攜帶CRISPR/Cas9的重組腺聯病毒對偽狂犬病病毒感染小鼠的治療效應

李兆龍，張惠芳，豐志華，方 舟

(1.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所，福州 350013；2.福建師范大學南方生物醫學研究中心，福州 350015)

豬偽狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)是皰疹病毒科(Herpesviridae)皰疹病毒屬的一個重要成員[1]，宿主范圍較廣，可感染不同年齡的豬、牛、綿羊、犬、貓、水貂、雪貂、小鼠、大鼠、豚鼠等。豬偽狂犬病在我國生豬養殖中發病率較高。此外，不同日齡段豬感染后所表現的臨床癥狀不一樣，幼齡豬感染后死亡率接近70%，成年母豬主要表現為流產、死胎或產木乃伊胎兒等，公豬則主要表現為精子的活力低，或精子數量少等。該病無季節性，各個季節均會發生。目前，雖然我國成熟商品化疫苗多，但因病毒變異快，因此疫苗的預防效果總體不甚理想，生豬的野毒陽性率仍然較高，損失較為嚴重[2-4]。

PRV病毒粒子呈正二十面體，直徑為150～180 nm[5]。它的基因組較大，約為143 kb，編碼約80個蛋白。PRV毒性蛋白主要是糖蛋白gE、gD、gI以及胸苷激酶(TK)的基因協同控制，其中TK基因對PRV的增殖、復制、潛伏感染及激活有重要的作用，因此TK基因是PRV的主要毒性基因，常作為治療及開發疫苗的首選靶基因。而gE基因和gI結合在一起，促進病毒入侵宿主細胞，因此，控制入侵的源頭也非常關鍵。由L48基因編碼的被膜蛋白VP16，通過與宿主的細胞因子Oct-1和HCF-1結合從而激活立即早期基因IE180的轉錄和表達，進而調控一系列下游基因的表達和病毒的增殖，它在病毒復制及裝配中執行著非常重要的生物學功能[6-7]。因而，VP16也是基因靶向治療的關鍵所在。

CRISPR/Cas9系統是一個高效的基因編輯系統，能精確靶向編輯目的基因，已被廣泛應用于生命科學領域的研究[8]。它不僅對動物細胞、細菌和病毒能進行實時靶向編輯，而且能夠用于動物和部分人的胚胎基因編輯[9-10]。此外，CRISPR/Cas9系統對于遺傳性疾病的治療也有很好的應用前景，之前的研究證實該系統可用來治療亨廷頓氏病(huntingtin基因突變引起的疾病)的小鼠，矯正了嚴重聯合免疫缺陷病(severe combined immunodeficiency disease, SCID)的致病突變等[11-12]。

腺聯病毒(adeno-associated virus，AAV)是單鏈復制缺陷型DNA病毒，它的宿主范圍廣，能感染分化成熟的細胞和分化未成熟的細胞，也能轉導不同分裂期的細胞，被廣泛應用于疾病的基因治療和轉基因研究等[13]。目前，AAV轉導系統對于多種疾病的臨床試驗正在進行中，它很有可能成為世界上第一個上市的基因治療藥物載體。目前的研究表明，AAV的安全性高，通過加工后可口服，因此它是較為合適的基因治療載體[14-16]。

本研究利用重組腺聯病毒載體攜帶CRISPR/Cas9系統，靶向體內感染的PRV關鍵毒力基因TK和gE，以及復制關鍵點的VP16基因，從而在源頭削弱PRV的毒力，并通過破壞它的復制相關基因，從而達到抑制或減弱它復制能力，進而達到治療的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體和細胞 大腸桿菌DH5α感受態細胞來源于TaKaRa公司。pX601質粒為Addgene產品;AAV2/5質粒為Biovector公司產品；pHelper質粒為廣州華韻生物科技有限公司產品，相關圖譜見圖1。pXTK、pXgE、pXVP16質粒為本實驗室制備。293A細胞來源于上海紀寧生物科技有限公司，ST細胞為本實驗室保存，兩種細胞都是貼壁細胞，使用含10%血清的DMEM培養基；PRV(Fa，閩A株)株來自福建農林大學。

A.AAV2/5質粒；B.pHelper質粒；C.pX601質粒

1.1.2 實驗動物 140只20 g左右的BALB/c小鼠，購自吳氏動物中心。所有的動物試驗嚴格按照福建師范大學南方生物醫學研究中心的動物倫理相關規定執行(動物實驗倫理批準號：FJSU3568423)。

