基于外周血單個核細胞轉錄組學的柴歸顆?？挂钟糇饔脵C制研究

王力文，黃德華，田俊生，高曉霞，秦雪梅，杜冠華，周玉枝*

? 藥理與臨床 ?

基于外周血單個核細胞轉錄組學的柴歸顆?？挂钟糇饔脵C制研究

王力文1, 2, 3，黃德華1, 2, 3，田俊生1, 2, 3，高曉霞1, 2, 3，秦雪梅1, 2, 3，杜冠華1, 4，周玉枝1, 2, 3*

1. 山西大學 中醫藥現代研究中心，山西 太原 030006 2. 山西大學 化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006 3. 地產中藥功效物質研究與利用山西省重點實驗室，山西 太原 030006 4. 中國醫學科學院，北京協和醫學院藥物研究所，北京 100050

通過轉錄組測序（RNA sequencing，RNA-seq）技術分析柴歸顆粒對慢性不可預知溫和應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）模型大鼠外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）的轉錄組學特征，并采用qRT-PCR法驗證其作用機制。將大鼠隨機分為對照組、模型組、鹽酸文拉法辛（35 mg/kg）組和柴歸顆粒低、中、高劑量（4.2、8.3、16.6 g/kg）組，造模同時給藥，連續28 d。通過抑郁癥傳統藥效學指標（體質量、曠場實驗、糖水偏愛實驗及強迫游泳實驗）評價柴歸顆粒的藥效。采用RNA-seq技術對大鼠PBMCs進行轉錄組學分析，篩選差異基因，對其進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析；通過qRT-PCR法對篩選出的關鍵表達基因進行實驗驗證。行為學指標顯示柴歸顆粒能顯著改善CUMS模型大鼠的抑郁行為。轉錄組學中KEGG通路富集分析表明抑郁發生時及柴歸顆粒干預后，都顯著富集到嘌呤代謝通路，因此針對嘌呤代謝相關代謝酶基因表達進行深入研究。qRT-PCR結果表明，與模型組比較，柴歸顆粒組大鼠PBMCs中的胞外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶3（ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 3，）、胞質-5′-核苷酸酶IIIA（cytosolic-5′-nucleotidase IIIA，）、嘌呤核苷磷酸化酶（purine nucleoside phosphorylase，）、腺苷酸脫氨酶（adenosine deaminase，）mRNA表達水平顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），黃嘌呤脫氫酶/氧化酶（xanthine dehydrogenase/oxidase，）、嘌呤能受體P2X7（purinergic receptor P2X7，）、白細胞介素1β（interleukin 1β，）mRNA表達水平顯著降低（＜0.05、0.01）。柴歸顆粒具有抗抑郁作用，其作用機制與調節嘌呤代謝途徑上的基因及嘌呤能受體和炎癥因子mRNA表達有關。

柴歸顆粒；慢性不可預知溫和應激抑郁；外周血單個核細胞；轉錄組學；嘌呤代謝

根據世界衛生組織的數據，抑郁癥是一種常見的精神障礙，影響著全球3億多人口。抑郁癥也是自殺的一個危險因素。2017年，世界衛生組織宣布自殺是15～29歲年輕人的第2大死因，并預測抑郁癥將是未來10年世界上最常見的精神疾病[1]。臨床抗抑郁藥物以化學藥為主，其優勢在于起效較快，療效確切，不足在于不良反應較大，患者對藥物存在依賴性，復發率較高；而中藥的藥效穩定且不良反應少，安全性高?，F代藥理學研究表明，多種中藥復方[2-3]均有顯著的抗抑郁作用。因此，從中藥和天然藥物中研究和開發新藥，對抑郁癥的治療和創新藥物的開發有重要意義。柴歸顆粒是本課題組經過前期對經典方劑逍遙散最佳抗抑郁組分進行藥效學篩選和抗抑郁物質基礎研究，并通過藥效成分歸屬和臨床觀察對原方進行化裁而研發的抗抑郁中藥新藥，其處方由柴胡、當歸、白芍、麩炒白術、炙甘草、薄荷6味中藥組成。柴歸顆粒已獲得國家藥物臨床試驗批件（2018L03149），多種抑郁動物模型均證明該藥具有確切的抗抑郁作用[4-7]，目前正在開展藥物臨床試驗研究[8]。然而，柴歸顆?？挂钟糇饔脵C制尚未明確。

外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）是由外周血中淋巴細胞和單核細胞等具有單個核的細胞組成（以淋巴細胞為主）。PBMCs在免疫應答、代謝、與其他細胞和細胞外基質的通訊等方面發揮著重要作用[9-11]。炎癥及免疫反應在抑郁癥的發病機制中起重要作用。因此，與血清/血漿樣本相比，以免疫細胞為主的PBMCs對于研究抑郁癥的發生與免疫之間的聯系更具有說服力。目前，已有大量的臨床試驗樣本證據表明PBMCs的基因改變與抑郁癥的關系非常密切。如崔雪蓮[12]以抑郁癥和健康人的PBMCs為研究對象，用人類LncRNA3.0芯片初步篩查，結果發現6個LncRNAs有潛力作為抑郁癥的診斷標志物，其中一個LncRNA（NONHSAG045500）與5-羥色胺轉運體（serotonin transporter，SERT）的表達密切相關，可作為抗抑郁新型藥物的靶點。Beech等[13]用微陣列技術檢測20名抑郁癥患者和15名健康人PBMCs的基因表達水平，結果發現其中85個差異表達基因顯著富集途徑為線粒體能量代謝途徑，表明線粒體能量代謝途徑在抑郁患者的病理生理過程中發揮重要作用。Pan等[14]采用轉錄組學技術研究產后抑郁癥患者PBMCs基因表達情況，結果顯示產后抑郁與參與能量代謝、神經退行性疾病和免疫應答的多種基因表達呈正相關。另有文獻報道[10]，在抗抑郁治療過程中抑郁患者PBMCs中的端粒酶活性增加與抑郁癥狀減少密切相關。阿戈美拉汀的長期給藥降低抑郁模型大鼠PBMCs中色氨酸分解代謝途徑上的mRNA表達，進一步調控蛋白表達起到抗抑郁作用[15]。也有研究發現調節Toll受體4信號的microRNA（let-7e、miR-146a和miR-155）在抑郁患者中表達降低，并且這些microRNA表達水平通過抗抑郁治療后得到回調[16]。抑郁癥的嚴重程度與PBMCs中2′,5′-寡腺苷酸合成酶、Toll受體及P2X7受體的含量呈正相關，與β-抑制蛋白1的含量呈負相關[17-20]。PBMCs可通過血腦屏障進入中樞，參與腦內的病理生理過程[21-22]。同時，PBMCs表達抑郁癥相關的基因與腦具有一定相似性[23-24]。He等[25]對重度抑郁患者PBMCs的miRNAs表達水平進行研究，發現能夠調控腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、環磷腺苷效應元件結合蛋白1（cAMP-response element binding protein，CREB）表達的miR-124表達水平明顯高于健康人，給予抗抑郁藥后miR-124水平得到回調，提示大腦中豐富表達的miR-124可能作為抑郁癥的外周系統的標志物。此外，鑒于腦脊液和腦組織活檢樣本在臨床上不適用于常規篩查或診斷，PBMCs在抑郁癥診斷生物標志物篩選中顯示出其獨特的優勢。綜上所述，抑郁癥發生必然對PBMCs造成影響，以PBMCs為切入點，適用于抑郁癥發病機制及抗抑郁藥物在基因或蛋白水平的深入研究。

