miR-22-5P靶向調控相關信號通路對毛囊干細胞增殖和分化的影響

嚴其高 祁冰潔 劉慧娟 劉金林 劉 毅

安慶醫藥高等?？茖W校，安徽安慶 246052

迄今為止，毛囊再生的機制尚未完全闡明，“隆突激活學說”認為，休止期末的毛乳頭緊鄰毛囊干細胞并向其釋放激活信號，毛囊干細胞激活而啟動后，毛囊由休止期進入生長期［1］。毛囊干細胞具有較強的自我更新和多向分化潛能，可以形成毛囊，也可以參與到表皮的更新過程中，對于毛囊的周期性生長、毛囊再生、皮膚傷口修復均具有重要作用［2］。由此可見，關于毛囊干細胞增殖、遷移、分化的研究是探討毛囊周期性發育調控的基礎。微小核糖核酸（MicroRNA，miRNA）通過結合靶基因3＇UTR 區域并發揮降解信使（mRNA）作用，同時抑制翻譯進程，從而調控靶基因表達的非編碼miRNA［3］。以往研究毛囊干細胞增殖分化過程的文獻，主要通過單一“轉錄組”進行相關研究，關于miRNA與mRNA之間相互關系的研究較少，關于調節毛囊干細胞增殖分化的miRNA 以及探討miRNA在毛囊干細胞增殖分化過程中相關分子機制的研究均較少。因此本研究探討miR-22-5P對毛囊干細胞增殖和分化的影響，并通過檢測相關信號通路的關鍵蛋白，分析在毛囊干細胞周期循環中miR-22-5P的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞：來自于內蒙古自治區生物制造重點實驗室分離純化的內蒙古絨山羊毛囊干細胞所建立的P3代絨山羊毛囊干細胞系。

試劑：高糖DMEM培養基、10%胎牛血清、胰蛋白酶購于美國Gibco 公司；CCK8、EdU、細胞周期檢測試劑盒購于上海生工有限公司；定量聚合酶鏈反應（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）檢測試劑盒購于美國Thermo Fisher 公司；Western blot檢測所用抗體及相關試劑盒均購于美國Bioworld公司。

儀器：PCR儀、酶標儀、超凈工作臺、CO2恒溫培養箱為美國Thermo 公司生產；冷凍離心機、高速離心機、PCR 基因擴增儀為美國BD bioscience 公司生產；電泳儀、核酸定量儀為美國Bio-Rad 公司生產。凝膠成像系統為美國Bio-Rad公司產品。熒光顯微鏡、倒置顯微鏡為美國AMG公司生產。

1.2 細胞處理及分組

將P3 代毛囊干細胞置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中，當細胞生長到60% ~ 70%匯合時，應用0.25%胰蛋白酶將細胞消化為單細胞懸液，加入24 孔板中，每孔1 × 104個細胞接種。置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養，當細胞生長貼壁后進行分組。分為空白對照組、空白轉染組、miR-22-5P轉染組?？瞻讓φ战M未作處理；空白轉染組使用miR-NC 轉 染；miR-22-5P 轉 染 組 使 用miR-22-5P mimics進行轉染。具體轉染步驟如下：將接種于24孔板中的毛囊干細胞加入配置好的轉染劑，于37 ℃、5% CO2條件下培養6 h。吸出轉染試劑后，RPMI 1640細胞培養液繼續培養48 h。

1.3 方法

1.3.1 CCK8 檢測毛囊干細胞增殖活性 收集各組對數生長期毛囊干細胞，將1×104個細胞接種于96孔板中，分別于接種后24 h向各孔中加入CCK-8溶液，37 ℃培養24 h，振蕩混勻，酶標儀上讀取450 nm波長處吸光光度值（optical density，OD）。根據以下公式計算細胞活力值。實驗重復3次。

細胞活力（%）=［A（處理組）-A（空白組）］/［A（未處理組）-A（空白組）］×100%。

1.3.2 EdU 實驗檢測毛囊干細胞增殖情況 收集各組對數生長期毛囊干細胞，接種至24 孔板中，去除培養基后，經4%多聚甲醛固定15 min，0.3%TritonX-100 作用15 min，加入EdU 檢測試劑盒中的反應液，37 ℃避光孵育30 min，復染后，熒光顯微鏡拍照。經Image J軟件進行細胞計數，通過計算EdU陽性細胞比值分析細胞增殖情況。實驗重復3次。