1.2 方法

1.2.1 CRISPR/Cas9-sgRNA敲除質粒的構建

1.2.1.1 sgRNA的設計與合成:從NCBI下載PRV的目標基因TK、gE和VP16序列，輸入sgRNA網站http://crispr.mit.edu/進行sgRNA的目標序列的設計，挑選合適的sgRNA由福州鉑尚生物公司合成(表1)。

表1 sgRNA引物

sgRNA合成后，加入PBS進行混勻，置于梯度PCR儀中進行退火，退火體系：Primer R 1 μL，Primer F 1 μL，10× PCR Buffer 2 μL，無菌水16 μL。退火反應條件：95 ℃，10 min，然后按2 ℃·s-1的速度讓退火溫度下降至85 ℃，接著又以0.25 ℃·s-1的速度降至25 ℃，最后以25 ℃維持1 min完成退火。將退火完成的sgRNA置于-20 ℃冰箱備用。

1.2.1.2 pX601質粒轉化：1 μL的pX601質粒(Amp抗性)加入100 μL DH5α感受態細胞，42 ℃恒溫熱刺激90 s，冰浴2～3 min；再加入800 μL LB液體培養基，置37 ℃ 250 r·min-1培養1 h；取出菌，按4 000 r·min-1離心5 min，棄801 μL上清，留100 μL進行重懸，均勻涂布在Amp平板上，37 ℃恒溫培養箱中12 h；隔日挑選單一的菌落，進行擴增，然后再PCR檢測，測序驗證。

1.2.1.3 pX601質粒的提取、酶切、純化及連接:按照康為世紀生物科技有限公司無內毒素質粒小提試劑盒說明書進行操作。用BbsⅠ限制性核酸內切酶切pX601質粒。酶切的反應條件：37 ℃ 10 min，65 ℃ 10 min。反應中各組分：Plasmid pX601 5 μg，10×Fast Digest buffer 5 μL，BbsⅠ 5 μL，去離子水40 μL。

用TaKaRa DNA frangment purification kit提取并純化酶切后的pX601質粒。接著用T4連接酶連接純化、酶切的pX601質粒和退火后的sgRNA，反應體系為25 μL，反應液中各組分：T4 DNA Ligase 1 μL，10×T4 DNA buffer 2.5 μL，Vector 50 ng，sgRNA 150 ng，去離子水 21.5 μL。連接時將混合液輕輕混勻，置于PCR儀中16 ℃，3 h最后65 ℃ 10 min。

1.2.1.4 重組質粒的轉化及驗證:將重組質料轉化至DH5α大腸桿菌中增殖，然后挑選單克隆進行增殖，然后應用PCR及測序驗證(引物見表2)。

表2 選定基因的驗證引物

1.2.2 重組腺聯病毒載體的包裝

1.2.2.1 重組腺聯病毒載體的驗證引物：根據pX601質粒序列設計引物RT-pX601，用于鑒定腺聯病毒的組裝，具體序列見表2驗證引物。

1.2.2.2 質粒轉染293A細胞和病毒的收集：將5×106·mL-1的 293A細胞均勻平鋪于15 cm的細胞培養皿中，待細胞貼壁且匯合度達70%～90%時，棄除舊培養液，加入無血清DMEM培養基；取3個EP管，分別加入135 μL的1 g·mL-1的PEI試劑和15 μg AAV2/5質粒、10 μg pHelper質粒，再分別加入20 μg pXTK、pXgE和pXVP16質粒，PEI和質粒量的總量比為3∶1，混勻后室溫靜置15 min；將含有3種混合質粒的PEI混合液加入到細胞培養基中，并輕搖混勻；做好標記，放入37 ℃、5%CO2的細胞培養箱內培養12 h；12 h后更換含10%胎牛血清的DMEM培養基，放入37 ℃、5% CO2的細胞培養箱內培養；24 h后收集細胞上清(含重組腺聯病毒)，做好標記存貯于4 ℃冰箱備用，并在細胞培養皿中加入新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養基；24 h后，將培養皿中的細胞連同培養基收集到45 mL離心管中，反復凍融，劇烈震蕩后3 000 r·min-1離心5 mim，取上清。