轉錄組學是在整體水平上研究細胞中所有基因轉錄及轉錄調控規律的學科，有助于了解疾病發生發展過程中基因的表達情況，進而從轉錄水平揭示生命過程的代謝網絡及調控機制[26]。本研究借助轉錄組測序（RNA sequencing，RNA-seq）技術從基因水平進行研究，探尋正常、抑郁以及柴歸顆粒干預后PBMCs中的差異表達基因，并對測序結果進行生物信息學分析及驗證，以期闡明柴歸顆粒改善抑郁癥可能的靶基因及相關通路，進而闡明柴歸顆?？挂钟舻淖饔脵C制。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠，6～7周齡，體質量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0006。實驗期間動物保持自由飲水和進食，飼養環境溫度為（24±1）℃，濕度為（55±5）%，12 h明暗交替光照，實驗前適應性飼養1周。動物實驗獲得山西大學倫理委員會的批準（批準號SXULL-2020028）。

1.2 藥材

柴歸顆粒（10 g/袋，批號20181009）由山西省中醫研究院制劑中心制備，所用中藥材有柴胡、當歸、白芍、麩炒白術、炙甘草和薄荷，以上藥材均購自山西省華陽藥業有限公司，經山西大學中醫藥現代研究中心秦雪梅教授鑒定分別為柴胡DC.、當歸(Oliv.) Diels.、白芍Pall.、白術Koidz.、甘草Fisch.和薄荷Briq.，均符合《中國藥典》2020年版標準。本課題組前期通過研究建立了柴歸顆粒的指紋圖譜并通過對照品指認出12種化學成分，分別為芍藥內酯苷、芍藥苷、甘草苷、阿魏酸、甘草酸銨、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、白術內酯III、歐前胡素、藁本內酯、白術內酯I和白術內酯II。經高效液相色譜含量測定方法測得柴胡皂苷a、b2、b1、d的總質量分數為0.68%，芍藥苷的質量分數為0.98%以上，將柴胡皂苷a、b2、b1、d和芍藥苷作為柴歸顆粒的質控標準[27-28]。

1.3 藥品與試劑

鹽酸文拉法辛緩釋膠囊（75 mg/粒，進口藥品注冊證號H20160382H20160383，分包裝批準文號國藥準字J20160087，批號CF1090D）購自Pfizer Ireland Pharmaceuticals公司；Oligo（dT）18Primer（批號AL11594A）、dNTP Mixture（批號AJG1229A）、RNase Inhibitor（批號AK32360A）、2×TaqPCR Master Mix（批號U9202）、SYBR?Green Realtime PCR Master Mix（批號067600）、Trizol試劑購自日本Takara公司；DEPC處理水購自北京索萊寶生物科技有限公司；分析級氯仿、異丙醇和無水乙醇。

1.4 儀器

恒溫鼓風干燥箱（上?，槴\實驗設備有限公司）；大鼠曠場測試箱（長100 cm、寬100 cm、高70 cm，黑色，25格，實驗室自制）；KQ-400KDE型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；TDL-5型高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；BSA124S型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；NC2000 Nanodrop紫外定量儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Agilent Technologies生物分析儀2100系統（美國CA公司）；DYY-6C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；BG-gdsAUTO（130）凝膠成像系統（北京百晶生物技術有限公司）；2720型PCR擴增儀（美國ABI公司）；FLX800T型酶標儀（美國Bio Tek公司）。

2 方法

2.1 柴歸顆粒的制備

柴胡、當歸、白芍、麩炒白術、炙甘草和薄荷6味藥材用8倍量85%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h，藥液濃縮、干燥至浸膏；藥渣用8倍量水提2次，每次2 h，將水提液濃縮至1.10 g/mL（65 ℃），乙醇沉淀濃度為50%，靜置48 h，濾過，回收乙醇，濃縮、干燥至浸膏；混合乙醇提取物和水提醇沉物，即得復方柴歸方提取物。淀粉、糊精、乳糖、預膠化淀粉均為輔料，采用干法制粒技術，取干浸膏粉，成品采用聚酯/鍍鋁聚酯/聚乙烯藥用復合膜包裝，即得到柴歸顆粒。此工藝由山西省中醫研究院制劑中心制備，10 g/袋，每袋含生藥量27.5 g。

2.2 分組與給藥

經體質量、曠場實驗、糖水偏愛實驗測試后，選擇指標相近的大鼠60只，隨機分為對照組、模型組、鹽酸文拉法辛（35 mg/kg）組和柴歸顆粒低、中、高劑量（4.2、8.3、16.6 g/kg）組，每組10只，大鼠造模同時給藥，各給藥組ig相應藥物（10 mL/kg），對照組和模型組ig等體積蒸餾水，1次/d，連續28 d。

2.3 慢性不可預知溫和應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）抑郁模型的建立

參照本課題組前期方法[29]，建立CUMS大鼠抑郁模型。對照組大鼠正常飼養，不接受任何刺激。其余各組接受28 d造模程序，主要包括熱刺激、4 ℃冰水游泳、超聲刺激、夾尾、晝夜顛倒、足底電擊、禁水（24 h）束縛和禁食（24 h）等。每組動物每天隨機給予1種刺激，同一種刺激累計使用不超過4次。

