嗅鞘細胞移植對脊髓損傷大鼠Wnt/β-catenin信號分子影響

馮 芮潘 飛王曉玉陳浩月陳悅霞鄭遵成

1.山東第一醫科大學（山東省醫學科學院），山東泰安 271016；2.東平縣中醫院，山東泰安 271500；3.東平縣人民醫院，山東泰安 271500；4.泰安市中心醫院，山東泰安 271000

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是當今社會致殘的主要原因之一［1］，臨床治療及康復效果欠佳，損傷后的功能障礙多由原發性機械損傷、繼發性細胞死亡、反應性膠質增生和受損軸突再生能力差等多種因素引起［2］。脊髓損傷中心多為壞死性神經性死亡，繼發性變化導致損傷周圍組織缺血、缺氧、興奮性毒性等，特別是大量遠離損傷中心的少突膠質細胞的死亡，會導致脫髓鞘和軸突傳導惡化［3］。最終導致病理學上的病變遠遠大于最初的機械性創傷，甚至可能導致某些功能永久性喪失。

嗅鞘細胞（olfactory ensheathing cells，OECs）移植是目前脊髓損傷療效較好的治療方法之一。OECs 存在于中樞和周圍神經中，是一種特殊的在功能上介于雪旺細胞和少突膠質細胞之間的膠質細胞，具有營養神經、抑制膠質增生與瘢痕形成、成鞘等作用，可以為脊髓損傷部位新生軸突生成與神經傳導的建立提供基礎［4］。研究表明Wnt/β-catenin信號通路可能參與成年組織（包括脊髓）的穩態和疾病進展，成年大鼠脊髓中存在大多數Wnt 配體、受體和抑制劑的組成性表達以及活躍的典型Wnt信 號［5-6］。而OECs 移 植 后 是 否 通 過 激 活Wnt/βcatenin 信號通路發揮作用的相關報道較少。本研究旨在通過觀察經OECs移植后大鼠脊髓組織Wnt/β-catenin 信號通路的關鍵分子Wnt-1、β-catenin、GSK-3β、c-myc的表達變化，為脊髓損傷細胞修復提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組

健康成年體質量（180 ± 10）g 雄性SD 大鼠60只，購買于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司［許可證號：SCXK（魯）20190003］，常規飼養1周后隨機分為3組，每組30只，分別為空白組：T9-11椎板去除；損傷組：T10脊髓損傷；移植組：T10脊髓損傷，OECs移植。

1.2 OECs提取與培養

新生3~5 d 乳鼠4 只，采取斷頸取頭法將其處死，逐層剪開乳鼠頭部，將暴露在兩側腦半球前端的橢圓形嗅球用平頭鑷子小心夾出，放入盛有DMEM/F12 培養基的小號培養皿中，眼科剪將嗅球組織剪碎，離心后轉移至6 孔板中，放入37 ℃溫箱中培養，取培養至第三代的細胞進行移植。

1.3 慢病毒標記OECs

采用陰性對照病毒CON077（上海吉凱基因醫學科技股份有限公司）感染OECs。用OECs 完全培養基制備密度為（3~5）×104個/mL的細胞懸液，接種到6 孔板中；37 ℃培養24 h 后更換培養基，并在每孔中加入40μL 感染增強液；37 ℃培養12 h 后更換完全培養基，繼續培養；感染后約72 h，觀察感染效率，進行后續實驗。

1.4 模型制備及細胞移植

10%水合氯醛腹腔注射（0.4 mL/100 g）麻醉，15~20 min后將大鼠俯臥位固定在操作板上，背部剃毛器剃毛，碘伏常規消毒。確定T10水平，實施背側正中切口，切口的長度為3 cm，空白組僅做T10椎板切除，其余兩組在暴露脊髓后采用改良的Allens＇打擊器，在T10脊髓節段打擊脊髓，出現鼠尾擺動表明打擊成功，移植組在損傷脊髓上0.5 cm處用微量進樣器注射1μL密度為1×105/μL的OECs，然后依次縫合各層組織，關閉傷口，無菌敷料予以包扎。術后即刻注射青霉素針（2 萬U/100 g），連續腹腔注射3 d，預防術后感染。造模術后，每只大鼠分籠飼養，保持鼠房的適宜溫度（22 ~ 26 ℃）和空氣濕度（50% ~ 70%），每日2 次人工按摩輔助排尿。如果大鼠意外死亡，模型需重復再造以作補充。在大鼠造模前和造模后7 d、14 d，由兩名不了解本操作和專業的觀察者依據運動功能評分表（basso beattie bresnahan，BBB）對大鼠雙后肢功能進行評分，行BBB評分后提取脊髓組織。。