1.2.2.3 重組腺聯病毒的滴度測定：取10 μL濃縮后的AAV病毒液提取全基因組；以AAV病毒基因組和pX601質粒作為模板，Q-Cas9為引物，進行Real-time PCR；然后計算病毒拷貝數：首先計算出作為模板的0.15 ng pX601質粒的摩爾數，計算公式“摩爾數=總質量/分子量”[pX601是堿基數為7 447 bp的dsDNA平均分子量(MW)=(堿基數)×(660道爾頓/堿基)=7 447×660道爾頓，即7 447×660 g·mol-1，pX601摩爾數=0.15×10-9/(7 447×660)mol；0.15 ng pX601質粒的拷貝數=6.02×1023×0.15×10-9/(7 447×660)=1.84×107拷貝數]；然后根據real-time PCR結果，計算出3種重組腺聯病毒載體和pX601質粒表達Cas9的倍數比，將倍數乘以0.15 ng pX601質粒的拷貝數，得出AAV基因組的拷貝數；再根據模板AAV基因組占10 μL AAV的基因組的比值，計算出10 μL AAV的拷貝數。

1.2.2.4 重組腺聯病毒載體及功能驗證：重組腺聯病毒感染5×105·mL-1的ST細胞，24 h后收集細胞，按照TRIzol中的操作方法提取細胞總RNA，再應用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser進行反轉錄，接著應用RT-PCR檢測重組腺聯病毒中的Cas9、TK基因、gE和VP16的mRNA水平。

1.2.2.5 攜帶Cas9-TK-gE-VP16的編輯質粒轉染ST細胞：5×105·mL-1ST細胞均勻分布于6孔板中，細胞貼壁并長至匯合度80%時，棄去培養基，更換新鮮的無血清DMEM培養基；取1EP管，按PEI和質粒3∶1的質量比，分別加入2.5 μg質粒和1 g·mL-1的PEI 7.5 μL；將含有敲除質粒的PEI混合液加入到細胞培養基中，并輕輕搖晃混勻；做好標記，置37 ℃、5% CO2的細胞培養箱內培養12 h。

1.3 重組腺聯病毒系統在細胞水平對感染PRV的治療效果評估

1.3.1 重組腺聯病毒載體感染ST細胞 ST細胞以5×105·mL-1的濃度均勻鋪于6孔板中，等細胞貼壁并長至匯合度達80%時，棄去舊培養基，更換新鮮的無血清DMEM培養基；將攜帶3個不同片段的3種AAV(AAV-TK、AAV-gE、AAV-VP16)的稀釋，取部分AAV稀釋到109拷貝·mL-1；每種AAV濃度設置4個時間梯度，分別為感染ST細胞8、16、24、32 h(從加入PRV后開始計時)，每種AAV設置1個對照(只加AAV)，取108拷貝分別加入6孔板中混勻，并做好標記，置37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養12 h后換液加入PRV。

1.3.2 ST細胞形態變化觀察和收集 每到一個時間梯度時，在顯微鏡下觀察細胞狀態并拍照，做好標記，再進行細胞樣品收集和細胞總RNA的純化。

1.3.3 ST細胞中的PRV核酸拷貝數的變化情況 按PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser說明書進行反轉錄。應用Real-time PCR測定ST細胞中的PRV核酸拷貝數的變化情況，在MicroAmp?Fast 8-Tube Strip 0.1 mL 快速反應8聯管中配制反應混合液，反應條件為95 ℃ 20 s、95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s 結束。其中,95 ℃反應20 s為第一階段(稱為Hold Stage),第二階段為PCR Stage(即95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s)；最后一步為熔解曲線擴增階段(即95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s)。第二階段進行40個循環，退火溫度因不同基因而不同。每組做3個重復。根據Ct值進行數據處理。

反應體系設置為10 μL，各組分組成：前后引物各0.25 μL，模板 120 ng，SYBR? Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)ROX Plus 5 μL，DEPC水0.5 μL。

1.4 重組腺聯病毒編輯系統對感染PRV小鼠的治療效果評估

1.4.1 小鼠感染PRV半數致死量(LD50)的測定

1.4.1.1 Karber法計算PRV滴度：取10 μL病毒液進行梯度稀釋，每個梯度相差10倍體積，每個稀釋梯度為8個復孔。每隔24 h觀察細胞病變情況，連續觀察直至沒有新病變孔出現。然后統計陽性孔比例，根據公式lgTCID50=L-d(S-0.5)計算出PRV的滴度，L為最高稀釋度的對數，d為稀釋度對數之間的差，S為陽性孔比例總和。lgLD50=Xk-d(∑p-0.5)，Xk為最大劑量對數，∑p為各劑量組死亡率之和，d為稀釋度對數之間的差。

