僵蠶溶繭酶抑制劑的純化與抗腫瘤活性研究

王厚偉，徐凌川，王家超，曾英姿，田景振，竇彥玲，王 飛

僵蠶溶繭酶抑制劑的純化與抗腫瘤活性研究

王厚偉1，徐凌川1，王家超3，曾英姿4，田景振1，竇彥玲2*，王 飛5

1. 山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355 2. 山東中醫藥大學智能與信息工程學院，山東 濟南 250355 3. 河北醫科大學基礎醫學院，河北 石家莊 050017 4. 山東沃華醫藥科技有限公司，山東 濰坊 261061 5. 御華景宸（山東）康養發展集團有限公司，山東 濟南 250000

分離純化僵蠶溶繭酶抑制劑（Jiangcan cocoonase inhibitor，JCCI），研究其體內外對人肝癌SMCC-7721細胞增殖的抑制活性。依次應用以家蠶溶繭酶為配體的親和色譜、Sephadex G-50凝膠過濾色譜、Superdex 75快速蛋白液相色譜（fast protein liquid chromatography，FPLC），從僵蠶粗蛋白提取物的85%硫酸銨沉淀物中分離純化JCCI。以Edman降解法測其端氨基酸序列。應用MTT法與荷瘤裸鼠模型，檢測其體內外抑制SMCC-7721細胞增殖與生長活性。JCCI相對分子質量為13 973.63，其端前10個氨基酸序列為VRNKRQSNDD。抑制劑動力學分析結果表明，JCCI是溶繭酶的非競爭性抑制劑，米氏常數（m）平均值為76.50，二者物質的量之比為1∶1。JCCI可顯著抑制SMCC-7721肝癌細胞體外增殖與體內荷瘤裸鼠的腫瘤生長，體外給藥36 h的半數抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）為260.52 μg/mL，JCCI抑制率與劑量線性相關。JCCI是一種首次從僵蠶中分離純化的具有抗腫瘤活性的絲氨酸蛋白酶抑制劑。

僵蠶；溶繭酶；絲氨酸蛋白酶抑制劑；抗腫瘤活性；肝癌；親和色譜；荷瘤裸鼠；MTT法

僵蠶是蠶蛾科昆蟲家蠶Linnaeus 4～5齡的幼蟲感染白僵菌(Bals.) Vuillant而致死的干燥體，被列入《中國藥典》2020年版，具有息風止痙、祛風止痛、化痰散結等功效[1]。僵蠶單獨或與其他中藥配伍用于治療多種腫瘤疾病[2]。在我國的一些地區僵蠶作為一種民間藥用于治療癌癥[3]。關于僵蠶的抗腫瘤作用已有一些文獻報道。僵蠶水煎煮提取物對小鼠肉瘤S180細胞[4]、小鼠艾氏腹水瘤細胞以及人肝癌細胞體外增殖有抑制作用[5]；ig僵蠶水煎劑，制備大鼠含藥血清，該血清能抑制肝癌Hepa1-6細胞體外增殖與侵襲[6]；僵蠶乙醇提物對體外培養的HeLa細胞增殖具顯著抑制作用[7]；僵蠶中麥角甾醇、β-谷甾醇、棕櫚酸3種成分具有抑制小鼠黑素瘤B16-F10細胞和人黑色素瘤A375細胞增殖活性[8]。

絲氨酸蛋白酶抑制劑廣泛存在于動植物體內，在醫學領域作為一類有前景的癌癥治療候選藥物已得到普遍認可[9-10]。腫瘤細胞外基質中絲氨酸蛋白酶活性與腫瘤浸潤和轉移密切相關[11]。一些文獻報道了絲氨酸蛋白酶抑制劑抑制腫瘤細胞的浸潤和轉移作用[12-16]。人肝癌細胞膜上存在絲氨酸蛋白酶抑制劑受體，抑制劑與之結合能夠調節基質絲氨酸蛋白酶的活性，抑制蛋白酶對基質蛋白的分解作用，修復細胞屏障，阻斷腫瘤細胞的浸潤和轉移[17-18]。

