基于網絡藥理學和質量源于設計理念的梔子豉湯提取工藝研究

胡鐘姣，鄭露露，許光亞，郭曉恒，時 政*

基于網絡藥理學和質量源于設計理念的梔子豉湯提取工藝研究

胡鐘姣1, 2，鄭露露3，許光亞4，郭曉恒4，時 政1, 2*

1. 成都大學附屬醫院/臨床醫學院，四川 成都 610081 2. 遵義醫科大學藥學院，貴州 遵義 563000 3. 成都大學食品與生物工程學院，四川 成都 610106 4. 成都大學基礎醫學院，四川 成都 610106

采用網絡藥理學方法探討梔子豉湯治療失眠的作用機制；基于質量源于設計（quality by design，QbD）理念，構建并驗證梔子豉湯提取工藝的設計空間。通過TCMSP、PharmMapper、Drugbank、GeneCards、Therapeutic Target Database、OMIM等數據庫獲取梔子豉湯的成分和對應靶點；利用STRING、DAVID數據庫和分子對接技術對梔子豉湯治療失眠的潛在靶點進行分析。以梔子豉湯提取物中的梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、大豆苷元、染料木素的提取率及干膏得率作為關鍵質量屬性（critical quality attributes，CQAs），Plackett-Burman設計篩選關鍵工藝參數（critical process parameters，CPPs），Box-Behnken實驗對CPPs進行優化，并構建梔子豉湯提取工藝的設計空間。梔子豉湯的主要活性成分梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、大豆苷元、染料木素等，通過作用于白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin- 6，IL-6）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、一氧化氮合酶3（nitric oxide synthase 3，NOS3）等核心靶點，參與調節神經活性配體-受體相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、γ-氨基丁酸能突觸（GABAergic synapse）、TNF因子信號通路（TNF signaling pathway）等信號通路發揮治療失眠的作用。梔子豉湯提取工藝的設計空間范圍為溶劑用量8～11倍、提取時間為30～84 min，提取次數為1～2次。梔子豉湯可能通過多成分-多靶點-多通路治療失眠?；赒bD理念建立的梔子豉湯提取工藝設計空間，穩健可靠，可為其制劑的工藝開發提供參考。

梔子豉湯；網絡藥理學；失眠；分子對接；質量源于設計；設計空間；提取工藝；梔子苷；京尼平龍膽雙糖苷；大豆苷元；染料木素；白細胞介素-1β；白細胞介素-6；雌激素受體1；一氧化氮合酶3

梔子豉湯始載于東漢末年醫圣張仲景的《傷寒論》太陽、陽明篇，由梔子和淡豆豉2味中藥組成[1]。梔子，味苦性寒，入心、肺、三焦經，具有瀉火除煩的功效，尤其善瀉心火而除煩[2]?！侗静菡份d：“梔子，若用佐使，治有不同：加茵陳除濕熱黃疸，加豆豉除心火煩躁”。淡豆豉，味辛甘微苦性寒，歸肺、胃經，具有解表除煩、宣發郁熱的功效。其氣味輕薄，既能解表宣熱，載梔子上行，又能降胃和中，兩藥合用，共奏清宣胸中郁熱，古代用于治療虛煩不得眠，心中懊惱之癥[3]?，F代臨床主要用本方或加味治療失眠、抑郁、更年期綜合征、心血管疾病、胃脘疼痛等[4-5]，療效顯著。中藥具有多成分、多途徑和多靶點協同作用等特點，在預防和治療疾病方面有其獨特的優勢，但同時也對深入研究其治療疾病的作用機制帶來困難[6]。網絡藥理學是一門新興的學科，是在系統生物學與計算機技術高速發展的背景下發展起來的，其通過揭示中藥化合物的作用和治療機制來研究藥物、靶點和疾病之間的關系，闡明中藥對疾病的作用機制[7-9]。網絡藥理學的系統性質與中醫的整體觀點相一致，可以為研究中藥藥效物質基礎及作用機制提供新的、有益的技術支持，在一定程度上反映了中藥研究的新趨勢[10-12]。

質量源于設計（quality by design，QbD）是一種系統性研究方法，是通過實驗設計（design of experiment，DoE）來評價關鍵質量屬性（critical quality attributes，CQAs）和關鍵工藝參數（critical process parameters，CPPs）間的關系模型[13-14]。在多響應變量下，通過構建設計空間來確定最佳工藝參數范圍，從而建立穩定可靠的生產工藝，最終保障產品質量[15]。本研究通過網絡藥理學方法預測梔子豉湯治療失眠的活性成分、潛在作用靶點和作用機制，同時利用分子對接技術來進一步預測重要活性成分和潛在靶點的結合能力。此外，以QbD理念為指導，利用Plackett-Burman實驗設計，從多個影響因素中篩選影響梔子豉湯有效成分提取的CPPs，隨后用Box-Behnken實驗設計對篩選出的CPPs進行優化，建立梔子豉湯提取工藝的設計空間。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Essentia LC-16高效液相色譜儀，島津儀器（蘇州）有限公司；CP224C電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；十萬分之一天平，天津市德安特傳感技術有限公司；SB-5200DTD超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；JL-UPT-I I-10T實驗室超純水系統，四川金瀾科技有限公司。