1.4.1.2 試驗分組設計：取30只BALB/c小鼠，分為6組,分別為1×106.5TCID50組、1×105.5TCID50組、1×104.5TCID50組、1×103.5TCID50組、1×102.5TCID50組及空白對照組?？瞻捉M注射DMEM，肌內注射，注射部位均為左后腿肌肉，注射體積為100 μL。每天記錄小鼠的存活情況。

1.4.2 治療試驗分組 取110只20 g左右的BALB/c小鼠，隨機平均分成兩大組：觀察組和試驗組，觀察組用于觀察小鼠的生理狀況和死亡統計，試驗組用于小鼠組織的采取。具體分組：100 μL DMEM+10 μL生理鹽水注射1次組，PRV注射1次組，AAV-TK注射治療1次組，AAV-gE注射治療1次組，AAV-VP16注射治療1次組，AAV-TK注射治療2次組，AAV-gE注射治療2次組，AAV-VP16注射治療2次組，AAV-TK注射治療3次組，AAV-gE注射治療3次組，AAV-VP16注射治療3次組，每組5只小鼠，共11組。其中PRV用肌內注射法(注射小鼠后腿內側)，注射量為5×104TCID50，只注射1次；AAV用尾靜脈注射法,每次注射109拷貝數，分注射1次、2次和3次組，多次注射組為隔天注射，表中PRV+AAV的注射次數指的是AAV的注射次數；DMEM和生理鹽水分別用肌內注射、尾靜脈注射。

1.4.3 小鼠生理狀態觀察 注射病毒后，每天記錄觀察組中各組小鼠的生理變化，包括小鼠的進食、精神狀態、瘙癢癥傷口面積、死亡數量和時間、觀察是否有特殊病理行為，并進行統計分析。

1.4.4 小鼠組織采取 在小鼠的腹腔注射250 μL的5%水合氯醛，麻醉小鼠，用200 mL的注射器裝滿DEPC水，連接4號半的輸液器針頭，在注射泵上固定；麻醉后解剖小鼠，剪開小鼠胸腔露出心，剪破右心耳，將針頭刺入心尖3～4 mm開始灌注，灌注約20 mL DEPC水時，灌注完成(直到小鼠耳部、趾部沒有血色)；取小鼠腦部及脾組織，并將其從小鼠身上剝離，將脾組織放入預備的做有相應標記EP管中，放入-80 ℃冰箱內冰凍(用于總RNA的純化)。

1.4.5 小鼠腦部組織總RNA純化 取小鼠腦組織5 g，放入1.5 mL EP管中，加入200 μL的TRIzol，研磨成組織漿液，再加入800 μL TRIzol，進行細胞總RNA的純化。

1.4.6 cDNA的合成 按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser說明書進行反轉錄。

1.4.7 Real-time PCR 具體試驗步驟參見cDNA的實時熒光定量PCR反應。

1.5 圖像分析和數據統計

試驗中測序結果用Mega 5.0和Bioedit軟件分析；RT-PCR結果用CorelDRAW軟件處理分析。

2 結 果

2.1 編輯質粒的驗證

將sgRNA連接到pX601質粒，經測序和生物學軟件Bioedit的比對證實, 目標序列的sgRNA成功構建針對PRV 3個關鍵基因的pX601編輯質粒(圖2)。

2.2 編輯質粒的功能驗證

為進一步驗證編輯質粒的靶基因序列，分別將pXTK、pXgE和pXVP16 3種編輯質粒轉染ST細胞12 h，后加入1×105TCID50的PRV，24 h后收集含PRV的細胞和上清，反復凍融3次，提PRV基因組DNA，進行PCR擴增并測序驗證。測序結果證實，PRV的病毒基因在靶基因位置出現了套疊峰，證實編輯質粒在PRV的TK、gE和VP16位置發生了剪切編輯(詳細的編輯效率之前文章已經驗證)[17]，具備剪切PRV的功能(圖3)。