2.4 行為學檢測

參照本課題組前期行為學檢測方法[29]，進行行為學實驗，包括體質量實驗、糖水偏愛實驗、曠場實驗和強迫游泳實驗。

2.4.1 體質量實驗 在實驗第0、7、14、21和28天分別稱定大鼠體質量。

2.4.2 糖水偏愛實驗 在實驗之前，需要進行糖水偏愛訓練。準備1%蔗糖溶液和日常飲用水用于訓練和實驗。每只大鼠（單籠飼養）飼養籠上放置2個水瓶，訓練開始第1天給予2瓶1%蔗糖溶液，第2天將其中1瓶1%蔗糖水溶液換為日常飲用水。訓練結束后，所有大鼠禁食禁水24 h，然后在12 h內正式進行糖水偏愛實驗測定糖水消耗量，實驗期間大鼠自由選擇飲用1%蔗糖水溶液或水。第0天測定糖水偏愛率的基線，第28天進行糖水偏愛實驗，計算每只大鼠的糖水偏愛率。

糖水偏愛率＝消耗的蔗糖水溶液的質量/(消耗的蔗糖水溶液的質量＋消耗日常飲用水的質量)

2.4.3 曠場實驗 實驗第0、7、14、21、28天，曠場實驗裝置的底部（100 cm×100 cm×40 cm）被等分成25個正方形，在相對安靜的環境里（≤60分貝）從16: 00～19: 00時進行曠場實驗測試。將大鼠置于曠場實驗裝置中1 min以適應環境，觀察大鼠穿越格數（至少3只爪子跨過網格線）和直立次數（兩前肢距離地面至少1 cm）。適應環境1 min后，記錄4 min內的大鼠的穿越格數和直立次數。

2.4.4 強迫游泳實驗 強迫游泳實驗裝置為高50 cm、直徑20 cm的圓柱形有機玻璃容器，水溫（25±1）℃，水深30 cm。實驗第28天，每只大鼠接受15 min的強迫游泳訓練，并在第29天進行強迫游泳實驗。每只大鼠進行強迫游泳實驗6 min，在最后4 min記錄不動時間。大鼠保持頭部懸浮在水面上并且無明顯掙扎的時間為不動時間。

2.5 PBMCs樣本收集

末次給藥后，大鼠禁食不禁水24 h，大鼠ip 10%水合氯醛（5 mL/kg）麻醉，腹主動脈取血，用肝素鈉抗凝管收集血液約10 mL。取血1 h內，取15 mL的離心管，先加入聚蔗糖-泛影葡胺分層液（Ficoll-Hypaque）5 mL，按照全血量與分離液比例為1∶1，再沿壁緩慢加入抗凝血，室溫2000 r/min離心25 min，吸取血漿至離心管，再取離心管吸取PBMCs，加入適量清洗液，1000 r/min離心10 min，棄上清，清洗2次。根據行為學測試結果可以看出柴歸顆粒中劑量組的抗抑郁效果較好，更接近對照組，因此選用對照組、模型組和柴歸顆粒中劑量組大鼠PBMCs樣本進行后續的RNA-seq實驗。在對照組、模型組和柴歸顆粒中劑量組中每組選取4個PBMC樣本進行RNA-seq前樣本準備，加入適量PBS溶液清洗細胞，1000 r/min離心5 min，棄上清，清洗2次；加入適量Trizol試劑提取總RNA，反復吹打至PBMCs充分裂解，將裂解液轉移至1.5 mL無酶管中液氮速凍，于?80 ℃保存。

2.6 RNA-seq分析

利用RNA 6000Nanokit檢測儀檢測所提RNA的濃度和純度，質檢合格后，通過Oligo（dT）磁珠富集總RNA中帶有polyA結構的mRNA，采用離子打斷的方式，將RNA打斷到200～300 bp片段。隨后合成cDNA第一鏈，并以第一鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA，建立鏈特異性文庫。使用安捷倫2100生物分析儀對文庫進行質檢，采用第二代測序技術，基于Illumina HiSeq測序平臺，對文庫進行雙末端測序，得到FASTQ格式的原始數據（raw data）。使用Cutadapt軟件對原始數據進行過濾，使用TopHat2軟件將過濾后得到的高質量序列（cleaned data）的Reads比對到參考基因組上。

2.7 RNA-seq數據分析

使用HTSeq統計每組樣本比對到每個基因上的Reads數，作為基因的原始表達量，然后采用FPKM對表達量進行標準化。采用DESeq對基因表達進行差異分析，篩選差異表達基因條件：表達差異倍數＞1.2、＜0.05。采用R語言ggplots2軟件包繪制差異表達基因的火山圖，使用Venn圖統計差異基因個數以及各組差異分析之間的共有基因數量。為進一步篩選顯著變化的基因群，采用STEM軟件將差異基因進行趨勢分析。將差異基因注釋到京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數據庫中，進而確定差異表達基因主要參與的代謝途徑和信號通路。

2.8 qRT-PCR驗證

各組選取6只大鼠，使用Trizol試劑提取PBMCs中的總RNA。選取轉錄組數據中有趨勢表達的差異基因進行qRT-PCR驗證，作為內參基因，采用2?ΔΔCt計算差異表達基因的mRNA相對表達量。胞外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶3（ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 3，）、單磷酸腺苷脫氨酶1（adenosine monophosphate deaminase 1，）、單磷酸鳥苷還原酶2（guanosine monophosphate reductase 2，）、胞質-5′-核苷酸酶IIIA（5′-nucleotidase, cytosolic IIIA，）、腺苷酸脫氨酶（adenosine deaminase，）、嘌呤核苷磷酸化酶（purine nucleoside phosphorylase，）、黃嘌呤脫氫酶/氧化酶（xanthine dehydrogenase/oxidase，）、鳥嘌呤脫氨酶（guanine deaminase，）、嘌呤能受體P2X7（purinergic receptor P2X7，）、白細胞介素1β（interleukin 1β，）引物采用Primer Primer 5軟件設計，由上海生工生物工程股份有限公司合成，各引物序列見表1。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因名基因號（ID）序列 (5’-3’)產物大小/bp Enpp3ENSRNOG00000013791F: CCATTGTCACGGGTTTGTAT121 R: CTCCACCAGGCAGGGTTA Ampd1ENSRNOG00000018656F: CAAGCCCTACCCTTACCCA 175 R: CTTCAGCTCCTTTAGCTCGTC Gmpr2ENSRNOG00000020216F: ATGGCAGGCAATGTGGTAA297 R: CCGTCTGAAATGATGTGGC Nt5c3aENSRNOG00000005981F: AGGATGGCCGATGGTGTA136 R: CAACCTCCAGTGATTCTTCTTT AdaENSRNOG00000010265F: GGGACTACGCAACATTATCG149 R: CTTCCTTTGCCTTCATCTCC PnpENSRNOG00000009982F: ACATCGACCTCAAGTGGCA106 R: GGGAAAGTTGGGTATCTCATT XdhENSRNOG00000007081F: TTTGCGAAGGATGAGGTTAC133 R: GGATTGTGATAATGGCTGGA GdaENSRNOG00000018282F: CCCTCAGTATGCCTTTGCT158 R: TGGTGGTGCCGTTCTTTA P2rX7ENSRNOG00000001296F: GTGCCATTCTGACCAGGGTTGTATAAA354 R: GCCACCTCTGTAAAGTTCTCTCCGATT IL1βENSRNOG00000004649F: TTGCTTCCAAGCCCTTGACT214 R: CTCCACGGGCAAGACATAGG ATCBENSRNOG00000034254F: GAGACCTTCAACACCCCAGC205 R: ATGTCACGCACGATTTCCC