1.2 試藥與試劑

對照品梔子苷（批號MUST-20102310，質量分數≥98%）、大豆苷元（批號MUST-20101107，質量分數≥98%）購自成都曼思特生物科技有限公司；京尼平龍膽雙糖苷（批號P27S10F96112，質量分 數≥98%）、染料木素（批號Y19D7C27145，質量分數≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司；乙腈，色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司；冰醋酸（色譜純）、甲醇（分析純），成都市科隆化學品有限公司；水為超純水。

梔子（批號20110206，產地江西）、淡豆豉（批號20110104，產地四川）均購自四川國強中藥飲片有限公司，經成都大學郭曉恒教授鑒定，分別為茜草科梔子屬植物梔子Ellis的干燥成熟果實、豆科豆屬植物大豆(L.) Merr.的干燥成熟種子（黑豆）的發酵加工品。

2 方法與結果

2.1 梔子豉湯網絡藥理學研究

2.1.1 梔子豉湯成分收集 通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/ tcmsp.php）和查閱相關文獻報道[16-17]對梔子豉湯中的成分進行整理、分析，得到梔子豉湯成分14個，結果如表1所示。

表1 梔子豉湯的成分信息

Table 1 Chemical composition information of ZD

來源成分PubChem CID分子式 梔子西紅花酸5281232C20H24O4 綠原酸1794427C16H18O9 京尼平442424C11H14O5 京尼平苷酸443354C16H22O10 西紅花苷I5281233C44H64O24 梔子苷107848C17H24O10 熊果酸64945C30H48O3 京尼平龍膽雙糖苷3082301C23H34O15 淡豆豉黃豆黃素5317750C16H12O5 大豆苷元5281708C15H10O4 染料木苷5281377C21H20O10 大豆苷107971C21H20O9 染料木素5280961C15H10O5 黃豆黃苷187808C22H22O10

2.1.2 靶點的預測與篩選 利用TCMSP平臺、PharmMapper數據庫（http://www.lilab-ecust.cn/ pharmmapper/）對成分靶點進行預測，使用UniProt網站（https://www.uniprot.org/）對靶點蛋白進行基因名轉換、校正。以失眠（insomnia、sleeplessness、wakefulness、agrypnia）為檢索詞，分別在數據庫Drugbank（https://www.drugbank.com/）、GeneCards（https://www.genecards.org/）、Therapeutic Target Database（http://db.idrblab.net/ttd/）、OMIM（https:// omim.org/）中進行檢索，合并并去除重復靶點，得到582個失眠相關靶點。利用微生信在線網站（http://www.bioinformatics.com.cn/）繪制成分靶點與失眠相關靶點韋恩圖，如圖1所示，得到51個梔子豉湯治療失眠的潛在作用靶點。

2.1.3 PPI網絡的構建 將得到的潛在靶點導入STRING數據庫（https://string-db.org/），選擇物種為Homo sapiens，得到靶點的PPI網絡信息，導入Cytoscape 3.7.1軟件構建網絡并進行拓撲分析。如圖2所示，該網絡涉及48個節點和223條邊，度值（degree）的中位數為5，介度中心度（betweenness centrality）的中位數為16.845 9，緊密中心度（closeness centrality）的中位數為22.725。在此PPI網絡中度值較高的靶點有白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6，度值24）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF，度值21）、一氧化氮合酶3（nitric oxide synthase 3，NOS3，度值18）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β，度值18）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1，度值17）。度值越高，表明與其他靶點的相互作用越強，對疾病的影響也就越大。故可推測梔子豉湯中的活性成分可能作用于上述靶點而發揮治療失眠的作用。

圖1 梔子豉湯靶成分靶點與失眠相關靶點韋恩圖

圖2 靶點蛋白相互作用網絡圖

2.1.4 基因本體（gene ontology，GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 將靶點導入DAVID數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）進行GO和KEGG富集分析，以＜0.05為篩選條件，得到相關分析結果。利用Bioinformatics（http:// www.bioinformatics.com.cn/）和Sangerbox（http:// sangerbox.com/index）在線網站分別對GO和KEGG結果進行可視化。GO分析表明，梔子豉湯可能通過絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）級聯的正向調節（positive regulation of MAPK cascade）、γ-氨基丁酸信號通路（γ- aminobutyric acid signaling pathway）、信號轉導（signal transduction）等生物過程發揮治療作用，結果見圖3。