家蠶溶繭酶是家蠶蛹羽化成蛾后由蠶蛾的下顎合成分泌的一種絲氨酸蛋白酶，用于溶解繭絲，在封閉的繭殼上形成羽化孔，以幫助蠶蛾脫繭而出。本課題組前期已完成了家蠶蛾溶繭酶（GenBank：BAJ46146.1）的分離純化及其基因的克隆與表達[19]。本研究擬應用以家蠶蛾溶繭酶為配體的親和色譜技術作為主要分離手段，從僵蠶水提取物中分離純化小相對分子質量絲氨酸蛋白酶抑制劑，研究抑制劑的理化性質、酶學特性及其體內、外抑制人肝癌SMCC-7721細胞增殖活性，分析它的絲氨酸蛋白酶抑制活性與抗腫瘤活性的關系與機制。迄今為止，僵蠶小相對分子質量蛋白組分的抗腫瘤活性未見報道，本研究為白僵蠶在中醫臨床上用于腫瘤性疾病的治療，以及應用僵蠶溶繭酶抑制劑（Jiangcan cocoonase inhibitor，JCCI）治療肝癌提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

H1850R高速冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司），FD-1D-80冷凍干燥機（上海比朗儀器制造有限公司），快速蛋白質液相色譜儀（?KTA Pure，GE醫療生命科學），4800 Plus MALDI TOF/TOFTMAnalyzer、ABI 491A氨基酸測序儀（應用生物系統公司，美國），3550酶標儀 [伯樂生命醫學產品（上海）有限公司，美國]。

1.2 實驗動物

無特定病原體的BALB/c裸鼠由山東中醫藥大學實驗動物中心（濟南，中國）提供，質量合格許可證編號：SYXK（魯）2017-0022。本研究嚴格按照國家衛生研究院實驗動物護理和使用指南（2015年，第9版）中的建議進行?！秳游锸褂梅桨浮方浬綎|中醫藥大學（濟南）動物管理與使用委員會審定（批準號SDUTCM20200303002）。

白僵蠶是根據《中國藥典》2020年版一部的炮制規范由本實驗室專門制備。應用純種白僵菌株(Bals.) Vuillant（山東中醫藥大學徐凌川教授鑒定）感染第4齡第2天的家蠶，家蠶品種為“菁松”ד皓月”的一代雜交種，常規桑葉育，收集病死的尸體，于烘箱中40 ℃干燥制得。

1.3 材料

SMCC-7721細胞（中國科學院生物化學與細胞生物學研究所），DMEM培養基、胎牛血清、氨芐青霉素、鏈霉素（Gibco-BRL），牛血清白蛋白（默克西格瑪公司，美國），CNBr-active Sepharose CL-4B、Sephadex G-50、Superdex 75 Increase 10/300 G L（法瑪西亞公司，瑞典），α-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA，默克西格瑪公司，美國），-苯甲酰--精氨酸對硝基苯酰胺鹽酸鹽（BApNA，默克西格瑪公司），Ultra-46K（默克密理博公司），MTT（默克西格瑪公司），SPSS13.0軟件（SPSS，Inc.，美國）。

2 方法

2.1 JCCI的提取與分離

2.1.1 JCCI的提取 取適量新制備的白僵蠶粉加入10倍體積的提取緩沖液（50.00 mmol/L，pH 8.0，Tris-HCl緩沖液），勻漿提取，離心（10 000 r/min，10 min），收集上清液。沉淀物重復提取2次，合并3次上清液，冷凍干燥，得白僵蠶粗蛋白凍干粉，稱定質量，備用。

2.1.2 JCCI的硫酸銨分步鹽析法分離 取適量上述白僵蠶凍干粉溶于適量的提取緩沖溶液中，離心（10 000 r/min、10 min），收集上清液，緩慢加入硫酸銨調節飽和度至25%，25 ℃下溫和攪拌30 min，離心（10 000 r/min、10 min），收集沉淀物，得25%飽和度的硫酸銨沉淀。上清液重復以上操作，得55%、85%飽和度的硫酸銨沉淀。各沉淀物于4 ℃下透析36 h，離心（10 000 r/min、10 min），上清液冷凍干燥，測溶繭酶抑制活性。具有最高溶繭酶抑制活性的硫酸銨沉淀物凍干粉即為JCCI。