2.9 統計學方法

采用GraphPad Prism 8.01軟件進行統計分析，數據以表示，多組間使用單因素方差分析（One-way ANOVA）和Dunnett-檢驗。

3 結果

3.1 行為學檢測

3.1.1 體質量實驗 如圖1-A所示，第0天，各組大鼠體質量無差異，體質量基線基本不變。如圖1-B所示，第28天，與對照組相比，模型組大鼠體質量顯著減輕（＜0.001）；與模型組比較，柴歸顆粒中劑量組大鼠體質量明顯增加（＜0.05），表明柴歸顆粒能夠有效逆轉CUMS造模引起的大鼠體質量減輕。

3.1.2 曠場實驗 如圖2所示，與對照組相比，模型組大鼠穿越格數和直立次數顯著減少（＜0.001），表明CUMS模型成功復制。與模型組比較，各給藥組大鼠穿越格數顯著增加（＜0.01、0.001），柴歸顆粒中劑量組大鼠直立次數顯著增加（＜0.05）。表明柴歸顆粒能夠有效改善CUMS抑郁大鼠的曠場活動情況，且柴歸顆粒中劑量組效果最佳。

C-對照組 M-模型組 P-鹽酸文拉法辛組 CG-L-柴歸顆粒低劑量組 CG-M-柴歸顆粒中劑量組 CG-H-柴歸顆粒高劑量組 與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001，圖2、3、7同

圖2 柴歸顆粒對抑郁大鼠曠場實驗中穿越格數和直立次數的影響(, n = 10)

3.1.3 糖水偏愛和強迫游泳實驗 如圖3所示，與對照組相比，模型組大鼠糖水偏愛率顯著降低（＜0.001），強迫游泳不動時間顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠糖水偏愛率顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），柴歸顆粒各劑量組大鼠強迫游泳不動時間顯著減少（＜0.05、0.01）。表明柴歸顆粒能夠顯著逆轉抑郁大鼠的快感缺失和行為絕望現象，具有顯著的抗抑郁的作用。

3.2 RNA-seq分析

3.2.1 測序數據質量評估 所建立的測序文庫中，12個樣品的原始數據為4.4×107～5.5×107，每個cDNA文庫平均獲得4.9×107個原始數據，其中12個樣品的Reads差異較小，質量值≥20的堿基所占百分比（20）≥98.09%，質量值≥30的堿基所占百分比（30）≥95.06%，表明測序結果較好，可用于后續的分析（表2）。

圖3 柴歸顆粒對抑郁大鼠糖水偏愛率和強迫游泳不動時間的影響(, n = 10)

3.2.2 差異表達基因分析 采用DESeq對基因表達進行差異分析，如圖4所示，與對照組相比，模型組共有256個顯著差異表達基因，其中顯著上調的差異基因為105個，顯著下調的差異基因為151個；與模型組相比，柴歸顆粒中劑量組共有2702個顯著差異表達基因，其中顯著上調的差異基因為1343個，顯著下調的差異基因為1359個。

3.2.3 差異表達基因的KEGG通路分析 將篩選出的差異表達基因進行KEGG通路富集分析，如圖5所示，與對照組相比，模型組差異表達基因顯著富集到的信號通路主要有B細胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路、Janus激酶-信號轉導與轉錄活化因子（Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT）信號通路、缺氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）信號通路等，研究報道這些信號通路與抑郁癥的發病機制密切相關[30-32]。差異表達基因顯著富集到的代謝通路主要有糖胺聚糖生物合成和嘌呤代謝等。

如圖6所示，與模型組相比，柴歸顆粒中劑量組差異表達基因顯著富集到的信號通路主要有Toll樣受體信號通路、HIF-1信號通路、環磷酸鳥苷-蛋白激酶G（cyclic guanosine monophosphate-protein kinase G，cGMP-PKG）信號通路、Notch信號通路、C型凝集素受體信號通路和p53信號通路等。差異表達基因顯著富集到的代謝通路主要有氧化磷酸化、丙酮酸代謝和嘌呤代謝等。

由上述結果可知抑郁發生時及柴歸顆粒干預后都顯著富集到嘌呤代謝通路。同時，基于目前調控嘌呤代謝抗抑郁的作用機制研究主要集中在嘌呤分解代謝，因此對測序結果進一步挖掘，對嘌呤分解代謝和嘌呤能系統相關的差異表達基因進行統計分析，結果見表3。柴歸顆粒干預后，在核苷酸水平上的和基因表達水平顯著降低；在核苷水平上的和基因表達水平顯著升高；在堿基水平上的基因表達水平顯著升高，和基因表達水平有升高趨勢；嘌呤能系統中的基因表達水平顯著降低，基因表達水平有降低趨勢。

表2 每個樣本cDNA文庫的測序數據

Table 2 Sequencing data of cDNA library in each sample

樣本原始條目原始數據Q30數據過濾條目測序錯誤率/%Q20/%Q30/% C155 056 7368 258 510 4007 851 013 2427 648 513 8000.001 32798.0995.06 C251 320 6487 698 097 2007 359 697 5137 093 751 7000.001 27398.3595.60 C354 235 1188 135 267 7007 768 675 0317 518 813 0000.001 35298.2595.49 C444 196 6146 629 492 1006 331 351 4906 208 298 1000.000 20698.2395.50 M151 243 9907 686 598 5007 353 804 3787 081 146 9000.000 22198.3195.67 M244 989 9266 748 488 9006 431 558 8276 264 447 0000.000 22098.1495.30 M355 924 1988 388 629 7007 862 156 4449 702 595 2000.001 27598.1695.74 M453 359 2588 003 888 7007 615 014 5867 434 598 2000.000 22398.1095.14 CG-M144 703 7146 705 557 1006 423 214 3756 194 225 7000.001 27598.4095.78 CG-M253 714 5968 057 189 4007 747 965 7677 427 522 7000.001 27298.5296.16 CG-M344 819 5286 722 929 2006 426 146 3226 217 330 2000.000 22298.3095.58 CG-M453 934 1668 090 124 9007 702 809 7747 504 610 7000.001 28098.1695.21

