犬源牛犬細小病毒和犬圓環病毒二聯PCR檢測方法的建立及應用

于永樂，姚延珠，韓先杰，張傳美，秦志華，楊瑞梅，張洪亮，劉維全，單 虎*

(1.青島農業大學動物醫學院 山東省預防獸醫學重點實驗室，青島 266109；2.青島農業大學植物醫學學院，青島 266109；3.中國農業大學生物學院 農業生物技術國家重點實驗室，北京 100193)

犬源牛犬細小病毒(canine bocavirus, CBoV)屬于細小病毒科(Parvoviridae)、細小病毒亞科(Parvovirinae)、牛犬細小病毒屬(Bocaparvovirus)的成員，為單鏈線狀DNA病毒，CBoV的基因組大小約為5.4 kb，在結構蛋白和非結構蛋白編碼區之外存在第三個開放閱讀框，編碼NP蛋白[1-3]。目前，已經發現3種不同亞型的犬源牛犬細小病毒，即CBoV-1、CBoV-2和CBoV-3[4-7]。

犬圓環病毒(canine circovirus, CCV)屬于圓環病毒科(Circoviridae)、圓環病毒屬(Circovirus)的成員，基因組為環狀單鏈DNA，包含兩個大的開放閱讀框，其中，一個編碼Rep蛋白，另一個編碼Cap蛋白[8]。CCV往往導致腸炎、肺炎、壞死性血管炎等相關疾病，但是在健康犬的糞便中也發現了該病毒的存在，因此，迄今為止，對于CCV的致病機制尚不清楚[9]。

CBoV和CCV均可以導致犬腹瀉相關疾病，在我國已有多篇報道，但能同時檢測上述兩種病原的多重PCR檢測方法尚未見報道。本研究成功建立了可同時檢測CBoV和CCV的二聯PCR診斷方法，并對山東地區送檢的病料進行了實際驗證，證實了該方法的可靠性，可用于臨床樣品的快速篩查。

1 材料與方法

1.1 標準毒株及質粒

犬細小病毒2a亞型(canine parvovirus type 2a, CPV2a)CPV-QN5株、犬瘟熱病毒(canine distemper virus, CDV)CDV-QN1株及犬副流感病毒(canine parainfluenza virus, CPIV)CPIV-QN1株均由本實驗室分離、保存。

質粒：pMD-CBoV-NS1和pMD-CCV-Rep均由本實驗室構建、保存，將質粒濃度調整為30 ng·μL-1。

1.2 臨床病料

送檢的病料來自山東某地養殖場發病犬肛拭子，共計30份。按照1∶9的比例加入滅菌PBS緩沖液充分振蕩溶解，5 000 r·min-1離心5 min，取上清液保存備用。

1.3 主要試劑

D1000 plus DNA Ladder、2×primeSTAR Max Premix購自北京寶生物(TaKaRa)工程有限公司；QIAEX II膠回收試劑盒購自上海玉博生物科技公司；質粒小量快速提取試劑盒購自艾德萊生物科技有限公司。

1.4 二聯PCR引物設計與合成

根據GenBank中CBoVNS1基因和CCVRep基因序列，利用Primer Primier 5軟件，設計兩對二聯PCR引物，引物由青島志遠生物工程有限公司合成，引物序列：CBoV-P1(5′-GTGATGGGCGGTGACGGCTTGA-3′)，CBoV-P2：(5′-CTGGTAGA-CGCAGCCGATGAGA-3′)；CCV-P3(5′-GAAAA-TGGTGGGACGGTTACGAT-3′)，CCV-P4(5′-CAAAGTGAGACGCCGATAGAGGG-3′)；上述引物預期擴增目的片段大小分別為170(CBoV)和239 bp(CCV)。

1.5 病料DNA模板制備

分別將CBoV和CCV的臨床病料300 μL置于離心管中，沸水浴 10 min 后，迅速冰浴2 min，然后用微量離心機于室溫以 8 500 r·min-1離心6 min，吸取上清液用于后續PCR反應。

1.6 二聯PCR擴增方法的建立及優化

所有PCR反應總體積為25 μL,其中，2×primeSTAR Max Premix 12.5 μL，不同引物終濃度(0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 μmol·L-1)，質粒模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR條件為98 ℃預變性5 min；98 ℃變性10 s，不同退火溫度(52、54、56、58、60 ℃)退火10 s，72 ℃延伸10 s，30個循環；72 ℃延伸1 min。取6 μL PCR擴增產物在2.5%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，觀察并照相，確定其最適引物濃度和退火溫度，并對所有擴增產物進行膠回收，目的片段送公司測序驗證。

