支氣管肺泡灌洗液中性粒細胞比例對于肺部細菌感染的診斷價值

陶 毅，王凱飛，宋立成，付 晗，宋雨薇，薛少云，解立新 解放軍醫學院，北京 0085； 解放軍總醫院 呼吸與危重癥醫學部，北京 0009； 張家口市肺科醫院，河北張家口 075000

根據世界衛生組織2019年全球衛生估計報告，下呼吸道感染是全球最致命的感染性疾病，也是2019年全球第四大死因[1]。對于下呼吸道感染，特別是醫院獲得性肺炎，最常見的感染病原體為細菌，包括鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌等[2]。因此下呼吸道感染的診治首先要明確是否細菌感染。隨著纖維支氣管鏡的發展，支氣管肺泡灌洗逐漸被引入臨床實踐中[3-4]?；颊邔χ夤芊闻莨嘞茨褪苄院?，并發癥相對較少。支氣管肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid，BALF)標本又被稱為“液體活檢”，是在反映下呼吸道、遠端氣道和肺泡生理病理狀態的同時提示可能感染病原體的珍貴標本[5-6]。然而，由于支氣管肺泡灌洗操作過程中污染或環境細菌定植等原因，BALF中觀察到的細菌是否為感染病原體仍有待商榷。正常人BALF細胞分類中中性粒細胞≤3%，在難治性哮喘、慢性支氣管炎、特發性肺纖維化等疾病中，中性粒比例可升高。目前國內外研究對于肺部細菌感染患者BALF中細胞比例特點尚無統一標準[6-8]。因此，本研究回顧性總結肺部細菌感染患者BALF細胞分類特點，分析BALF分類計數中中性粒細胞比例對于下呼吸道細菌感染的診斷價值。

資料與方法

1 資料來源 選取 2018 年 1 月- 2020 年 12 月解放軍總醫院第一醫學中心送檢BALF細胞分類計數的患者資料。入選標準：1)性別不限，年齡≥18歲；2)曾行床旁支氣管肺泡灌洗并留取標本送檢細胞分類計數；3)胸部CT提示肺部陰影。排除標準：1)胸部CT提示肺間質性病變；2)既往有血液系統疾??；3)BALF標本質量不合格：鱗狀上皮≥5%或柱狀上皮≥20%或BALF量少于5 mL；4)臨床病歷資料不完整。

2 BALF 細胞分類計數方法 1)按指南中推薦的標準流程采集BALF[8]，標本送至實驗室后立即處理。先觀察并記錄灌洗液的性狀、顏色和總量，如含黏液成分，用無菌紗布過濾或0.1%二硫蘇糖醇溶解后處理；2)將上述BALF于4℃ 下 250 ~300 g離心10 min，留取上清液用作可溶性成分檢測，以 3 ~ 5 mL 0.9% 氯化鈉注射液重懸細胞沉淀制成細胞懸液；3)用計數板計算細胞總數，若細胞數過高，可用0.9%氯化鈉注射液稀釋調整為5×106/mL；4)將充分重懸的細胞懸液 50 μL 滴于載玻片上，載玻片冷風干燥后，用蘇木精-伊紅染色法 (hematoxylin-eosin staining，HE)染色；5)先在光學顯微鏡低倍視野(小于40×)下觀察整片，然后在高倍視野(40×及以上)下進行細胞分類與計數，計數至少400個細胞。典型BALF標本1 000倍油鏡下表現見圖1。

圖1 BALF標本細胞分類1 000×油鏡下表現A：BALF標本鏡下表現；B：質量差的BALF標本鏡下表現；C：肺部細菌感染患者BALF標本鏡下表現；D：嗜酸性粒細胞肺炎患者BALF標本鏡下表現Fig.1 The BALF cell patterns under 1 000× oil microscope A: cell pattern of qualified BALF specimen; B: cell pattern of unqualified BALF specimen; C: cell pattern of BALF specimen indicating pulmonary bacterial infection; D: cell pattern of BALF specimen indicating eosinophilic pneumonia

3 分組及分析指標 根據患者最終臨床診斷分為細菌感染組與非細菌感染組。BALF細菌培養陽性、最終診斷為支原體、衣原體等非典型病原體及結核感染的肺炎患者可診斷為肺部細菌感染，根據患者的臨床表現，結合影像學、實驗室病原學檢查以及抗菌藥物應答情況判斷治療效果，明確患者最終臨床診斷。依據2018年中國成人醫院獲得性肺炎與呼吸機相關性肺炎診斷和治療指南[2]，肺炎定義為胸部X線檢查或CT檢查顯示新出現的或進展性的浸潤影、實變影或磨玻璃影，加上下列3種臨床癥狀中的2種或以上，可建立臨床診斷：1)發熱，體溫＞38℃；2)膿性氣道分泌物；3)外周血白細胞＞10×109/L或＜4×109/L。分析指標：對兩組患者BALF中巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞比例進行統計分析。

4 統計學分析 采用 SPSS23.0 統計軟件。正態計量資料以±s表示，組間比較采用成組t檢驗。偏態計量資料采用中位數Md(IQR)表示，組間比較采用成組秩檢驗。計數資料比較采用χ2檢驗或精確概率檢驗。采用ROC曲線分析BALF中性粒細胞比例對于肺部細菌感染的診斷價值。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 納入標本的患者信息資料比較結果 納入141份標本，其中細菌感染組109例，包括男性70例，女性39例，年齡(65±16)歲；非細菌感染組32例，其中男性22例，女性10例，年齡(61±17)歲，兩組患者性別、年齡、基礎疾病分布差異均無統計學意義(P＞0.05)(表1)。最終診斷為肺部細菌感染109例，非細菌感染32例，其中非細菌感染組中，單純肺部真菌感染7例，支氣管擴張1例，結節病1例，復發性多軟骨炎1例，肺淋巴管肌瘤病1例，哮喘1例，多漿膜腔積液1例，急性肺水腫1例，肺部陰影性質不明18例。