圖3 3種剪切質粒對PRV剪切的測序驗證

2.3 評估重組腺聯病毒編輯系統在ST細胞模型中清除PRV

2.3.1 pT-IE180載體的構建 pT-IE180載體是本研究構建的含PRVIE180基因部分片段的TA克隆載體。用ExTaq酶擴增出PRVIE180基因目的片段，連接到pMD19-T上，目的片段大小為101 bp，測序結果如圖4，可以看出質粒載體上有約100 bp的序列與PRVIE180基因片段相同，圖中兩個不同的堿基是所用的PRV基因組參照系列的點突變。

圖4 PRV IE180基因組和T-IE180序列比對

2.3.2 重組腺聯病毒編輯系統對ST細胞中PRV拷貝數影響 ST細胞以5×105·mL-1的細胞濃度均勻鋪于6孔板中，在鋪板的同時分別加入1×108拷貝數的AAV-gE、AAV-TK和AAV-VP16，12 h后給細胞換液，并加入105TCID50的PRV處理細胞，在12、18、24 h 3個時間段收集細胞，并提取細胞RNA反轉錄成cDNA作為模板，用IE180和豬源管家基因GAPDH基因引物進行Real-time PCR，檢測不同時段細胞中病毒量的變化情況。如圖5所示，在12 h不同AAV處理過的細胞中PRV量相比于沒有處理過的細胞并沒明顯的減少，而18 h時，AAV-gE和AAV-VP16處理組，PRV的IE180的拷貝數明顯下降(P≤0.01)，但AAV-TK、AAV-gE和AAV-VP16 3組間的變化卻不明顯。24 h時，AAV-TK、AAV-gE和AAV-VP16處理組的PRVIE180的拷貝數出現更為顯著的下降(P≤0.001)。

**.P≤0.05; ***.P≤0.001

2.3.3 重組腺聯病毒編輯系統降低了PRV對ST細胞致病性 ST細胞以5×105·mL-1的細胞濃度均勻鋪于6孔板中，在鋪板的同時分別加入1×108拷貝數的AAV-gE、AAV-TK和AAV-VP16，12 h后給細胞換液，并加入105TCID50的PRV處理細胞，每到一個時間梯度時，在顯微鏡下觀察細胞狀態并拍照，做好標記，記錄細胞的形態變化，結果發現，與沒有處理過的細胞相比，12 h時不同AAV相關治療系統處理過的細胞的拉網、聚集及死亡現象明顯較少，細胞的病變整體較為輕微。

如圖6所示，在24 h時可以觀察到大部分對照細胞已經開始病變(變圓)，且可以觀察到漂在培養液中的死細胞，在40 h時，細胞培養液變渾濁，細胞全部死亡，AAV-gE、AAV-TK和AAV-VP16接種組相對較好。

圖6 重組腺聯病毒編輯系統降低了PRV對ST細胞致病性

2.4 重組腺聯病毒編輯系統降低了PRV在小鼠體內的增殖

2.4.1 小鼠感染PRV半數致死量的測定 觀察并記錄小鼠每天的存活情況，并進行了統計分析，如圖7，從圖中可以看出PRV對小鼠的半數致死量為103.5TCID50。

圖7 PRV對小鼠的半數致死量分析

2.4.2 重組腺聯病毒編輯系統對感染PRV后小鼠“偽狂犬瘙癢癥”影響 豬的PRV宿主范圍較廣，可感染不同年齡的豬、牛、綿羊、犬、貓、水貂、雪貂、小鼠、大鼠和豚鼠等。在不同種屬間表現的臨床癥狀往往不一樣，哺乳小豬或斷奶小豬感染該病毒后常表現為腹瀉或部分有神經癥狀。但小鼠感染該病毒則表現為明顯的瘙癢癥，尤其通過肌內注射進行感染試驗時，小鼠的瘙癢癥明顯。為了評估AAV攜帶的CRISPR系統對PRV的治療效果，本研究中記錄AAV攜帶的CRISPR系統對PRV的治療中各組小鼠的瘙癢癥狀，結果發現攻毒后注射1次的AAV-gE治療組小鼠有2只出現輕微的瘙癢癥狀(撓后腿)(表3，圖8b)，而注射2次的則出現1只，注射3次的小鼠并沒有出現明顯的搔癢癥(表3)。另外一組，AAV-VP16組，注射1、2、3次則分別出現3、2和1只(表3，圖8 d)。而AAV-TK治療組，出現搔癢癥小鼠較少，只在注射治療1次組出現1只搔癢癥小鼠(表3)，其他的小鼠則沒有明顯的搔癢癥表現。而對照組(未進行治療)的小鼠全部出現搔癢癥(圖8a)。