2.2 蛋白質含量測定

使用Lowry蛋白質測定方法[20]，用牛血清白蛋白作為標準品測定蛋白質含量。

2.3 JCCI的抑制活性分析

參照文獻方法[21]，溶繭酶屬類胰蛋白酶，以-苯甲酰--精氨酸對硝基苯酰胺鹽酸鹽（BApNA）為底物，檢測JCCI對溶繭酶的抑制活性。應用反應緩沖液（50.00 mmol/L、pH 8.0、Tris HCl，10.00 mmol/L CaCl2）配制14.00、28.00、42.00、56.00、70.00、84.00、98.00 μg/mL系列質量濃度JCCI溶液（相當于1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00 nmol/mL）。取1.00 mL各濃度JCCI溶液，分別與2.00 mL溶繭酶溶液（2.50 nmol/mL）混合，37 ?C保溫10 min后加入100 μL BApNA溶液（10.00 mmol/L），繼續37 ℃保溫5 min后，用0.40 mL 33%乙酸溶液終止反應，測410 nm吸光度（410）值。對照組以相同體積的反應緩沖液代替抑制劑樣品溶液。1個溶繭酶的酶活力單位定義為使410值增加0.01所需酶的物質的量，1個JCCI抑制活力單位則為使410值降低0.01所需抑制劑的物質的量。

2.4 親和色譜

2.4.1 親和配體的制備 選擇家蠶溶繭酶作為親和色譜的配體。溶繭酶是家蠶蛾在羽化的過程中分泌的一種絲氨酸蛋白水解酶，用于水解蠶繭先端形成羽化孔，使蠶蛾脫繭而出，參照文獻方法[19]純化制備溶繭酶配體。

2.4.2 親和載體的制備 根據制造商說明書（2018版），將CNBr活化的Sepharose CL-4B與適量的溶繭酶偶聯，制成親和載體。

2.4.3 親和色譜 適量粗JCCI溶于適量平衡緩沖溶液（50.00 mmol/L、pH 8.0、Tris HCl）中，4 ℃離心（10 000 r/min、10 min），上清液加樣于親和色譜柱（20.00 cm×1.60 cm，柱體積約35.00 mL，柱床高17.00 cm），37 ℃保溫1 h，依次用含1.00 mol/L NaCl的平衡緩沖液、蒸餾水、氯化氫溶液（pH 2.4）洗柱，收集洗脫液，用Tris堿（2.00 mol/L）中和，重復加樣，合并Tris堿中和液，透析，凍干。

2.5 凝膠過濾色譜

親和色譜凍干粉以適量洗脫液（50.00 mmol/L Tris HCl緩沖液，pH 8.0）溶解，加樣于Sephadex G-50凝膠過濾色譜柱（60.00 cm×1.60 cm，柱體積約114.00 mL，柱床高56.00 cm），洗脫液體積流量1.00 mL/min，檢測各洗脫峰的溶繭酶抑制活性。

2.6 快速蛋白質液相色譜（FPLC）分析

以上JCCI活性蛋白峰進一步做Superdex 75 Increase 10/300 G L FPLC分析，用2倍體積的50 mmol/L pH 8.0 Tris HCl緩沖液平衡色譜柱，上樣后收集1.2倍柱體積的洗脫液，每管1 mL，體積流量0.50 mL/min，檢測280 nm的紫外吸光度值，蛋白峰用Ultra-46K濃縮。檢測各洗脫峰溶繭酶抑制活性?；钚缘鞍追逵肧DS-PAGE檢測蛋白純度，純化的樣品?80 ℃保存。

2.7 SDS-PAGE分析

參照文獻方法[22]進行SDS-PAGE分析，凝膠濃度為12%，用考馬斯亮藍R-250染色。

2.8 飛行時間質譜分析

吸取10 μL 1.00 mg/mL的JCCI樣品與10 μL 5.00 mg/mL的α-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA）混勻。取1 μL混合液滴于進樣深頭，抽真空除去溶劑，用4800 Plus MALDI TOF/TOFTMAnalyzer進行質譜分析，激光光源為355 nm Nd：YAG激光器，加速電壓2 kV，正離子反射檢測模式。