圖3 潛在靶點的GO富集分析

KEGG富集通路分析表明，梔子豉湯中的活性成分可能通過神經活性配體-受體相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、γ-氨基丁酸能突觸（GABAergic synapse）、TNF因子信號通路（TNF signaling pathway）、MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）等通路發揮治療失眠的作用，見圖4。

2.1.5 分子對接驗證 靶點蛋白結構通過PDB數據庫（https://www.rcsb.org/）獲取，化合物3D結構通過PubChem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/）獲取。利用Pymol軟件刪除蛋白質分子中的無關小分子，并導入AutoDock Tools軟件進行刪除水分子、加氫及設置原子類型操作。用ChemBio3D軟件對化合物進行能量最小化，用AutoDock Tools軟件刪除水分子并添加原子電荷、分配原子類型。將處理后的化合物作為小分子配體，蛋白靶點作為受體，通過AutoDock vina軟件進行對接。如表2所示，梔子豉湯中的活性成分除熊果酸與ESR1外，其余成分與核心靶點的結合能均小于?5 kJ/mol，表明配體與受體可以自發結合。其中黃豆黃苷、大豆苷、西紅花酸、染料木苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、京尼平苷酸與所選核心靶點的結合性均優于陽性對照藥。梔子豉湯的主要活性成分與核心靶點的對接情況表明，梔子豉湯可能通過調節以上靶點發揮治療作用。

2.2 梔子豉湯活性成分含量測定方法的建立

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品梔子苷12.33 mg、京尼平龍膽雙糖苷10.03 mg、大豆苷元10.18 mg、染料木素11.51 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，分別精密移取上述對照品溶液適量，加甲醇稀釋成系列質量濃度的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密吸取梔子豉湯水提液1 mL，加甲醇定容至5 mL，搖勻，即得。

圖4 潛在靶點的KEGG通路富集分析

表2 活性成分與核心靶點的分子對接

Table 2 Molecular docking of the compound with target

成分結合能/(kJ?mol?1) IL-1βESR1IL-6NOS3TNF 京尼平苷酸?26.74?38.49?26.65?36.02?31.05 綠原酸?26.40?40.84?27.20?33.68?29.96 西紅花酸?30.75?44.10?26.53?37.28?31.71 大豆苷元?23.64?30.96?24.06?32.38?25.10 大豆苷?30.92?41.05?31.38?38.49?31.84 京尼平龍膽雙糖苷?28.28?39.71?30.12?42.84?36.61 京尼平?22.84?32.05?24.89?27.99?26.74 染料木素?24.39?31.59?27.20?33.39?25.82 染料木苷?28.45?42.26?25.65?37.40?32.26 大豆黃素?25.86?34.98?25.56?34.94?25.61 黃豆黃苷?31.80?41.17?29.62?38.45?31.59 熊果酸?25.65??25.52?35.44?31.05 梔子苷?27.57?39.12?26.90?38.49?31.71 地西泮?23.77?36.32?24.18?34.64?29.04

2.2.3 色譜條件

（1）梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷：色譜柱為Ecosil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（10∶90）；檢測波長239 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；體積流量1 mL/min。

（2）大豆苷元、染料木素：色譜柱為Ecosil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈- 1%冰醋酸水溶液（25∶75）；檢測波長260 nm；柱溫35 ℃；進樣量10 μL；體積流量1 mL/min。

2.2.4 專屬性實驗 精密量取“2.2.1”項下對照品溶液和“2.2.2”項下供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件測定。結果表明，供試品溶液中各組分的色譜峰分離良好，且在對照品溶液相同的保留時間處有相同的色譜峰，見圖5。

2.2.5 線性關系考察 分別精密吸取不同質量濃度的系列對照品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件測定峰面積。以對照品質量濃度為橫坐標（），峰面積為縱坐標（），繪制標準曲線，得到梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、大豆苷元、染料木素的回歸方程分別為＝15 871－6 007.6（＝0.999 7）、＝12 420＋32 753（＝0.999 6）、＝65 359－1 396.1（＝0.999 8）、＝89 274－2 331.7（＝0.999 6）。結果表明，梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、大豆苷元、染料木素分別在49.32～616.50、6.018～50.150、0.814 4～2.850 4、0.460 4～1.611 4 μg/mL線性關系良好。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，連續進樣6次，結果梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、大豆苷元、染料木素峰面積的RSD分別0.39%、0.35%、0.58%、1.55%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復性試驗 精密稱取樣品6份，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法制備，按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，結果梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、大豆苷元、染料木素提取率的RSD分別為3.18%、3.53%、1.07%、1.81%，表明該方法重復性良好。