表3 重組腺聯病毒治療對小鼠“偽狂犬瘙癢癥”發生的影響

a.未注射AAV;b.注射AAV 1次；c.注射AAV 2次；d.注射AAV 3次

2.4.3 重組腺聯病毒編輯系統降低了PRV對小鼠致病性 經AAV-TK治療1次的PRV感染小鼠(圖9a)，100 h內，死亡5只，死亡時間推后約2 d(平均死亡時間46 h)，且存活2只小鼠；經AAV-TK治療2次的PRV感染小鼠則死亡4只，存活3只，且小鼠的死亡時間也是明顯推后(平均死亡時間82.5 h)；而治療3次的小鼠，則全部存活，在100 h的觀察時間內存活率最高，而且存活時間最長。AAV-VP16治療組中注射1次AAV-VP16的僅有1只存活，注射2次AAV-VP16有2只存活，注射3次AAV-VP16則有5只存活(圖9b)。通過AAV-gE治療發現，小鼠生存曲線如圖9c，從圖9c中可以看出AAV-gE注射2次的治療小鼠有2只小鼠存活，3次的則有6只存活，從圖9c中可以看出AAV-gE治療的小鼠存活狀況比不治療的小鼠情況略好些，在一定時間內存活率略大些，存活時間也更久。從圖9中可以看出AAV-TK、AAV-VP16和AAV-gE組注射3次的小鼠存活率均超過70%，其中AAV-TK組達到100%的存活(100 h)，這個結果說明3次注射效果比1次和2次都好，且以AAV-TK組小鼠療效最好。只進行AAV尾靜脈注射和注射DMEM與生理鹽水的小鼠全部存活，且很有活力，生理體征都正常。

a.AAV-TK; b.AAV-VP16; c.AAV-gE

2.4.4 重組腺聯病毒編輯系統對PRV感染小鼠的免疫器官的影響 AAV本身是DNA病毒，作為外源核酸病原體常引起小鼠的免疫應答作用，從而導致小鼠免疫器官的變化。為了評估重組腺聯病毒編輯系統是否對機體的免疫有上調作用，對注射不同次數腺病毒攜帶編輯質粒的小鼠進行麻醉，再用DEPC水對小鼠進行灌注，然后再取脾，拍照并測量比對，結果發現注射PRV的小鼠脾組織比只注射DMEM和生理鹽水的正常小鼠小，而只注射AAV的小鼠脾組織有些腫大。圖10a～c為相同注射次數的3種AAV治療小鼠脾組織的對比，可以看出用AAV-TK治療3次小鼠的脾大小和形狀最接近正常小鼠，而用AAV-gE和AAV-VP16治療的小鼠脾都有一定程度的萎縮，但是比單純注射PRV的小鼠好些，可見3種AAV對治療感染PRV的小鼠都有一定的療效，其中AAV-TK的治療效果最佳。圖10a～c分別為相同AAV不同注射次數的小鼠脾進行對比，從圖中可以看出，AAV-TK和AAV-gE注射2次時小鼠的脾大小和形狀最接近正常小鼠，而AAV-VP16注射3次時小鼠脾最接近正常小鼠(圖10c)。

a.注射AAV 1次；b.注射AAV 2次；c.注射AAV 3次

2.4.5 重組腺聯病毒編輯系統部分抑制PRV在小鼠腦組織中的復制 PRV是一種嗜神經病毒，感染后在腦部組織的分布較高，可作為發病的指征。此外，小鼠感染PRV后，常表現為典型搔癢癥，因而本研究通過檢測小鼠的腦部組織病毒的載量，來初步評估重組腺聯病毒編輯系統對PRV感染小鼠治療效果。用IE180引物和小鼠腦組織cDNA進行Real-time PCR。結果如圖11，經過重組腺聯病毒編輯系統治療的小鼠，腦組織中病毒的拷貝數都比對照組低(P≤0.01)。經過重組腺聯病毒編輯系統治療的小鼠2次和3次的小鼠腦組織的病毒的拷貝數顯著比對照組低(P≤0.001)。此外，AAV-TK注射3次的治療組腦部組PRV量比AAV-gE組還低(P≤0.05)。這個結果表明重組腺聯病毒編輯系統對小鼠腦部PRV的載量有下調作用，而AAV-TK組的降低效果最為明顯。