1.3.3 流式細胞法進行細胞周期檢測 收集各組對數生長期毛囊干細胞，按照細胞周期檢測試劑盒步驟進行處理，經流式細胞儀檢測各組細胞所處周期情況。實驗重復3次。

1.3.4 qPCR法檢測細胞增殖及分化標志物mRNA水平 以β-actin作為內參基因，采用qPCR 法檢測各組細胞中的細胞增殖標志物（KI67、PCNA）、細胞增殖經典通路標志物（AKT、mTOR）、細胞分化標志物（K6、S100A3）、細胞分化經典通路標志物（Notch1、β-catenin）的mRNA水平。實驗重復3次。

按照Trizol 試劑盒中說明書的步驟提取總RNA，標記后進行芯片雜交，選取芯片結果中KI67、PCNA、AKT、mTOR、K6、S100A3、Notch1、β-catenin進行熒光定量PCR 分析。應用反轉錄試劑盒合成環狀DNA，反應條件：變性（95 ℃，10 s）→退火（60 ℃，20 s）→延伸（70 ℃，10 s），共計40 個循環。引物的設計與合成來自生工生物工程（上海）股份有限公司，各基因的引物序列見表1。2-△△Ct法計算KI67、PCNA、AKT、mTOR、K6、S100A3、Notch1、β-catenin的相對表達量。

表1 擴增基因及引物序列

1.3.5 Western blot檢測細胞增殖及分化標志物蛋白水平 采用RIPA 裂解緩沖液提取細胞或組織蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，取上樣緩沖液與樣品混合并置于95 ℃變性l0 min。蛋白樣品以每孔50μg加到10%SDS-PAGE中電泳分離蛋白，將蛋白轉到PVDF膜上后，5%脫脂奶粉封閉2 h。將抗體（1∶1 000）加入至PVDF膜，β-actin為內參。4 ℃過夜。棄一抗，加入1∶1 000 稀釋的辣根過氧化物酶標記二抗，室溫孵育1 h。棄二抗。ECL 化學發光劑顯色，暗室下顯影。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 CCK8實驗檢測各組毛囊干細胞增殖情況

CCK8實驗檢測結果顯示，miR-22-5P mimics 轉染毛囊干細胞后，細胞增殖能力明顯減弱，miR-22-5P轉染組的細胞活力值明顯低于空白對照組、空白轉染組，差異有統計學意義（P＜0.05）。說明上調miR-22-5P對毛囊干細胞具有增殖抑制作用。見表2。

表2 CCK8實驗檢測過表達miR-22-5P對毛囊干細胞增殖的影響（±s）

2.2 EdU實驗檢測各組毛囊干細胞增殖情況

EdU 實驗檢測結果顯示，miR-22-5P mimics 轉染毛囊干細胞后，細胞增殖能力明顯減弱，miR-22-5P轉染組的細胞增殖比明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。說明上調miR-22-5P 對毛囊干細胞具有增殖抑制作用。見表3。

表3 EdU實驗檢測過表達miR-22-5P對毛囊干細胞增殖的影響（±s）

2.3 流式細胞法檢測各組毛囊干細胞所處周期分布情況

經流式細胞儀檢測各組毛囊干細胞所處周期分布情況，見表4。miR-22-5P轉染后，處于S期的毛囊干細胞比例較空白對照組、空白轉染組明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05）；處于G0~G1期的毛囊干細胞比例較空白對照組、空白轉染組明顯增加（P＜0.05）。結果表明，過表達miR-22-5P 能夠使毛囊干細胞阻滯于G0~G1期。

表4 流式細胞法檢測各組毛囊干細胞所處周期分布情況（±s，%）

2.4 qPCR 法檢測各組增殖相關基因mRNA 表達水平

miR-22-5P 轉染毛囊干細胞后，KI67、PCNA、AKT的mRNA 表達水平均顯著低于空白對照組、空白轉染組，差異有統計學意義（P＜0.05）。各組毛囊干細胞中mTOR的mRNA 表達量基本相當，差異無統計學意義（P＞0.05），詳見表5。

表5 qPCR法檢測各組增殖相關基因mRNA表達水平（±s）

2.5 Western blot檢測各組增殖相關蛋白表達量

Western blot 實驗檢測毛囊干細胞增殖過程中相關蛋白的表達量，見圖1。miR-22-5P 轉染組KI67、PCNA、AKT 蛋白表達量明顯低于空白對照組、空白轉染組，表明miR-22-5P 能夠激活AKT 通路，對毛囊干細胞的增殖發揮抑制作用。