2.9 JCCI的N端氨基酸序列分析

參照文獻方法[21]，應用ABI 491A氨基酸測序儀，以Edman降解法測定JCCI的端10個氨基酸序列。

2.10 JCCI的動力學分析

配制2.00 nmol/mL（28.00 μg/mL）和3.00 nmol/mL（42.00 μg/mL）的JCCI溶液，各取1.00 mL分別與2.00 mL 60.00 μg/mL的溶繭酶溶液（相當于2.50 nmol/mL）混合，分別加入2.00、4.00、6.00、8.00、10.00、12.00、14.00、16.00、18.00 μL的底物BApNA溶液（10.00 mmol/L），保溫5 min后用0.50 mL 33 %的乙酸溶液終止反應，測定410值，應用Origin 2018 64bit軟件中抑制劑動力學分析子程序，直接以MichaelisMenten模型作圖，計算米氏常數（m）、最大反應速度（max）、抑制常數（K）。

2.11 細胞培養

SMCC-7721細胞用含10%胎牛血清，100 U/mL氨芐青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基，于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。當SMCC-7721細胞貼壁并長滿培養瓶側壁時，用胰蛋白酶消化處理后作傳代培養。

2.12 MTT檢測

取對數生長期SMCC-7721細胞接種到96孔細胞培養板，接種密度為1×105個/mL，每孔100.00 μL，培養24 h后給藥，JCCI質量濃度分別為500.00、250.00、100.00 μg/mL，每個劑量設置6個復孔，給藥36 h后，加入10.00 μL 5.00 g/L的MTT，繼續培養4 h，吸除各培養孔上清后，加入150.00 μL DMSO充分溶解，用酶標儀測定各培養孔490 nm處值。按公式計算細胞生長抑制率，并應用SPSS 13.0軟件計算JCCI的IC50。

細胞生長抑制率＝1－給藥組平均值/對照組平均值

2.13 體內抗腫瘤活性檢測

用DMEM調配對數生長期的SMCC-7721的細胞密度為5.00×106/mL。取0.10 mL的細胞懸液于背部sc于6只BALB/C裸鼠，根據腫瘤生長狀況飼養約20 d后處死小鼠，選擇生長良好的腫瘤組織，切成小塊（質量約40.00 mg），加入0.20 mL生理鹽水，用穿刺針移植于裸鼠左側腋窩，約1周后將腫瘤生長良好的荷瘤裸鼠隨機分為5組，每組6只。陰性對照組于瘤周sc 0.20 mL生理鹽水（10.00 mL/kg），每天1次；陽性對照組于瘤周sc 16.00 μL的5-氟嘧啶（5-Fu）注射液原液（25.00 mg/mL），隔天1次，注射劑量為20.00 mg/kg；給藥組分低、中、高3個JCCI劑量組，分別于瘤周sc 0.20 mL用生理鹽水溶解的JCCI藥液，每天1次，注射劑量分別為50.00、25.00、12.50 mg/kg。連續給藥14 d后，比較各組腫瘤質量，計算腫瘤抑制率。各組裸鼠處死前稱定質量，處死后無菌采集各組裸鼠脾臟稱定質量，計算脾臟指數。

脾臟指數＝10×脾臟質量/體質量

2.14 統計分析

JCCI處理組間差異比較應用SPSS軟件做均勻方差分析與檢驗，實驗數據用表示，＜0.05表示有統計學顯著差異。

3 結果

3.1 JCCI的提取與分離

按照“2.1”項方法，取2.00 g凍干粉應用分步鹽析法分離得到不同飽和度的硫酸銨沉淀物，按照“2.2”項方法檢測各沉淀物的蛋白質含量，按照“2.3”項方法檢測溶繭酶抑制活性。結果顯示（表1），JCCI溶繭酶抑制活性主要存在于55%和85%的硫酸銨沉淀物中，但后者的比抑制活力是前者的1.43倍，而且55%硫酸銨沉淀物的比抑制活力（1.45 U/mg）與總硫酸銨沉淀物比抑制活力（1.40 U/mg）相近，純化倍數僅為1.04。因此，本研究將僵蠶總水溶性蛋白的85%硫酸銨沉淀物指定為JCCI粗蛋白。以此為基礎進行純化處理。