C-對照組 M-模型組 P-鹽酸文拉法辛組 CG-M-柴歸顆粒中劑量組

C-control group M-model group P-venlafaxine hydrochloride group CG-M-Chaigui Granules medium-dose group

紅色：上調基因；藍色：下調基因；灰色：無顯著性差異基因

圖5 CUMS造模后差異基因的KEGG通路富集分析

圖6 柴歸顆粒干預后差異基因的KEGG通路富集分析

3.3 嘌呤代謝分解途徑關鍵基因的qRT-PCR驗證

以為內參，采用qRT-PCR法對RNA-seq結果中嘌呤分解代謝途徑上的8個關鍵基因、、、、、、、以及嘌呤能通路上2個基因、進行mRNA表達水平的驗證。結果如圖7所示，與對照組相比，模型組、、、、mRNA表達水平顯著下調（＜0.01、0.001）；、、、mRNA表達水平顯著上調（＜0.05）。與模型組相比，柴歸顆粒中劑量組、、、mRNA表達水平顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），、、、mRNA表達水平顯著降低（＜0.05、0.01）。

表3 柴歸顆粒干預抑郁大鼠嘌呤代謝途徑關鍵基因的表達

Table 3 Chaigui Granules interfere with key genes expression in purine metabolism pathway in depressed rats

基因號（ID）基因P值倍數變化（vs模型）趨勢（vs模型） ENSRNOG00000018656Ampd10.013 567 5270↓ ENSRNOG00000013791Enpp30.227 797 8501.556 860 409↑ ENSRNOG00000005981Nt5c3a3.63×10?62.559 357 634↑ ENSRNOG00000009982Pnp0.228 367 9821.277 001 431↑ ENSRNOG00000018282Gda0.044 530 0182.159 190 490↑ ENSRNOG00000007081Xdh0.143 547 7981.326 008 513↑ ENSRNOG00000010265Ada0.054 164 4231.468 402 782↑ ENSRNOG00000020216Gmpr20.000 785 0940.484 805 139↓ ENSRNOG00000001296P2rx70.393 944 7650.322 012 382↓ ENSRNOG00000004649IL1β0.009 203 8170.329 862 979↓

↑：上調；↓：下調

↑: up-regulated; ↓: down-regulated

圖7 qRT-PCR檢測Ada、Ampd1、Enpp3、Nt5c3a、Pnp、Gda、Gmpr2、Xdh、P2rX7和IL1β mRNA表達(, n = 6)

4 討論

CUMS是目前較為公認的抑郁癥動物模型，聯合孤養的動物模型[33]能夠穩定地模擬人類抑郁癥患者的核心癥狀，即快感缺失，且具有高度的有效性，基于此模型研究抑郁癥的病因學和抗抑郁藥的作用有重要的科學意義。本研究采用CUMS聯合孤養的抑郁模型，通過各種行為學指標（體質量、曠場實驗、糖水實驗和強迫游泳實驗）對柴歸顆粒進行藥效學評價，同時通過轉錄組學技術對大鼠PBMCs樣本進行轉錄水平分析，采用RNA-seq高通量測序技術對對照組、模型組和柴歸顆粒中劑量組的PBMCs樣本進行分析，結果表明，與對照組相比，模型組共篩選出256個差異表達基因；與模型組相比，柴歸顆粒中劑量組共篩選出2702個差異表達基因。KEGG通路富集顯示抑郁發生時及柴歸干預后都顯著富集到嘌呤代謝。然后利用qRT-PCR驗證嘌呤代謝過程中的8個關鍵基因、、、、、、、以及嘌呤能通路上的2個基因、的表達，驗證結果與RNA-seq結果基本一致。以上結果表明柴歸顆粒具有抗抑郁作用，其作用機制與調節嘌呤代謝途徑上的基因及嘌呤能受體和炎癥因子有關，該結果為后續柴歸顆?？挂钟糇饔脵C制的深入闡明提供了基礎。

多條證據顯示，抑郁發生時嘌呤代謝途徑中的代謝物發生明顯變化[34-37]。多種酶參與嘌呤代謝過程且在該過程中發揮著重要作用。其中，Nt5c3a和Pnp是嘌呤代謝核苷酸分解代謝過程重要的酶。Pnp和5′-核苷酸酶在正常T淋巴細胞和B淋巴細胞的分化中起著重要作用[38]。Pnp的缺乏會使T細胞和B細胞免疫力受到影響，還會導致三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）升高從而抑制核糖核苷酸還原酶，阻礙細胞分裂[39]。研究表明細胞內Nt5c3a是干擾素和細胞因子信號傳導中的負表觀遺傳因子[40]。本研究發現CUMS抑郁大鼠PBMCs中和的表達降低，柴歸顆粒干預后這2種基因的表達顯著回調，提示其可能產生細胞因子信號的傳導并影響免疫細胞分裂和分化，與抑郁癥的發生關系密切。

Ada是嘌呤代謝中的一種關鍵酶，它通過將腺苷不可逆轉的脫氨為肌苷來調節細胞外和細胞內腺苷的濃度[41-42]。Ada通過催化腺苷和脫氧腺苷的脫氨基作用影響甲基化過程、細胞生長和分化、細胞凋亡、DNA復制和免疫功能[43]。文獻報道Ada的主要功能是發展和維持免疫系統，在免疫細胞功能紊亂的疾病中，Ada的活性發生了變化[44]。淋巴細胞的增殖和分化也需要Ada[45-46]。Elgün等[47]發現在重度抑郁癥患者血清中Ada水平下降，Ada水平與抑郁癥癥狀存在負相關。也有研究表明Ada的活性降低導致腺苷濃度增加對于誘發抑郁癥是一個危險信號，外源性Ada加速腺苷的降解，能縮短小鼠自發電皮質活動的抑郁癥持續時間[48]。本研究發現CUMS抑郁大鼠PBMCs中的表達顯著降低，與上述文獻報道一致，提示與對照組相比，CUMS抑郁大鼠的免疫系統出現紊亂，給予柴歸顆粒后的表達水平顯著升高。提示柴歸顆?？赡芡ㄟ^回調的表達，從而介導細胞免疫功能恢復正常發揮抗抑郁作用。