圖5 混合對照品(A)和梔子豉湯樣品(B)的HPLC圖

2.2.8 穩定性試驗 精密稱取樣品，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法制備，分別在0、2、4、8、12、24 h按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，結果梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、大豆苷元、染料木素峰面積的RSD分別為0.14%、1.96%、0.98%、0.99%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.9 樣品測定及提取率計算 將“2.2.2”項下制備供試品溶液，按照“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，并參照文獻方法計算提取率[18]。

提取率＝各指標成分質量/總投藥量

2.3 干膏得率的測定

按干燥失重法進行測定，精密量取梔子豉湯提取液25 mL于干燥至恒定質量的蒸發皿中，水浴蒸干，于105 ℃電熱鼓風干燥箱中干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速稱定質量，再于105 ℃干燥1 h，冷卻稱定質量，反復干燥至恒定質量（即±0.3 mg），即得水溶性浸出物的干燥品，計算干膏得率。

干膏得率＝(25)

為25 mL提取液中干浸膏質量，為提取液總體積，為藥材質量

2.4 梔子豉湯提取工藝優化

2.4.1 CQAs和CPPs的確定 結合前期網絡藥理學相關結果、文獻研究熱度、具有一定藥理作用以及《中國藥典》2020年版對各味中藥指標性成分的規定，將梔子苷（1）、京尼平龍膽雙糖苷（2）、大豆苷元（3）、染料木素（4）提取率和干膏得率（5）作為梔子豉湯的CQAs。

Plackett-Burman設計法是一種經濟而有效的2水平實驗方法，可以通過較少的實驗快速從眾多實驗中篩選出顯著的影響因素，為后續的工藝優化提供支持。以浸泡時間（1）、溶劑用量（2）、提取時間（3）、提取次數（4）作為篩選因素。根據前期預實驗結果，利用Minitab 18軟件進行Plackett- Burman實驗設計，實驗設計安排及結果見表3。

分別以1～5對1～5進行線性回歸，得到回歸方程：1＝37.110－0.1831＋1.8852＋3.0943＋8.0134，2＝3.110 6－0.044 61＋0.120 12＋0.681 73＋1.396 74，3＝0.318 31－0.004 141＋0.022 262＋0.035 013＋0.110 224，4＝ 0.168 33－0.005 001＋0.013 332＋0.021 673＋0.065 004，5＝5.47＋0.005 081＋0.2542＋0.058 803＋4.9504。

對Plackett-Burman實驗結果進行方差分析，結果見表4。由表可知，浸泡時間1的值均大于0.05，表明其對1、2、3、4、5的影響不顯著，而溶劑用量2或提取時間3、提取次數4對1、2、3、4、5有顯著影響。結合標準化效應的pareto圖，見圖6，最終確定溶劑用量2、提取時間3、提取次數4為CPPs。

2.4.2 Box-Behnken優化提取工藝 根據Plackett- Burman實驗結果，以溶劑用量（2）、提取時間（3）、提取次數（4）為自變量，以梔子苷（1）、京尼平龍膽雙糖苷（2）、大豆苷元（3）、染料木素（4）、干膏得率（5）為響應值，對梔子豉湯提取工藝進行優化。利用軟件Design-Expert 12，設計3因素3水平實驗，實驗設計安排與結果見表5。

2.4.3 設計空間的建立及驗證 采用Matlab（2018b）軟件提供的Monte Carlo方法，其中計算步長為0.02，達標概率為0.9，模擬次數為1萬次[19]，計算得到梔子豉湯的設計空間，見圖7，隨機選取4個點進行驗證，每個實驗點平行2次，以提取液中梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、大豆苷元、染料木素的提取率和干膏得率的綜合評分為評價指標（綜合評分＝梔子苷提取率×30/最大梔子苷提取率＋京尼平龍膽雙糖苷提取率×20/最大京尼平龍膽雙糖苷提取率＋大豆苷元提取率×20/最大大豆苷元提取率＋染料木素提取率×20/最大染料木素提取率＋干膏得率×10/最大干膏得率）。其中1～4號為黃色區域內的點，5～8號為黃色區域外的點，實驗安排及結果見表6。由表6可知，黃色區域內工藝點的綜合評分優于黃色區域外工藝點的綜合評分，因此最終確定提取工藝的最優設計空間為溶劑用量8～11倍、提取時間為30～84 min，提取次數為1～2次。