3.2 JCCI的純化

按照“2.4”項方法，取300 mg JCCI粗蛋白做親和色譜純化。圖1-A上圖顯示2個蛋白峰，第1個峰在8～15號收集管，為鹽洗脫峰，該峰經檢測無溶繭酶抑制活性；第2個峰在25～30號管，為具有顯著JCCI活性的親和吸附峰。

按照“2.5”項方法，應用Sephadex G?50對親和色譜的25～30號管收集夜做進一步的凝膠過濾色譜純化。圖1-A下圖顯示主蛋白峰在21～25號收集管，具有顯著的溶繭酶抑制活性，在主蛋白峰前面的5～20號收集管存在4個很小的雜蛋白峰，均無JCCI活性。主蛋白峰的22～24號管經12% SDS-PAGE純度分析，顯示單一蛋白條帶，純度大于90%。

合并22～24號收集管組分，按照“2.6”項方法進行FPLC分析。圖1-C顯示在洗脫時間25～30 min出現蛋白主峰，合并收集主峰組分，獲得純化的JCCI。12% SDS-PAGE分析結果（圖1-B）顯示在相對相對分子質量1.0×104～1.5×104存在單一蛋白主帶。飛行時間質譜分析結果（圖1-D）表明，JCCI相對分子質量為13 973.63。

表1 JCCI粗蛋白鹽析分離及其溶繭酶抑制活性檢測

Table 1 Isolation of JCCI crude protein by salt fractionation with(NH4)2SO4 and determination of its inhibitory activity

組分蛋白含量/mg抑制活力/U比抑制活力/(U·mg?1)蛋白回收率/% 25%硫酸銨沉淀物275.6857.830.2113.78 55%硫酸銨沉淀物491.45713.431.4524.57 85%硫酸銨沉淀物442.79917.392.0722.14 總硫酸銨沉淀物1 209.921 688.651.4060.50

A-上圖為親和色譜圖，下圖為凝膠過濾色譜圖 B-SDS-PAGE（泳道M為蛋白質相對分子質量標記；泳道1～4為JCCI粗蛋白，上樣量分別為25、20、15、10 μL；5、6為親和色譜樣品；7為凝膠過濾色譜樣品；8為FPLC樣品） C-快速蛋白質液相色譜圖 D-飛行時間質譜圖

由表2可見，JCCI粗蛋白經親和色譜分離后比抑制活力增加了9.30倍，是JCCI純化的關鍵步驟。Sephadex G-50凝膠過濾色譜分離使比抑制活力進一步提升了1.32倍，獲得基本純化的JCCI單一成分。盡管FPLC步驟的純化倍數提升不顯著，但使JCCI純度進一步提高，滿足端氨基酸測序分析要求。JCCI粗蛋白經3步色譜分離，獲得能夠滿足端氨基酸測序分析要求的JCCI單體，總純化倍數提升了13.01，總抑制活力回收率為86.26%，蛋白回收率為6.64%。

3.3 JCCI的N端氨基酸序列與同源性

按照“2.9”項方法，JCCI樣品經PAGE電泳后轉膜，剪下主帶，應用Edman降解法測序，獲得JCCI的端10個氨基酸序列：VRNKRQSNDD（纈氨酸·精氨酸·天冬酰胺·賴氨酸·精氨酸·谷氨酰胺·絲氨酸·天冬酰胺·天冬氨酸·天冬氨酸）。應用BLASTp程序檢索NR數據庫，設定值范圍為0～100，共檢索到6個100%相似度蛋白（表3）。以Grishin（protein）為距離采用Fast Minimum Evolution方法建立系統發育樹，JCCI與一種家蠶蛾蛋白酶抑制劑（NP_001040294.1）、一種野桑蠶未表征蛋白（XP_028028609.1）、一種黃桿菌BFFFF2蛋白高度同源，但4者相對分子質量不同，不是同種蛋白。本研究從中藥僵蠶中分離純化出JCCI屬首次報道，根據NP_001040294.1推測的JCCI的全長氨基酸序列與cDNA編碼序列匯總見圖2。