表1 患者基線資料Tab.1 Baseline characteristics of the patients

2 兩組 BALF 細胞分類計數比較 細菌感染組中性粒細胞比例為47.0(25.7，86.1)%，非細菌感染組為9.6(3.7，26.1)%，差異有統計學意義(P<0.001)。同時兩組巨噬細胞比例、淋巴細胞比例差異有統計學意義，嗜酸性粒細胞比例差異無統計學意義(表2)。

表2 細菌感染組與非細菌感染組BALF細胞分類結果(%)Tab.2 BALF cell classification results of the bacterial infection group and the non-bacterial infection group (%)

3 中性粒細胞比例診斷肺部細菌感染的敏感度與特異性 進一步探討中性粒細胞比例對肺部細菌感染的診斷效能。以細菌感染組109例為陽性樣本，以非細菌感染32例為陰性樣本，建立受試者工作特征曲線 (receiver operation characteristic，ROC)診斷分析模型。以軟件擬合之ROC曲線讀取約登指數最大值點，對應計算理論閾值和各項參數。并按實測樣本計算敏感度、特異性、準確度。結果顯示： BALF中性粒細胞比例診斷肺部細菌感染的閾值為25%，敏感度為0.844，特異性為0.969，ROC曲線下面積為0.899(表3，圖2)。

表3 ROC分析結果Tab.3 ROC analysis results

圖2 中性粒細胞比例診斷肺部細菌感染ROC分析Fig.2 ROC analysis of neutrophil ratio in the diagnosis of pulmonary bacterial infection

討 論

肺炎主要分為社區獲得性肺炎與醫院獲得性肺炎，兩者在致病菌譜、潛在耐藥菌和多重耐藥菌感染風險、抗菌藥物選擇等方面存在明顯差異[9]。社區獲得性肺炎的重要致病原為肺炎支原體和肺炎鏈球菌，而醫院獲得性肺炎常見的病原菌包括鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌等[2,10]。目前臨床常見的病原微生物檢測方法主要包括直接涂片鏡檢、分離培養、免疫學和核酸檢測以及敏感度較高的宏基因組二代測序技術(metagenomics next generation sequencing，mNGS)[11]。而涂片鏡檢無法判斷鏡下細菌是感染還是定植或污染，分離培養、mNGS等所需時間較長(至少2 d)，無法第一時間指導危重癥患者治療方案，且常規革蘭染色和體液培養的陽性率一般低于60%，導致病情延誤，診斷不明確[12-14]。而BALF細胞分類計數2 ~3 h 內即可完成。

本研究分析發現，相比于非肺部細菌感染組，細菌感染組BALF中性粒細胞比例顯著上升。通過ROC分析，中性粒細胞比例診斷肺部細菌感染的閾值為25%，ROC曲線下面積為0.899，具有較高的敏感度和特異性。符合國外文獻中BALF低中性粒細胞比例是排除呼吸機相關性肺炎的依據這一觀點[15]。

中性粒細胞升高對于肺部細菌感染有較強提示意義，但在包括難治性哮喘、慢性支氣管炎、特發性肺纖維化、石棉肺、急性呼吸窘迫綜合征等一系列疾病中，BALF中性粒細胞比例均可見升高。因此BALF中性粒細胞比例升高并不能作為診斷肺部細菌感染的唯一標準，當BALF中性粒細胞比例高于25%時，提示存在肺部細菌感染的可能性大，同時必須結合患者臨床癥狀、影像學特點、既往病史等進行綜合診斷。

本研究排除了近10%的質量差標本，提示臨床工作中須規范化肺泡灌洗操作才能獲得合格的下呼吸道標本。目前大多數臨床實驗室在BALF的細胞學檢查中只報告細胞比例的差異，將微生物學、分子腫瘤學、細胞學交給微生物學、分子生物學和病理實驗室，檢查結果相對延遲，無法第一時間指導危重癥患者治療方案。因此，我們強調細胞學檢查同時應研究異常成分，如真菌、細菌、腫瘤細胞等，即時的檢查結果可提高治療的充分性與及時性?？焖佻F場微生物學評價(microbiological rapid on-site evaluation，M-ROSE)是對下呼吸道標本制片后通過迪夫快速染色、革蘭染色等進行鏡下觀察和判讀[16-18]。目前我科經多年努力建立的床旁病原學M-ROSE體系，能夠在半小時內初步判定床旁下呼吸道標本是否合格，并通過細胞學分類和炎性細胞內病原體甄別初步判定是否存在感染以及感染的致病原，在較短時間內完成BALF的細胞學與病原學初步分析[19]。未來，M-ROSE技術可能是改善BALF質量，快速精準診斷指導臨床重癥肺炎個體化治療和合理使用抗生素的關鍵。

綜上所述，BALF中性粒細胞比例超過25%對于肺部細菌感染有較強的提示價值，但仍需結合患者臨床癥狀、影像學特點、既往病史等進行綜合評價。同時本研究為回顧性研究，仍需多中心前瞻性研究進一步驗證。