1.5 定量聚合酶鏈反應（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）測定

3組大鼠每組取15只，分別于移植后1、3、5、7、14 d 冰上處死，每個時間點3 只，采用總RNA-純細胞/組織總RNA分離試劑盒（南京諾唯贊RC-112）從脊髓組織中快速提取總RNA；用HiScriptⅡ一步法RT-PCR試劑盒（南京諾唯贊RC-112）反轉錄cDNA；使用RapidTaqMasterMix（南京諾唯贊P222）進行PCR 引物擴增（Roche 公司，LightCycle96）。引物由鉑尚生物技術（上海）有限公司合成（表1）。

表1 Wnt-1、β-catenin、GSK-3β、c-myc及內參GAPDH引物序列

1.6 免疫組化

3 組大鼠分別于術后7 d 各取3 只，取材（方法同上），4%多聚甲醛常規固定組織，制作冰凍切片，切片按程序進行脫蠟和水化后，內源性過氧化物酶室溫孵育10 min，PBS 溶液重復洗滌3 次，每次3 min；用組化筆在組織周圍畫圈，5%山羊血清在濕盒中室溫封閉30 min；濾紙吸干血清后，將抗NF200一抗（稀釋比例為1∶400）滴入組織，玻片放在濕盒中4 ℃過夜；第二天取出37 ℃復溫45 min，一抗棄掉，PBS溶液重復洗滌5次，每次5 min；濾紙吸干水后37 ℃溫箱二抗孵育30 min；二抗棄掉，PBS 溶液重復洗滌5 次，每次5 min；后用DAB 染色液顯色3 min，蘇木精復染3 min，最后脫水、干燥、中性樹膠封片。

1.7 統計學分析

2 結 果

2.1 OECs的培養鑒定

單個OECs胞體突起變長，呈雙極形或梭形，細胞排列呈柵欄狀或連接成網狀。經慢病毒標記熒光顯微鏡下顯示，OECs 呈綠色細長條狀，胞體飽滿且較大，群集分布。損傷7 d 脊髓熒光顯微鏡下可見組織輪廓，大腦灰質密度均一；經綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標記移植后脊髓灰質內呈現密集分布、顏色較亮、數量較多的OECs。見圖1。

A 為正常培養OECs，比例尺：100μm；B 為慢病毒感染OECs，比例尺：100μm；C 為SCI 后7 d 熒光顯微鏡下脊髓，比例尺：200μm；D 為SCI 后熒光顯微鏡下GFP 標記OECs 移植7 d 脊髓，比例尺：200μm

2.2 BBB評分

移植組術后14 d BBB評分高于損傷組，差異有統計學意義（P＜0.01），見表2。表明OECs 移植對脊髓損傷大鼠運動功能恢復有較為明顯的影響。

表2 3組大鼠移植后BBB評分

2.3 qPCR檢測結果

空白組不同時間點各信號分子表達穩定，趨勢較為平穩；損傷組Wnt-1、GSK-3β 與c-myc 總體呈下調趨勢，β-catenin 有小幅上升，但都呈明顯抑制狀態，詳見表3 ~ 6；與損傷組比較，移植組除Wnt-1 呈小幅上調趨勢外，β-catenin、GSK-3β 與cmyc 均呈較高表達，明顯減輕了損傷后的抑制狀態，詳見圖2~5。