表2 JCCI的純化步驟

Table 2 Purification steps of JCCI

純化步驟蛋白含量/mg抑制活力/IU抑制活力回收率/% 比抑制活力/(U·mg?1) 85%硫酸銨沉淀300.00621.59100.002.07 親和色譜29.29563.5890.6719.24 Sephadex G-50凝膠過濾色譜21.38541.3387.0925.32 FPLC19.91536.1886.2626.93

3.4 JCCI對溶繭酶活性的抑制作用與動力學分析

如圖3-A所示，在含5 nmol/L溶繭酶的反應體系中，JCCI在0～5.00 nmol/L對溶繭酶抑制活性線性相關，二者物質的量抑制比約為1∶1，質量抑制比約為1∶1.71。

如圖3-B所示，3種JCCI濃度（0、2.00、3.00 nmol/L）反應體系的m值相近，分別為76.76、76.40、76.35，而max值則隨JCCI含量增加而下降，分別為46.50、27.76、18.53單位。因此，JCCI為溶繭酶的非競爭性抑制劑。

3.5 JCCI對SMCC-7721細胞體外增殖抑制作用

SMCC-7721細胞貼壁生長24 h后給藥，給藥36 h后MTT法測各培養孔490。表4顯示，JCCI對SMCC-7721增殖具有顯著抑制作用，抑制活性呈現濃度相關效應。應用邏輯回歸求得JCCI在給藥36 h后的IC50為260.52 μg/mL。

表3 JCCI的N端氨基酸序列BLASTp相似度檢索結果匯總(E值0～100)

Table 3 BLASTp similarity of the JCCI N-terminal amino acid sequence (E value 0—100)

登錄號科學名稱總得分E值相似度/%序列 QueryBombyx Batryticatus100.00100.001 VRNKRQSNDD 10 XP_028028609.1Bombyx mandarina35.40.53100.0021 VRNKRQSNDD 30 NP_001040294.1Bombyx mori35.40.55100.0021 VRNKRQSNDD 30 OYU82547.1Flavobacterium sp. BFFFF232.08.90100.00114 VRNKRQSND 122 XP_017783957.1Nicrophorus vespilloides29.950.0088.8923 IRNKRQSND 31 KAF2887618.1Ignelater luminosus29.951.0088.8996 RNKRQANDD 104 XP_028400913.1Dendronephthya gigantea29.198.00100.00636 NKRQSNDD 643

圖2 JCCI的氨基酸序列及其cDNA編碼序列

v0-5.00 nmol·L?1溶繭酶 v2-5.00 nmol·L?1溶繭酶和2.00 nmol·L?1 JCCI v3-5.00 nmol·L?1溶繭酶和3.00 nmol·L?1 JCCI

表4 JCCI對SMCC-7721細胞體外增殖的抑制作用()

Table 4 Inhibitory effect of JCCI on the in vitro proliferation of SMCC-7721 cells()

組別劑量/(μg.mL?1)A490抑制率/% 對照 00.697±0.017 JCCI1000.531±0.034**24 2500.389±0.029**44 5000.195±0.025**72

與對照組比較：**＜0.01

**< 0.01control group

圖4為500 μg/mL JCCI給藥36 h的細胞形態。JCCI給藥組細胞貼壁面積收縮減少，細胞核固縮，細胞質粗糙，核分裂較少，細胞數量與對照相比顯著減少，大量細胞懸浮死亡。而對照組細胞外部形態正常，貼壁生長良好。

A-對照 B-JCCI處理

3.6 JCCI對SMCC-7721細胞體內增殖抑制作用

以5-Fu為陽性對照藥物，以瘤周sc方式給藥，JCCI對SMCC-7721移植瘤生長影響結果見表5。JCCI能夠明顯抑制SMCC-7721移植瘤細胞生長，抑制活性呈現劑量依賴性。與對照組相比，JCCI低劑量組的抑瘤率有所降低，但無差異顯著性，JCCI中、高劑量組和陽性藥物組的抑瘤率顯著高于對照組。JCCI中劑量組與5-Fu組相比抑瘤率無顯著差異，但JCCI高劑量組的抑瘤率顯著高于5-Fu組。JCCI各劑量組對裸鼠脾臟指數影響差異不顯著。