1.7 二聯PCR擴增試驗

在二聯PCR反應體系中，各病毒引物終濃度：CBoV 0.10 μmol·L-1、CCV 0.20 μmol·L-1。二聯PCR反應退火溫度確定為58 ℃，其他條件與“1.6”一致，分別對上述質粒模板進行檢測。

1.8 二聯PCR重復性、特異性和敏感性試驗

按照“1.7”的方法，進行二聯PCR重復性和特異性檢測。將CBoV與CCV質粒的10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6倍稀釋度的DNA模板組合，進行二聯PCR靈敏度檢測。

1.9 二聯PCR對送檢病料的檢測

以已建立的二聯PCR對送檢的30份病料進行檢測，并與單項PCR檢測結果進行比較分析。

2 結 果

2.1 二聯PCR擴增試驗

由圖1可知，應用優化后的最佳反應體系和條件，二聯PCR一次性成功擴增出170 bp(CBoV)和239 bp(CCV)的2條目的條帶(圖1)，經測序證實，所有擴增的片段與CBoV和CCV相應基因序列高度一致。

圖1 二聯PCR擴增結果

2.2 二聯PCR重復性、特異性和靈敏度

由圖2A可知，二聯PCR重復3次均可以獲得一致的擴增結果，而且與犬相關的3種病毒——CPV-2、CDV和CPIV檢測結果均為陰性，證明該方法具有很高的特異性(圖2B)；靈敏度試驗結果顯示，二聯PCR至少可檢出約3.0 pg DNA(圖2C)。

A～C.重復性、特異性和靈敏度試驗結果；M.DNA相對分子質量標準；ddH2O.陰性對照；10-1～10-6.稀釋度

2.3 二聯PCR對臨床病料的檢測

在30份送檢樣品中，應用二聯PCR方法進行檢測，結果如圖3所示，其中，CBoV陽性4份，CCV陽性3份。與單項PCR檢測結果完全一致(圖3)。

M.DNA相對分子質量標準；1～30.樣品；ddH2O.陰性對照；P.陽性對照

3 討 論

CBoV和CCV是導致犬腹瀉病的兩種重要病原體，在我國已有多篇報道，但目前對于兩種病毒的致病機制及流行情況尚不清楚，因此建立快速診斷方法，加強對兩種新發病原的檢測十分必要。陳意偉等[10]于2016年首先建立了CBoV的PCR檢測方法，曹亮等[11]于2017年建立了可同時檢測犬圓環病毒和犬細小病毒的雙重PCR檢測方法，以上研究對兩種病毒的流行情況均進行了詳細的描述。Niu(牛江婷)等[12]報道在1只貓糞便中檢測到CBoV的核酸，經比對分析發現貓源CBoV與犬源CBoV具有相同的基因結構，提示CBoV已經具有了跨物種傳播的能力，因此，加強對CBoV的流行病學監測十分必要。而且近年來CCV感染的報道也逐漸增多，從重慶[13]到黑龍江[14]均有不同程度病例出現，可見CCV流行范圍較廣。此外，一種新發病原豬圓環病毒3型(porcine circovirus 3，PCV 3)在犬的腹瀉及血清樣本中檢到[15]，提示在對犬臨床樣本檢測過程中，也要增加對PCV 3等跨宿主感染和傳播的病原進行檢測，才能獲得更加準確的研究結果。

隨著CBoV與CCV感染的病例不斷出現[7]，迫切需要更加快速、簡便的檢測方法用于臨床實際，而且國內尚未有CBoV和CCV二聯PCR檢測方法的報道，限制了對兩種新發犬腹瀉病的流行情況的監測。本研究在前人研究的基礎上，通過多重序列比對、反應體系及條件優化，經反復試驗后建立了更加簡便快捷的雙重PCR方法，其操作簡單，靈敏度更高，可完全滿足臨床檢測要求。

4 結 論

成功建立了可同時檢測犬源牛犬細小病毒(CBoV)和犬圓環病毒(CCV)的二聯PCR檢測方法，方法的最低檢測限度為3.0 pg總DNA，對犬細小病毒2型、犬瘟熱病毒和犬副流感病毒的檢測結果均為陰性。臨床樣品檢測顯示，可用于臨床犬腹瀉病的流行病學調查。