Xdh位于所有有核細胞中，催化次黃嘌呤和黃嘌呤轉化為尿酸，這是嘌呤核苷酸分解代謝的另一種關鍵酶。本研究發現CUMS抑郁大鼠PBMCs中的表達顯著升高。Herken等[49]發現抑郁癥患者血清中Xdh水平顯著升高。在反復抑郁發作患者死后的腦組織中，在皮質邊緣丘腦紋狀體區域檢測到Xdh活性增加[50]。Xdh催化次黃嘌呤和黃嘌呤氧化過程會產生活性氧和過氧化氫等[51]，從而導致以氧化應激和炎癥為特征的病理反應[52-53]。一項在人類和小鼠巨噬細胞中進行的研究表明，Xdh引起的活性氧生成是促進Nod樣受體蛋白3（Nod-like receptor protein 3，NLRP3）活化的主要來源[54]。抑郁癥的發病機制與氧化應激相關酶活性的變化和炎癥反應密切相關。Gürbüz等[55]使用Xdh抑制劑阿洛普利諾與經典抗抑郁藥氟西汀作比較，發現使用Xdh抑制劑阿洛普利諾后抑郁大鼠的強迫游泳不動時間明顯減少，與氟西汀的抗抑郁效果一致。本研究結果顯示，給予柴歸顆粒后，的表達水平顯著降低，柴歸顆粒有改善抑郁癥的作用。綜上推斷，抑郁發生時Xdh水平升高引起活性氧的生成，可能進一步促進NLRP3活化，調控下游信號通路，從而導致氧化應激和炎癥為特征的病理狀態。而柴歸顆粒是否通過這一作用機制發揮抗抑郁需要進一步研究驗證。

此外，目前已經發現嘌呤能系統在抑郁癥發病機制中占有重要地位，通過調控嘌呤能系統可有效改善抑郁癥[56-59]。嘌呤能受體（腺苷P1受體中A1、A2A亞型與ATP結合的P2受體中P2X7亞型）與抑郁癥誘發神經炎癥緊密相關[60-62]。研究顯示P2rX7主要位于興奮性細胞膜、神經元和平滑肌中，也存在于粒細胞、淋巴細胞、肥大細胞和單核細胞中[63]。隨著抑郁發病機制的不斷研究，已證明抑郁癥機體中嘌呤能P2X7受體是一種成熟的炎癥小體激活劑，不僅可以激活NLRP3炎癥小體，還會促進炎癥因子的釋放，P2X7受體已被公認為炎癥反應的調節因子[64-66]。本研究發現抑郁大鼠PBMCs中和的表達水平顯著升高，給予柴歸顆粒后，它們的表達水平顯著降低。提示抑郁癥的發生與炎癥反應密切相關，柴歸顆粒能夠調控，減少炎癥因子的釋放，從而發揮抗抑郁作用。但還需要進一步驗證該通路蛋白的表達情況，明確柴歸顆?？挂钟舻淖饔脵C制。

綜上所述，柴歸顆粒對抑郁大鼠有明顯的改善作用，其作用機制與調節嘌呤代謝途徑上的基因及嘌呤能受體和炎癥因子有關，為后續柴歸顆?？挂钟糇饔脵C制的深入研究提供了基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] GBD Disease and Injury Incidence and Prevalence Collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990—2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017 [J]., 2018, 392(10159): 1789-1858.

[2] 于冰清, 邵欣欣, 付曉凡, 等. 抗抑郁中藥復方的組方特點及作用機制研究 [J]. 中草藥, 2021, 52(11): 3344-3352.

[3] 馬小雅, 丁敏芮, 施俠威, 等. 中藥復方辨證治療抑郁癥的現代數據研究 [J]. 世界科學技術—中醫藥現代化, 2019, 21(7): 1418-1423.

[4] 劉歡. 復方柴歸方抗抑郁藥效研究 [D]. 太原: 山西大學, 2016.

[5] 張瀟. 柴歸方提取物抗抑郁藥效特點研究 [D]. 太原: 山西大學, 2017.

[6] 許騰, 張瀟, 高耀, 等. 柴歸顆粒對抑郁癥伴發癥狀的改善作用研究[J]. 中草藥, 2019, 50(16): 3846-3851.

[7] 趙映霞, 許騰, 田俊生, 等. 柴歸顆粒對慢性不可預知溫和刺激抑郁大鼠模型腸道菌群的作用[J]. 中草藥, 2021, 52(3): 736-743.

[8] 秦雪梅, 高耀, 田俊生, 等. 從柴胡藥材質量評價到抗抑郁新藥開發的研究思路與策略 [J]. 藥學學報, 2019, 54(8): 1402-1408.

[9] Grosse L, Carvalho L A, Birkenhager T K,. Circulating cytotoxic T cells and natural killer cells as potential predictors for antidepressant response in melancholic depression. Restoration of T regulatory cell populations after antidepressant therapy [J].(Berl), 2016, 233(9): 1679-1688.

[10] Wolkowitz O M, Mellon S H, Epel E S,. Resting leukocyte telomerase activity is elevated in major depression and predicts treatment response [J]., 2012, 17(2): 164-172.

[11] Stapel B, Gorinski N, Gmahl N,. Fluoxetine induces glucose uptake and modifies glucose transporter palmitoylation in human peripheral blood mononuclear cells [J]., 2019, 23(10): 883-891.

[12] 崔雪蓮. 抑郁癥外周血單核細胞中差異性表達lncRNA的臨床和實驗研究 [D]. 南京: 南京醫科大學, 2018.

[13] Beech R D, Lowthert L, Leffert J J,. Increased peripheral blood expression of electron transport chain genes in bipolar depression [J]., 2010, 12(8): 813-824.

[14] Pan D Q, Xu Y M, Zhang L,. Gene expression profile in peripheral blood mononuclear cells of postpartum depression patients [J]., 2018, 8(1): 10139.

[15] Wigner P, Synowiec E, Jó?wiak P,. The impact of chronic mild stress and agomelatine treatment on the expression level and methylation status of genes involved in tryptophan catabolic pathway in PBMCs and brain structures [J].(), 2020, 11(9): E1093.

[16] Hung Y Y, Wu M K, Tsai M C,. Aberrant expression of intracellular let-7e, miR-146a, and miR-155 correlates with severity of depression in patients with major depressive disorder and is ameliorated after antidepressant treatment [J]., 2019, 8(7): E647.