4 討論

僵蠶在中醫臨床上具有熄風、祛風之功效[1]。中醫理論認為“內風”善行數變是引起肝癌轉移的關鍵病機之一，并有相關“風藥”抗腫瘤作用的報道[23-25]。盡管僵蠶抗腫瘤物質基礎與作用機制已有諸多研究[2-10]，但有關僵蠶抗腫瘤活性蛋白的研究未見報道。本課題組在前期研究中分離得到一種具有家蠶溶繭酶抑制活性的僵蠶蛋白組分，推測該組分與僵蠶的抗腫瘤活性密切相關。為此，本研究進一步應用以溶繭酶為配體的親和色譜、Sephadex G-50凝膠過濾色譜，以及FPLC技術，從僵蠶粗蛋白的85%硫酸氨沉淀物中純化出JCCI，純化的JCCI經SDS-PAGE檢測顯示單一條帶，FPLC呈單一對稱的色譜主峰，進一步對JCCI做了抑制活性動力學分析，觀測了JCCI對SMCC-7721細胞的體內、外增殖的影響，旨在為中藥僵蠶抗腫瘤臨床應用與抗肝癌新藥研發奠定基礎。

表5 JCCI對SMCC-7721荷瘤裸鼠腫瘤質量和脾臟指數的影響()

Table 5 Tumor inhibition rate of JCCI on SMCC-7721 cells in tumor?bearing mice and the spleen coefficient()

組別劑量/ (mg·kg?1)腫瘤質量/g抑瘤率/%脾臟指數/(mg·g?1) 對照00.38±0.1905.27 5-Fu20.00.29±0.16*23.685.18 JCCI12.50.35±0.14 9.685.36 25.00.27±0.11*31.435.63 50.00.23±0.09*# 55.56#5.44

與對照組比較：*＜0.05；與陽性藥物組比較：#＜0.05

*< 0.05control group#< 0.05positive drug group

以溶繭酶為配體的親和色譜是JCCI分離純化的技術核心，親和配體源自家蠶蛾在羽化過程中合成分泌的一種絲氨酸蛋白酶—溶繭酶，純化的JCCI屬于一種絲氨酸蛋白酶抑制劑。在親和色譜過程中，需先將上樣后的色譜柱在37 ℃條件下保溫處理1～1.5 h，以水解去除與親和配體非特異性結合的底物蛋白，然后再用1 mol/L NaCl溶液洗柱，以洗掉絕大部分與凝膠介質非特異性結合的雜蛋白，最后用pH 2～3的鹽酸溶液洗柱，獲得含少量雜質的JCCI。在Sephadex G-50凝膠過濾色譜過程中，JCCI的活性主峰位于20～25號收集管，但在主峰前面有一小的雜蛋白峰與主峰未完全分開，為保證JCCI的純度可在收集過程中僅將23～25號管的收集液合并，用于下一步的FPLC分析。應用ABI-491A氨基酸測序儀以Edman降解法測序對樣品蛋白純度要求很高，為確保測序成功，將FPLC主峰收集液經PAGE電泳后進一步電轉膜，剪下PVDF膜上的主帶用于測序分析，測得JCCI的N端前10個氨基酸序列為“VRNKRQSNDD”。

蛋白質端5～10個氨基酸序列通常是其特征性標簽序列。根據應用BLASTp程序檢索nr數據庫的同源性比較結果和系統發育樹，JCCI與一種家蠶蛾蛋白酶抑制劑前體（NP_001040294.1）高度同源，NP_001040294.1的21～30位氨基酸序列與JCCI的1～10位序列完全相同。根據Suetsugu等[26]對家蠶大規模全長cDNA測序結果，NP_001040294.1全長含148個氨基酸殘基，但從第21位氨基酸殘基開始計算的相對分子質量與JCCI的飛行時間質譜測定的相對分子質量完全相同，均為13 973.63。由此判斷JCCI是家蠶NP_001040294.1蛋白缺失了N端20個氨基酸殘基的一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，該抑制劑含128個氨基酸殘基，等電點為8.01。本研究從中藥僵蠶中分離純化出JCCI屬首次報道。