圖2 Wnt-1在不同時間點mRNA表達變化

表3 Wnt-1不同時間點mRNA表達變化

2.4 免疫組化情況

免疫組化顯示空白組神經絲蛋白-200（NF-200）陽性細胞是神經元細胞，為棕色，數量較多，胞體較大且飽滿，細胞核大而圓，核仁較明顯；對照組陽性細胞數量較少，胞體變性且縮小，核仁消失；細胞組胞體呈現細長錐形，核仁出現并位于中央，數量較對照組增多，且形態更接近于空白組細胞，即正常的神經元細胞，提示OECs 移植可以促進神經元細胞的增殖。詳見圖6。

A為移植組；B為空白組；C為損傷組；免疫組化染色，比例尺均為50μm

3 討 論

脊髓損傷是年輕人最常見的死亡原因，對患者的社會生活和經濟生活影響往往比其他損傷更為顯著。脊髓損傷的發病率存在地域差異，發病率從12 例/百萬人到65 例/百萬人不等，且經濟越發達的地區，發病率越高［7-9］。當前的醫療技術并未攻克脊髓損傷的難題，但OECs 移植對神經元的修復作用逐漸得到專家的認可，并成為研究的熱點。OECs 起源于嗅基底膜，存在于周圍神經和中樞神經中，在中樞神經系統內能長距離的遷移，是一種能夠終生促進嗅神經元軸突生長和再生的膠質細胞［10］。2003 年開始研究相繼報道自體嗅鞘或嗅球組織移植SCI 患者獲得了一定程度的神經功能恢復，之后許多學者對OECs 移植進行了更加深人的研究，并取得了不同程度的進展［11-13］。OECs 移植后，Wnt 信號通路關鍵分子在脊髓損傷部位發揮了重要作用，但其具體機制還未完全明確。

表4 β-catenin不同時間點mRNA表達變化

表5 GSK-3β不同時間點mRNA表達變化

表6 c-myc不同時間點mRNA表達變化

圖3 β-catenin在不同時間點mRNA表達變化

圖4 GSK-3β在不同時間點mRNA表達變化

圖5 c-myc在不同時間點mRNA表達變化

Wnt 基因自發現以來，目前已有19 個配體和14 個受體，至少激活3 種不同的信號途徑，包括經典的Wnt/β-catenin 信號通路、非經典的Wnt-JNK 信號通路和Wnt-Ca+信號通路［14］。在經典的Wnt/βcatenin 信號通路中，有Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt4等經典的信號分子，它們參與調節干細胞和祖細胞的增殖和分化，在胚胎發育和成體組織穩態中發揮著重要作用［15］。GSK-3β、APC 與Axin 則形成一種復合物，當Wnt 配體缺乏時，β-catenin 被復合物所降解；當Wnt配體存在時，β-catenin可通過Wnt受體與配體的結合，進入細胞核，與T 細胞轉錄因子/淋巴樣增強因子（TCF/LEF）相互作用，激活下游基因，調控細胞增殖與凋亡等變化［16-17］。

本研究發現，經過OECs 移植之后的大鼠BBB評分明顯增高，移植后脊髓局部神經元細胞也有不同程度增加和形態改善，表明OECs 移植可以促進神經元增殖，從而促進大鼠運動功能恢復。qPCR 顯示脊髓損傷后，Wnt-1、β-catenin、GSK-3β和c-myc 總體呈下調趨勢，Wnt/β-catenin 通路被抑制，而OECs 移植后，Wnt/β-catenin 通路抑制性明顯減輕。

研究發現，脊髓損傷后神經干細胞在短時間內募集，Wnt/β-catenin 信號通路可能被激活參與其中［18］。本研究中脊髓損傷并未激活Wnt/β-catenin信號通路，可能由于細胞微環境變化、凋亡、焦亡等原因，自我修復未有效啟動，而經OECs 移植后，減輕了Wnt/β-catenin信號通路損傷后的抑制狀態，可能協同參與神經干細胞的增殖反應，從而起到修復受損神經元的作用，但OECs 移植后Wnt/β-catenin信號通路的調控趨勢仍較正常低，相關原因在未來的研究中將會繼續探討，改良OECs 或聯合其他方法治療脊髓損傷或許成為今后改進的方向。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突