表3 Plackett-Burman實驗設計與結果

Table 3 Experimental design and results of Plackett-Burman

編號X1/minX2/倍X3/minX4Y1/(mg?g?1)Y2/(mg?g?1)Y3/(mg?g?1)Y4/(mg?g?1)Y5/% 10890349.635.270.450.2428.48 201230130.111.420.210.1015.71 30830341.533.320.360.2023.98 460830123.851.170.170.0815.67 5601290137.492.320.260.1319.45 6601230344.484.160.390.2124.69 760890128.312.010.200.1016.96 801290347.685.560.500.2928.40 90830122.370.970.150.0713.31 1060890345.665.210.440.2428.10 11601230341.773.830.420.2225.60 1201290132.452.390.260.1418.75

表4 Plackett-Burman實驗設計方差分析結果

Table 4 Results of variance analysis of Plackett-Burman experimental design

來源Y1Y2Y3 平方和均方FP平方和均方FP平方和均方FP 模型928.499 0232.125 032.540 00.000 029.184 17.296 068.470 00.000 00.166 7 0.041 7185.660 00.000 0 X10.404 00.404 00.060 00.819 00.023 90.023 90.220 00.650 00.000 20.000 20.920 00.370 0 X242.661 042.661 05.980 00.044 00.173 10.173 11.620 00.243 00.006 00.005 926.490 00.001 0 X3114.855 0114.855 016.100 00.005 05.577 05.577 052.340 00.000 00.014 70.014 765.540 00.000 0 X4770.580 0770.580 0108.020 0 0.000 023.410 123.410 1 219.700 00.000 00.145 80.145 8649.680 00.000 0 誤差49.936 0 7.134 0 0.745 90.106 6 0.001 60.000 2 失擬項46.278 0 7.713 0 2.110 0 0.483 00.544 50.090 80.450 00.813 00.001 30.000 20.730 00.712 0 合計978.436 0 29.930 0 0.168 2 來源Y4Y5 平方和均方FP平方和均方FP 模型0.058 80.014 7128.550 00.000 0334.793 083.698 0115.240 00.000 0 X10.000 30.000 32.620 00.149 00.279 00.279 00.380 00.555 0 X20.002 10.002 118.670 00.003 03.091 03.091 04.260 00.078 0 X30.005 60.005 649.290 00.000 037.343 037.343 051.410 00.000 0 X40.050 70.050 7443.630 00.000 0294.081 0294.080 0404.890 00.000 0 誤差0.000 80.000 1 5.084 00.726 0 失擬項0.000 80.000 80.000 11.930 04.667 00.778 01.860 00.509 0 合計0.0596 339.878 0

圖6 標準化效應的pareto圖

3 討論

失眠屬中醫學“不寐”“不得眠”“目不瞑”等范疇，病因多與情志不遂、飲食不節、久病體虛等有關，病位主要在心，但與肝、膽、脾、胃、腎的陰陽氣血失調相關。目前臨床治療失眠的藥物有苯二氮類、非苯二氮類、有鎮靜作用的抗抑郁類、褪黑素受體激動劑類等，短期內，這些藥物能顯著改善睡眠，但長期使用容易對人體產生很多不利的影響，如地西泮，長期連續用藥可產生依賴性和成癮性[20-21]。梔子豉湯是臨床常用的治療失眠的經典方劑之一，由該方劑組成或衍生的多種方劑對治療各種類型的失眠均表現出較好的療效，但其藥效物質和作用機制仍不明確。

表5 實驗安排及結果

Table 5 Experimental arrangement and results

編號X2/倍X3/minX4Y1/(mg?g?1)Y2/(mg?g?1)Y3/(mg?g?1)Y4/(mg?g?1)Y5/% 18 (?1)90 (+1)2 (0)45.803.810.330.1925.22 212 (+1)90 (+1)2 (0)45.854.390.380.2225.85 38 (?1)30 (?1)2 (0)35.942.150.270.1519.81 48 (?1)60 (0)3 (+1)47.344.950.390.2326.48 512 (+1)30 (0)2 (0)38.602.380.290.1721.29 610 (0)30 (?1)3 (+1)42.603.300.370.2024.52 710 (0)90 (+1)3 (+1)49.725.500.430.2628.32 810 (0)60 (0)2 (0)42.153.500.340.2024.16 98 (?1)60 (0)1 (?1)27.521.650.160.0914.74 1010 (0)60 (0)2 (0)40.563.450.340.1923.66 1112 (+1)60 (0)3 (+1)45.434.650.450.2726.65 1210 (0)60 (0)2 (0)38.653.300.340.2023.14 1310 (0)60 (0)2 (0)37.143.430.340.1922.74 1410 (0)60 (0)2 (0)40.133.180.330.2023.84 1510 (0)30 (?1)1 (?1)23.211.140.170.0914.25 1612 (+1)60 (0)1 (?1)32.751.830.200.1117.74 1710 (0)90 (+1)1 (?1)32.512.510.210.1117.99