JCCI對SMCC-7721細胞體外增殖與荷瘤裸鼠的腫瘤生長具有顯著抑制作用，抑制率呈線性劑量效應。因此，JCCI是僵蠶中一種具有抗腫瘤活性的絲氨酸蛋白酶抑制劑。腫瘤細胞外基質屏障的降解是腫瘤細胞生長和浸潤過程中的關鍵環節，它與基質中絲氨酸蛋白酶活性密切相關[15]，而人肝癌細胞存在絲氨酸蛋白酶抑制劑受體，能夠調節基質絲氨酸蛋白酶的活性，抑制蛋白酶對基質蛋白的分解作用[15]。由此推測，JCCI可能與SMCC-7721胞膜外側的絲氨酸蛋白酶抑制劑受體結合，抑制基質蛋白酶活性，通過阻斷細胞外基質屏障的降解，影響腫瘤細胞的浸潤擴散過程，從而發揮對SMCC-7721細胞體內外生長的抑制作用。

JCCI在體內外對SMCC-7721細胞增殖抑制作用顯示了良好的抗腫瘤藥物研發前景。但JCCI能否直接抑制與阻斷SMCC-7721的轉移與侵襲及其作用靶點與機制尚需進一步明確。本研究下一步將設計合成兼并引物以完成JCCI的cDNA序列克隆與表達，研究JCCI對腫瘤相關信號通路的影響，以深入探討其抗腫瘤作用機制，為論證JCCI抗腫瘤相關臨床應用研發的可行性奠定基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Research on purification of cocoonase inhibitor ofand its anti-tumor activity

WANG Hou-wei1, XU Ling-chuan1, WANG Jia-chao3, ZENG Ying-zi4, TIAN Jing-zhen1, DOU Yan-ling2, WANG Fei5

1. School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China 2. School of Intelligence and Information Engineering, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China 3. School of Basic Medicine, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China 4. Shandong Wohua Pharmaceutical Technology Co., Ltd., Weifang 261061, China 5. Yuhua Jingchen (Shandong) Health Development Group Co., Ltd., Jinan 250000, China

To isolate and purify the cocoonase inhibito ofr (Jiangcan, JCCI), and study its anti-tumor activity of SMCC-7721 liver cancer cellsand.JCCI was purified from the 85% ammonium sulfate precipitate of the crude protein extract ofby affinity chromatography with silkworm cocoonase as ligand, Sephadex G-50 gel filtration chromatography, and Superdex 75 FPLC. The JCCI N-terminal amino acid sequence was determined by Edman degradation method. MTT method and tumor-bearing nude mouse model were used to detect the inhibiting effect of JCCI on the proliferation and growth of SMCC-7721and.The molecular weight of JCCI was 13 973.63 Daltons, and the first 10 amino acid sequence of its N-terminal was VRNKRQSNDD. JCCI was a non-competitive cocoonase inhibitor, with an average Km of 76.50 and a molar inhibition ratio of 1∶1. JCCI could significantly inhibit the proliferation of SMCC-7721and the tumor growth of tumor-bearing nude mice. The IC50was 260.52 μg/mL after 24 h administration, and the inhibition rate was linearly related to the dose of JCCI.JCCI was a serine protease inhibitor with anti-tumor activity purified fromfor the first time.

; cocoonase; serine protease inhibitor; anti-tumor activity; liver cancer; affinity chromatography; tumor-bearing nude mice; MTT method

R284.1

A

0253 - 2670(2022)07 - 2022 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.07.011

2021-10-28

山東省自然科學基金資助項目（ZR2013HM035）；山東省重點產業關鍵技術資助項目（2016CYJS08A01-8）；濟南科技發展計劃資助項目（201102021）；山東省高?？萍加媱澷Y助項目（J11LF29）

王厚偉，碩士生導師，副教授，從事基于藥性理論的中藥生物技術新藥研發。Tel/Fax: 13791138419 E-mail: houweiw@163.com

竇彥玲，副教授，從事計算機科學與技術研究。Tel/Fax: 15864533191 E-mail: yanlingdou@163.com

[責任編輯 王文倩]