[17] Hung Y Y. Antidepressants improve negative regulation of toll-like receptor signaling in monocytes from patients with major depression [J]., 2018, 25(1): 42-48.

[18] Xie B, Chen Y, Zhang S,. The expression of P2X7 receptors on peripheral blood mononuclear cells in patients with primary Sj?gren’s syndrome and its correlation with anxiety and depression [J]., 2014, 32(3): 354-360.

[19] Felger J C, Cole S W, Pace T W,. Molecular signatures of peripheral blood mononuclear cells during chronic interferon-α treatment: Relationship with depression and fatigue [J]., 2012, 42(8): 1591-1603.

[20] Alam F, Nayyar S, Richie W,. Beta-Arrestin1 levels in mononuclear leukocytes support depression scores for women with premenstrual dysphoric disorder [J]., 2015, 13(1): ijerph13010043.

[21] Spampinato S F, Merlo S, Fagone E,. Astrocytes modify migration of PBMCs induced by β-amyloid in a blood-brain barriermodel [J]., 2019, 13: 337.

[22] Labus J, W?ltje K, Stolte K N,. IL-1β promotes transendothelial migration of PBMCs by upregulation of the FN/α5β1signalling pathway in immortalised human brain microvascular endothelial cells [J]., 2018, 373(1/2): 99-111.

[23] Woelk C H, Singhania A, Pérez-Santiago J,. The utility of gene expression in blood cells for diagnosing neuropsychiatric disorders [J]., 2011, 101: 41-63.

[24] Liang Y, Ridzon D, Wong L,. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues [J]., 2007, 8: 166.

[25] He S, Liu X H, Jiang K D,. Alterations of microRNA-124 expression in peripheral blood mononuclear cells in pre- and post-treatment patients with major depressive disorder [J]., 2016, 78: 65-71.

[26] Li J, Tang G, Cheng K,. Peripheral blood mononuclear cell-based metabolomic profiling of a chronic unpredictable mild stress rat model of depression [J]., 2014, 10(11): 2994-3001.

[27] 趙玉嬌. 柴歸顆粒制劑成型工藝與質量標準研究 [D]. 太原: 山西大學, 2018.

[28] 宮文龍. 柴歸顆粒中柴胡皂苷含量測定方法修訂及影響成分含量與轉化的因素研究 [D]. 太原: 山西大學, 2021.

[29] Gong W X, Zhu S W, Chen C C,. The anti-depression effect ofis related to the pharmacological activity of modulating the hematological anomalies [J]., 2019, 10: 192.

[30] Figueroa-Hall L K, Paulus M P, Savitz J. Toll-like receptor signaling in depression [J]., 2020, 121: 104843.

[31] Fabbri C, Marsano A, Albani D,.gene: A putative modulator of antidepressant response through the B-cell receptor signaling pathway [J]., 2014, 14(5): 463-472.

[32] Shariq A S, Brietzke E, Rosenblat J D,. Therapeutic potential of JAK/STAT pathway modulation in mood disorders [J]., 2018, 30(1): 1-7.

[33] Willner P. Validity, reliability and utility of the chronic mild stress model of depression: A 10-year review and evaluation [J].(), 1997, 134(4): 319-329.

[34] Agren H, Niklasson F, H?llgren R. Brain purinergic activity linked with depressive symptomatology: Hypoxanthine and xanthine in CSF of patients with major depressive disorders [J]., 1983, 9(3): 179-189.

[35] Niklasson F, Agren H, H?llgren R. Purine and monoamine metabolites in cerebrospinal fluid: Parallel purinergic and monoaminergic activation in depressive illness? [J]., 1983, 46(3): 255-260.

[36] Ali-Sisto T, Tolmunen T, Toffol E,. Purine metabolism is dysregulated in patients with major depressive disorder [J]., 2016, 70: 25-32.

[37] Zhou X Y, Liu L X, Lan X H,. Polyunsaturated fatty acids metabolism, purine metabolism and inosine as potential independent diagnostic biomarkers for major depressive disorder in children and adolescents [J]., 2019, 24(10): 1478-1488.

[38] Giblett E R, Ammann A J, Wara D W,. Nucleoside-phosphorylase deficiency in a child with severely defective T-cell immunity and normal B-cell immunity [J]., 1975, 1(7914): 1010-1013.

[39] Markert M L. Purine nucleoside phosphorylase deficiency [J]., 1991, 3(1): 45-81.

[40] Al-Haj L, Khabar K S A. The intracellular pyrimidine 5′-nucleotidase NT5C3A is a negative epigenetic factor in interferon and cytokine signaling [J]., 2018, 11(518): eaal2434.

[41] Franco R, Pacheco R, Gatell J M,. Enzymatic and extraenzymatic role of adenosine deaminase 1 in T-cell-dendritic cell contacts and in alterations of the immune function [J]., 2007, 27(6): 495-509.

[42] Takhshid M A, Zahediannejad Z, Aboualizadeh F,. G22A polymorphism of adenosine deaminase and its association with biochemical characteristics of gestational diabetes mellitus in an Iranian population [J]., 2015, 40(2): 170-174.

[43] Dong R P, Kameoka J, Hegen M,. Characterization of adenosine deaminase binding to human CD26 on T cells and its biologic role in immune response [J]., 1996, 156(4): 1349-1355.

[44] Jadhav A A, Jain A. Adenosine deaminase activity in normal pregnancy and pregnancy associated disorders [J]., 2013, 119(2): 88-91.

[45] Mishra O P, Gupta B L, Ali Z,. Adenosine deaminase activity in typhoid fever [J]., 1994, 31(11): 1379-1384.

[46] Santosh U P, Renukananda G S, Abhilash S. Role of adenosine deaminase in common chronic ENT infections [J]., 2016, 10(3): MC01-MC02.

[47] Elgün S, Keskinege A, Kumbasar H. Dipeptidyl peptidase IV and adenosine deaminase activity. Decrease in depression [J]., 1999, 24(8): 823-832.

[48] Lindquist B E, Shuttleworth C W. Evidence that adenosine contributes to Leao’s spreading depression[J]., 2017, 37(5): 1656-1669.

[49] Herken H, Gurel A, Selek S,. Adenosine deaminase, nitric oxide, superoxide dismutase, and xanthine oxidase in patients with major depression: Impact of antidepressant treatment [J]., 2007, 38(2): 247-252.

[50] Michel T M, Camara S, Tatschner T,. Increased xanthine oxidase in the thalamus and putamen in depression [J]., 2010, 11(2 Pt 2): 314-320.