*.P≤0.05; P≤0.01; ***.P≤0.001

3 討 論

PRV感染在我國生豬養殖中較為普遍，且對生產影響較大。若要凈化PRV陽性豬群，只能通過嚴格篩查并及時淘汰[18-21]。但該方法操作繁瑣，代價高，并不適合當前生豬養殖。因而對于感染PRV的陽性豬及陽性豬場，采取有效的治療手段是當前降低生豬養殖虧損，促進生豬產業發展的迫切需求。本試驗中作者通過重組腺聯病毒載體轉運CRISPR/Cas9系統，進入PRV感染小鼠體內，剪切PRV的毒力基因TK和gE，以及復制相關基因VP16，以期減弱PRV的毒力和復制能力，乃至清除小鼠體內的病毒。據報道，CRISPR/Cas9系統不僅對動物細胞、細菌和病毒能進行實時靶向編輯，而且能夠用于動物和部分人的胚胎基因編輯。此外，CRISPR/Cas9系統還成功地治療亨廷頓氏病(huntingtin基因突變引起的疾病)的小鼠，矯正了嚴重聯合免疫缺陷病[11-12]。本試驗中作者利用重組腺聯病毒載體來轉運CRISPR/Cas9系統，明顯地減少了細胞和小鼠組織中PRVIE180的mRNA，抑制了PRV的復制和進一步的繁殖。隨著冶療次數增加，細胞病變減少。小鼠典型“偽狂犬搔癢癥”明顯減輕，一定時間小鼠的存活時間和存活率都獲得提高，這個結果與預期一致。

本研究應用偽狂犬病病毒IE180基因作為評估重組腺聯病毒載體編輯系統的治療效果，主要是因為之前有研究報道，偽狂犬病病毒只含一個立即早期基因，即IE180基因，該基因對病毒在動物體內的復制至關重要[22]，只有IE180基因開放轉錄，并翻譯成IE180蛋白,其下游的基因才能在IE180蛋白的激活作用下得以完全開放轉錄,否則病毒復制將不能完成。IE180基因的表達產物IE180蛋白是一個多功能蛋白，不僅能激活同源蛋白基因啟動子，而且能激活某些異源蛋白基因啟動子[23-26]。細胞試驗表明，IE180拷貝數低的處理組，其細胞的病變也較輕；通過評價感染PRV小鼠和治療組小鼠的存活率、存活時間以及體征，作者發現PRV的IE180較低組，其小鼠成活率較高，死亡率較低，小鼠出現搔癢癥的現象也明顯減少；防治效果和治療的次數成正比。這進一步證實，該小鼠模型的結果對當前陽性PRV豬的治療有一定的借鑒作用。

研究中還發現，雖然運載有三種重組CRISPR/Cas-sgRNA表達系統的AAV由于自身具有免疫原性，在一定程度上引起了小鼠機體內的免疫反應，但對小鼠并沒有致病性傷害，且對PRV感染小鼠有一定的治療效果。其中，AAV-TK和AAV-VP16治療組小鼠注射2次時的治療效果最好，AAV-gE治療組小鼠的治療效果較差。作者還對比了不同AAV注射不同次數治療小鼠的脾組織，發現PRV感染小鼠的脾出現嚴重萎縮，而經過AAV治療后的小鼠脾組織萎縮有明顯改善。

應用重組腺聯病毒載體運載CRISPR/Cas9系統治療PRV感染是可行的。AAV-TK和AAV-gE減弱PRV毒性，而AAV-VP16抑制PRV的復制，3種AAV治療PRV感染都有一定的效果。在3種AAV的治療結果中，注射3次AAV的治療比注射1和2次的效果好。由于小鼠試驗重復次數有限，體內評估標準尚且不明確，有可能和豬體內的效果不完全一致，因此該方法在豬的治療效果尚有待進一步研究。

4 結 論

重組腺聯病毒載體編輯系統用于感染PRV的ST細胞，能明顯減緩和減輕ST細胞病變；用于PRV感染小鼠，可降低感染小鼠的死亡率、延長存活時間，提高成活率，減輕搔癢癥，治療效果和治療次數成正比。