圖7 梔子豉湯提取工藝設計空間

本實驗采用網絡藥理學方法對梔子豉湯治療失眠的成分進行了預測，發現梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、京尼平苷酸、西紅花酸、大豆苷元、染料木素等可能是其發揮治療作用的活性成分。這些活性成分可能作用于IL-6、TNF、IL-1β、ESR1等核心靶標，繼而通過神經活性配體-受體相互作用、MAPK信號通路、環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號通路、γ-氨基丁酸能突觸、TNF因子信號通路等多條通路治療失眠?，F代藥理學研究表明梔子苷能顯著縮短實驗動物入睡時間，提高實驗動物入睡率[22]。但其余成分（如京尼平龍膽雙糖苷、京尼平苷酸、西紅花酸、大豆苷元、染料木素）在失眠中的作用仍缺少相關報道。失眠與炎癥息息相關，常伴隨炎癥因子IL-6、TNF、IL-1β表達的升高[23-24]，王丹等[25]研究發現失眠嚴重程度與IL-6呈正相關，而TNF?α對睡眠-覺醒行為存在特異性效應。p38 MAPK是MAPK信號通路的重要組成部分，p38 MAPK信號通路被激活后，促炎因子IL-1β、TNF-α的表達顯著升高，并伴隨明顯炎癥的反應，抑制p38 MAPK通過后炎癥因子的表達顯著下降[26-27]，因此梔子豉湯可能通過調控MAPK信號通路，抑制炎癥反應，從而治療失眠。ESR1通過影響空間記憶和突觸可塑性，起到神經保護作用[28]。cAMP被證實可通過蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）參與調節睡眠和晝夜節律，其可使慢波睡眠和總睡眠時間延長，同時縮短入睡潛伏期，具有明顯的促睡眠效應[29]。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是哺乳動物中樞神經系統中重要的抑制性神經遞質，對維持大腦網絡功能至關重要[30]。研究發現失眠患者中樞GABA水平明顯降低[31]。

表6 梔子豉湯提取工藝安排及驗證結果

Table 6 Extraction process arrangement and verification results of ZD

編號X2/倍X3/minX4Y1/(mg?g?1)Y2/(mg?g?1)Y3/(mg?g?1)Y4/(mg?g?1)Y5/%綜合評分 1960240.403.610.290.1624.0897.43 2960240.213.730.300.1724.2999.86 31061235.413.260.290.1723.2192.66 41061237.733.480.300.1624.1795.45 51130232.312.670.260.1520.9681.92 61130234.032.320.270.1521.1682.07 71145234.592.790.270.1522.5185.56 81145235.052.820.280.1622.4987.90

此外，本研究基于QbD理念，對梔子豉湯提取工藝進行研究，借助網絡藥理學相關結果、查閱文獻以及《中國藥典》2020年版對各味中藥指標性成分的規定，確定梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、大豆苷元、染料木素為梔子豉湯提取的CQAs，用Plackett-Burman實驗設計篩選出溶劑用量、提取時間和提取次數為梔子豉湯提取過程的CPPs，Box-Behnken實驗設計對提取工藝進行優化，運用 Monte Carlo法計算梔子豉湯提取工藝的設計空間，最終確定提取工藝最佳范圍：溶劑用量8～11倍，提取時間30～84 min，提取次數為1～2次。在設計空間的建立時，采用了達標概率法，通過設定可接受達標概率，建立確保成功概率的設計空間，工藝參數在設計空間內運行，能夠保證工藝評價指標達標[32]。本研究運用網絡藥理學和分子對接技術揭示了梔子豉湯治療失眠的活性成分、潛在靶點及通路，并通過分子對接技術對篩選出的核心靶點進行驗證?？梢酝茰y梔子豉湯中的活性成分可能通過作用于IL-6、TNF、IL-1β、ESR1等靶點，調控神經活性配體-受體相互作用、cAMP信號通路、γ-氨基丁酸能突觸、TNF因子信號通路等發揮治療失眠的作用，可為研究梔子豉湯治療失眠的分子機制提供思路。通過網絡藥理學方法和分子對接技術篩選出梔子豉湯的CQAs，運用QbD理念對梔子豉湯的提取工藝參數進行研究，建立設計空間，為該方的進一步開發提供了數據支持。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Chai C, Jin B, Yan Y Y,. Anti-depressant effect of Zhi-zi-chi Decoction on CUMS mice and elucidation of its signaling pathway [J]., 2021, 266: 113283.

[2] 滕俊, 張永生, 唐卓然. 《傷寒論》梔子豉湯治濕熱證議 [J]. 河南中醫, 2020, 40(3): 325-328.

