子在運動性能和能量代謝通路等存在差異，如參與形成精子尾部骨架結構的蛋白、線粒體膜蛋白、參與能量代謝調節的糖酵解酶和鈣調素等存在差異[37-38]。冷凍導致精子活力和運動性能降低的原因主要有3個：1)冷凍過程中的氧化應激反應破壞線粒體活性，并損害軸突蛋白以及線粒體蛋白，從而使精子喪失運動能力[39]；2)冷凍過程改變了公牛精子中與氧化磷酸化和糖酵解相關酶的豐度和含量[40]，而這兩者是反芻動物細胞代謝產生ATP的主要過程；3)由于細胞骨架蛋白對溫度敏感，一些細胞骨架蛋白的豐度也會降低[41]。本研究認為，X和Y精子核大小對冷凍的抗性不同，推測X和Y精子在細胞骨架和能量代謝存在的差異以及冷凍過程對線粒體活性和ATP生成的不利影響可能是其部分影響因素。此外，本研究還發現，雖然性控X和Y精子形態相關參數的平均值不存在顯著性差異，但少數荷斯坦公牛(約1/3)X和Y精子核形態具有顯著性差異(P<0.05)，值得進一步研究。由于目前流式分選技術分選獲得的公牛X和Y精子準確率不能達到100%，本研究的結果還需要更多樣本和更準確的方法進行驗證。

4 結 論

本研究使用較新的圖像處理插件分析了15頭荷斯坦公牛約3.7萬個精子核的圖像，分析公牛X和Y精子核形態差異，流式分選和冷凍2種因素對公牛精子核形態的影響，以及冷凍對X和Y精子核形態的差異影響。明確了流式分選和冷凍對荷斯坦公牛精子核大小有顯著影響，冷凍對荷斯坦公牛Y精子核大小的影響程度高于X精子等，將為公牛精液冷凍、性控精子分選等技術的完善提供參考。