[51] Harrison R. Physiological roles of xanthine oxidoreductase [J]., 2004, 36(2): 363-375.

[52] Nakai K, Kadiiska M B, Jiang J J,. Free radical production requires both inducible nitric oxide synthase and xanthine oxidase in LPS-treated skin [J]., 2006, 103(12): 4616-4621.

[53] Hassoun P M, Yu F S, Cote C G,. Upregulation of xanthine oxidase by lipopolysaccharide, interleukin-1, and hypoxia. Role in acute lung injury [J]., 1998, 158(1): 299-305.

[54] Ives A, Nomura J, Martinon F,. Xanthine oxidoreductase regulates macrophage IL1β secretion upon NLRP3 inflammasome activation [J]., 2015, 6: 6555.

[55] Gürbüz ?zgür B, Aksu H, Birincio?lu M,. Antidepressant-like effects of the xanthine oxidase enzyme inhibitor allopurinol in rats. A comparison with fluoxetine [J]., 2015, 138: 91-95.

[56] Ribeiro D E, Roncalho A L, Glaser T,. P2X7 receptor signaling in stress and depression [J]., 2019, 20(11): E2778.

[57] Wang P, Jia J D, Zhang D. Purinergic signalling in liver diseases: Pathological functions and therapeutic opportunities [J]., 2020, 2(6): 100165.

[58] Ballesteros-Yá?ez I, Castillo C A, Merighi S,. The role of adenosine receptors in psychostimulant addiction [J]., 2017, 8: 985.

[59] 陳佳俊, 秦雪梅, 杜冠華, 等. 基于嘌呤能系統及嘌呤代謝的抑郁癥發病機制研究進展 [J]. 藥學學報, 2021, 56(9): 2464-2471.

[60] Leem Y H, Jang J H, Park J S,. Exercise exerts an anxiolytic effect against repeated restraint stress through 5-HT2A-mediated suppression of the adenosine A2Areceptor in the basolateral amygdala [J]., 2019, 108: 182-189.

[61] Rombo D M, Dias R B, Duarte S T,. Adenosine A1 receptor suppresses tonic GABAA receptor currents in hippocampal pyramidal cells and in a defined subpopulation of interneurons [J]., 2016, 26(3): 1081-1095.

[62] Manzoni O J, Manabe T, Nicoll R A. Release of adenosine by activation of NMDA receptors in the hippocampus [J]., 1994, 265(5181): 2098-2101.

[63] Abbracchio M P, Burnstock G, Verkhratsky A,. Purinergic signalling in the nervous system: An overview [J]., 2009, 32(1): 19-29.

[64] di Virgilio F, Schmalzing G, Markwardt F. The elusive P2X7 macropore [J]., 2018, 28(5): 392-404.

[65] Su W J, Zhang T, Jiang C L,. Clemastine alleviates depressive-like behavior through reversing the imbalance of microglia-related pro-inflammatory state in mouse hippocampus [J]., 2018, 12: 412.

[66] Li K W, Yan L, Zhang Y P,. Seahorse treatment improves depression-like behavior in mice exposed to CUMS through reducing inflammation/oxidants and restoring neurotransmitter and neurotrophin function [J]., 2020, 250: 112487.

Antidepressant mechanism of Chaigui Granules based on transcriptomics of peripheral blood mononuclear cells

WANG Li-wen1, 2, 3, HUANG De-hua1, 2, 3, TIAN Jun-sheng1, 2, 3, GAO Xiao-xia1, 2, 3, QIN Xue-mei1, 2, 3, DU Guan-hua1, 4, ZHOU Yu-zhi1, 2, 3

1. Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, Shanxi University, Taiyuan 030006, China 2. The Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education, Shanxi University, Taiyuan 030006, China 3. The Key Laboratory of Effective Substances Research and Utilization in TCM of Shanxi Province, Taiyuan 030006, China 4. Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

To analyze the transcriptomic characteristics of Chaigui Granules (柴歸顆粒) on peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of rats with chronic unpredictable mild stress (CUMS) model by RNA sequencing (RNA-seq), qRT-PCR was used to verify the mechanism.Rats were randomly divided into control group, model group, venlafaxine hydrochloride (35 mg/kg)group, and Chaigui Granules low-, medium- and high-dose (4.2, 8.3, 16.6 g/kg)groups. Rats were given drugs for 28 d while modeling. The efficacy of Chaigui Granules was evaluated through traditional pharmacodynamic indicators for depression (body weight, open field test, sugar water preference test and forced swimming test). RNA-seq technology was used to perform transcriptome sequencing analysis on rat PBMCs, screen for differential genes, and perform Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) analysis; The key expressed genes screened out were verified experimentally by qRT-PCR.Behavioral indicators showed that Chaigui Granules significantly improved the depressive behavior of CUMS model rats. Enrichment analysis of KEGG pathway in transcriptomics showed that when depression occurs after the intervention of Chaigui Granules, purine metabolism pathway was significantly enriched. Therefore, in-depth research was conducted on gene expression of metabolic enzymes related to purine metabolism. qRT-PCR results showed that compared with model group, expression levels of ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 3 (), cytosolic-5′-nucleotidase IIIA(), purine nucleoside phosphorylase() and adenosine deaminase() mRNA in PBMCs of Chaigui Granules group were significantly increased (< 0.05, 0.01, 0.001), expression levels of xanthine dehydrogenase/oxidase(), purinergic receptor P2X7 (), interleukin 1β ()mRNA were significantly decreased (< 0.05, 0.01).Chaigui Granules has antidepressant effects, its mechanism is related to the regulation of genes in purine metabolism pathway, purinergic receptorand inflammatory factor.

Chaigui Granules; chronic unpredictable mild stress depression; peripheral blood mononuclear cells; transcriptomics; purine metabolism

R285.5

A

0253 - 2670(2022)07 - 2031 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.07.012

2021-12-02

國家自然科學基金資助項目（82074323）；國家自然科學基金資助項目（81673572）；國家“重大新藥創制”科技重大專項（2017ZX09301047）；山西省留學回國人員科技活動擇優資助項目（201991）；山西省回國留學人員科研資助項目（2020019）

王力文，男，碩士研究生，研究方向為中藥藥理作用機制研究。E-mail: 18434375989@163.com

周玉枝，女，博士，教授，博士生導師，研究方向為中藥藥效物質基礎及作用機制研究。E-mail: zhouyuzhi@sxu.edu.cn

[責任編輯 李亞楠]