A：空白對照組；B：空白轉染組；C：miR-22-5P轉染組

2.6 qPCR 法檢測各組細胞分化標志物mRNA 表達水平

如表6 所示，miR-22-5P 轉染毛囊干細胞后，K6、S100A3、Notch1的mRNA 表達水平均顯著高于空白對照組、空白轉染組，差異有統計學意義（P＜0.05）。各組毛囊干細胞中β-catenin的mRNA 表達量基本相當，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表6 qPCR法檢測各組細胞分化標志物mRNA表達水平（±s）

2.7 Western blot檢測各組分化相關蛋白表達量

Western blot 實驗檢測毛囊干細胞分化過程中相關蛋白的表達量，見圖2。miR-22-5P 轉染組K6、S100A3、Notch 蛋白表達量明顯高于空白對照組、空白轉染組，差異有統計學意義（P＜0.05），表明miR-22-5P 能夠激活Notch 通路，誘導毛囊干細胞向毛囊分化。

A：空白對照組；B：空白轉染組；C：miR-22-5P轉染組

3 討 論

有研究通過聯合分析絨山羊毛囊各個時期miRNA和mRNA的數據，對調控毛囊周期性生長的關鍵miRNA 進行了篩選，發現miR-1、miR-182、miR-151-3p、miR-143-3p 對毛囊干細胞的增殖分化發揮重要調控作用［4-7］。miR-22-5P是近年來發現的與毛囊干細胞預測靶基因之間存在靶向關系的miRNA，前期有研究對miR-22-5P 的靶向基因進行了預測，結果發現LEF1、Dlx3、Foxn1、Sostdc1等在毛囊的分化過程中發揮重要作用［8-9］。且有研究發現，miR-22-5P 伴隨毛囊的周期變化表達量明顯改變［10］，以上均說明miR-22-5P 在毛囊周期變化中具有潛在的作用，能夠促進毛囊從生長期到退行期的轉變。因此本研究選取miR-22-5P作為研究毛囊干細胞增殖分化調控機制的靶點。

本研究通過CCK8 實驗、EdU 實驗分析了miR-22-5P對毛囊干細胞增殖的影響，結果證實，miR-22-5P mimics轉染毛囊干細胞后，細胞增殖能力明顯減弱，說明上調miR-22-5P 對毛囊干細胞具有增殖抑制作用。流式細胞法檢測了miR-22-5P對毛囊干細胞所處周期分布的影響，數據顯示，轉染miR-22-5P后，處于S 期的毛囊干細胞比例較對照組明顯減少（P＜0.05）；處于G0~G1期的毛囊干細胞比例較對照組明顯增加（P＜0.05）。以上結果表明，過表達miR-22-5P 能夠使毛囊干細胞阻滯于G0 ~ G1 期。進一步證實了miR-22-5P促進毛囊干細胞細胞周期停止，阻止細胞增殖的生物學作用。PI3K/AKT/mTOR 信號通路是調節細胞周期的重要通路［11］；而Wnt/β-catenin 和Notch1 通路是促進毛囊干細胞分化過程的經典通路［12］。本研究通過分析各組增殖標志物（KI67 和PCNA）、增殖相關通路（AKT/mTOR）在mRNA 和蛋白水平的表達，證實了miR-22-5P 能夠激活AKT 通路，對毛囊干細胞的增殖發揮抑制作用。通過分析各組分化標志物（K6、S100A3）、分化相關通路基因（Notch1 和β-catenin）在mRNA 和蛋白水平的表達，證實了miR-22-5P 能夠激活Notch通路，誘導毛囊干細胞向毛囊分化。

綜上所述，本研究通過多種方法檢測了miR-22-5P 對絨山羊毛囊干細胞增殖和分化的影響，發現miR-22-5P的表達增加能夠對毛囊干細胞發揮增殖抑制作用，且可通過激活相關信號通路促進毛囊干細胞向毛囊分化。在后續的研究中，將利用生物學信息分析手段篩選出影響毛囊干細胞增殖和分化的其他miRNA和關鍵基因，進一步闡明毛囊干細胞增殖分化調控的相關機制和調節靶點。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突