[3] 康璐, 劉倩, 劉玉曄, 等. 梔子豉湯鎮靜催眠作用機制研究 [J]. 中國民間療法, 2020, 28(6): 82-84.

[4] 王紹政, 張欣怡. 《傷寒論》中梔子豉湯的作用及現代臨床意義 [J]. 養生保健指南, 2019(9): 232.

[5] Feng W, Dong Q J, Liu M Y,. Screening and identification of multiple constituents and their metabolites of Zhi-zi-chi decoction in rat urine and bile by ultra-high-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry [J]., 2017, 31(10): e3978.

[6] 龐會婷, 羅朵生, 郭姣. 三七化學成分分析及其抗炎機制的網絡藥理學探討 [J]. 中草藥, 2020, 51(21): 5538-5547.

[7] Wang K P, Miao X Y, Kong F H,. Integrating network pharmacology and experimental verification to explore the mechanism of effect of Zuojin Pills in pancreatic cancer treatment [J]., 2021, 15: 3749-3764.

[8] 劉濤, 趙靈麗, 鐘林江, 等. 基于網絡藥理學的復方當歸注射液作用機制研究 [J]. 成都大學學報: 自然科學版, 2020, 39(3): 225-229.

[9] 牛明, 張斯琴, 張博, 等.《網絡藥理學評價方法指南》解讀 [J]. 中草藥, 2021, 52(14): 4119-4129.

[10] Huang S, Chen Y, Pan L Y,. Exploration of the potential mechanism of Tao Hong Si Wu Decoction for the treatment of breast cancer based on network pharmacology andexperimental verification [J]., 2021, 11: 731522.

[11] Ding Z C, Xu F F, Sun Q D,. Exploring the mechanism of action of herbal medicine (Zecoction) for poststroke depression based on network pharmacology and molecular docking [J]., 2021, 2021: 2126967.

[12] 王哲義, 孫懌澤, 劉碧原, 等. 基于網絡藥理學和分子對接技術探討丹參治療缺血性腦卒中的作用機制 [J]. 藥物評價研究, 2021, 44(2): 344-355.

[13] 丁瑞雪, 何雁, 田香, 等. 基于質量源于設計理念的地格達-4味湯提取工藝研究 [J]. 中國中藥雜志, 2019, 44(13): 2799-2805.

[14] 戴勝云, 徐冰, 張毅, 等. 質量源于設計(QbD)在藥物分析方法開發中的應用研究進展 [J]. 藥物分析雜志, 2016, 36(6): 950-960.

[15] 姜慧潔, 黃薇, 胡林水, 等. 基于質量源于設計(QbD)理念的延胡索醇提工藝質量控制研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(2): 372-380.

[16] 吳丹, 高耀, 向歡, 等. 基于網絡藥理學的梔子豉湯抗抑郁作用機制研究 [J]. 中草藥, 2018, 49(7): 1594-1602.

[17] Zhang Y, Luo Y S, Zhang D Q,. Predicting a potential link to antidepressant effect: Neuroprotection of Zhi-zi-chi Decoction on glutamate-induced cytotoxicity in PC12 cells [J]., 2021, 11: 625108.

[18] 楊艷玲, 李花花, 黃嘉怡, 等. 基于質量源于設計（QbD）理念的經典名方桃紅四物湯的提取工藝研究 [J]. 中草藥, 2022, 53(2): 403-412.

[19] 劉博文, 戴靜, 劉曉鳳, 等. 基于網絡藥理學和設計空間的乳腺康提取工藝研究 [J]. 中草藥, 2021, 52(6): 1634-1644.

[20] Yamato K, Inada K, Enomoto M,. Patterns of hypnotic prescribing for residual insomnia and recurrence of major depressive disorder: a retrospective cohort study using a Japanese health insurance claims database [J]., 2021, 21(1): 40.

[21] Riemann D, Nissen C, Palagini L,. The neurobiology, investigation, and treatment of chronic insomnia [J]., 2015, 14(5): 547-558.

[22] 李智欣, 肖韋華, 何計國, 等. 梔子中改善睡眠成分的研究 [J]. 農產品加工: 學刊, 2006(8): 79-80.

[23] Xia L, Zhang P, Niu J W,. Relationships between a range of inflammatory biomarkers and subjective sleep quality in chronic insomnia patients: A clinical study [J]., 2021, 13: 1419-1428.

[24] Ren X J, Wang Q Q, Zhang X P,. Establishment of a rat model with ageing insomnia induced by-galactosef and para-chlorophenylalanine [J]., 2020, 20(4): 3228-3236.

[25] 王丹, 鐘建國. 基于“多感官刺激”理論的中醫綜合康復方案對老年缺血性腦卒中后失眠患者睡眠功能的影響 [J]. 實用醫學雜志, 2021, 37(12): 1619-1625.

[26] 盛蕾, 劉元月, 胡丹, 等. 柴胡疏肝散治療卒中后抑郁的網絡藥理學研究 [J]. 中草藥, 2018, 49(15): 3509-3515.

[27] 姚晶晶, 陳嵐, 劉東戈. 炎性因子與阿爾茨海默病發病關系 [J]. 中國神經免疫學和神經病學雜志, 2008, 15(3): 218-220.

[28] 李建民, 陳長香, 趙雅寧, 等. 大鼠睡眠剝奪與p38MAPK信號通路的相關性研究 [J]. 現代預防醫學, 2011, 38(16): 3270-3272.

[29] 李璟怡, 黃俊山, 陳沁, 等. 松郁安神方對失眠大鼠海馬cAMP/PKA信號通路的影響 [J]. 北京中醫藥大學學報, 2020, 43(3): 212-217.

[30] Zhang X, Liu Y, Hong X Q,. NG2 g-derived GABA release tunes inhibitory synapses and contributes to stress-induced anxiety [J]., 2021, 12(1): 5740.

[31] 周揚, 郭冷秋, 劉遜, 等. 基于網絡藥理學、分子對接和實驗驗證探討朱茯苓用于失眠的作用機制 [J]. 天然產物研究與開發, 2021, 33(1): 114-126.

[32] 邵靜媛, 瞿海斌, 龔行楚. 2種設計空間計算方法的比較研究——達標概率法和多指標疊加法 [J]. 中國中藥雜志, 2018, 43(10): 2074-2080.

Research on extraction process of Zhizichi Decoction based on network pharmacology and quality by design concept

HU Zhong-jiao1, 2, ZHENG Lu-lu3, XU Guang-ya4, GUO Xiao-heng4, SHI Zheng1, 2

1. Affiliated Hospital / Clinical Medical College of Chengdu University, Chengdu 610081, China 2. School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, China 3. College of Food and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China 4. School of Preclinical Medicine, Chengdu University, Chengdu 610106, China

In the present study, we applied network pharmacology to explore the molecular mechanism of Zhizichi Decoction (ZD) in insomnia treatment. To establish and validate the design space for the extraction process of ZD based on the concept of quality by design (QbD).Firstly, the components and corresponding targets of ZD were obtained from TCMSP, PharmMapper, Drugbank, GeneCards, Therapeutic Target Database and OMIM databases. Then, STRING, DAVID database and molecular docking technology were used to analyze potential targets of ZD in the treatment of insomnia. With the extraction yield of geniposide, genipin-1-β--gentiobioside, daidzein, genistein and dry extract yield as critical quality attributes (CQAs). Subsequently, the Placket-Burman experiment design was used to select the critical process parameters (CPPs). The Box-Behnken experiment design was used to optimize the extraction process, and the design space of the ZD extraction process was established.The main active components of ZD, such as geniposide, genipin-1-β--gentiobioside, daidzein and genistein, through acting on the core targets of interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), estrogen receptor 1 (ESR1), nitric oxide synthase 3 (NOS3), and involved in the regulation of neuroactive ligand-receptor interaction, GABAergic synapse, TNF signaling pathway, thereby treating insomnia. The design space of extraction technology of ZD was as follows: The amount of solvent was 8—11 times, the extraction time was 30—84 min, and the number of extraction was 1—2 times.ZD may treat insomnia through multiple components, multiple targets and multiple pathways. The design space of extraction process of ZD based on QbD concept was robust and reliable, which would provide reference for the process development of its formulations.

Zhizichi Decoction; network pharmacology; insomnia; molecular docking; quality by design; design space; extraction process; geniposide; genipin-1-β--gentiobioside; daidzein; genistein; interleukin-1β; interleukin- 6; estrogen receptor 1; nitric oxide synthase 3

R284.2

A

0253 - 2670(2022)07 - 1973 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.07.006

2021-10-11

國家自然科學基金項目（81803561）；四川省科技計劃項目（2020YJ04087）；四川省中醫藥管理局科研專項課題（2021MS189）；成都市金牛區醫學會科研課題（JNKY2021-06）；成都大學附屬醫院院級課題（Y2021006）；成都市醫學科研課題（2021070）；龍泉驛英才計劃C類創新人才計劃；四川省科技廳農業科技成果轉化資金項目（22NZZH0031）

胡鐘姣（1994—），女，碩士研究生，研究方向為臨床藥學。Tel: 15761639978 E-mail: huzhongjiao219@163.com

時 政，碩士生導師，教授，主要從事中藥新藥研發及中藥質量標準研究。E-mail: drshiz1002@hotmail.com

[責任編輯 鄭禮勝]