血清(1,3)-β-D-葡聚糖測定主試劑溶解方式不同對檢測結果的影響

黃日昇，彭云娟，李軼春

北海市中醫醫院醫學檢驗科，廣西 北海 536000

長期以來，由于抗生素、激素、抗腫瘤化療與放療藥物、免疫抑制劑、留置管和器官移植的廣泛應用，臨床機會性真菌感染的發病率和死亡率逐年上升[1-3]，真菌已成為醫院感染的主要病原體之一。(1,3)-β-D-葡聚糖[(1,3)-β-D-glucan，BDG]是真菌細胞壁的主要成分，其含量可達到50%以上，其他微生物尚未發現有此物質[4]，因此其成為深部真菌感染研究的熱點[5]。血清(1,3)-β-D-葡聚糖測定(G試驗)適用于除了隱球菌、接合菌(毛霉菌)外的深部真菌感染早期診斷，是目前應用于侵襲性真菌感染(invasive fungal infection，IFI)輔助診斷最常用的非侵襲性血清學方法[6]。但在實際臨床案例中發現G試驗假陽性或假陰性率較高，影響其結果的因素較多，而實驗操作過程中反應主試劑溶解方式的不同是主要影響因素之一，卻沒有得到足夠的重視。本文旨在通過對G試驗(光度法)反應主試劑采用手工振蕩溶解與儀器振蕩溶解的檢測結果進行比較研究，分析主試劑不同溶解方式對檢測結果的影響，提高G試驗的敏感度與特異度。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年6～12月北海市中醫醫院重癥醫學科、肺病科、腫瘤科長期使用廣譜抗菌藥物、免疫抑制劑、糖皮質激素、正在化療或放療的126例有臨床感染癥狀擬診IFI患者為研究對象，其中男性78例，女性48例，平均年齡(62.55±5.58)歲。本研究獲得醫院醫學倫理委員會批準，所有患者知情同意。本研究參考歐洲癌癥研究治療組織及真菌研究組(EORTC/MSG)的診斷標準和中國侵襲性真菌感染工作組制定的臨床診斷侵襲性真菌病的診斷標準[7]：(1)確診：組織病理學證實為真菌，無菌組織及血液培養為真菌；(2)臨床診斷：具有IFI宿主因素及臨床表現，同時伴有一項病原學依據；(3)臨床擬診：具有IFI宿主因素及臨床表現，無病原學依據，抗真菌治療有效；(4)排除診斷：不符合以上標準，單用抗菌藥物治療有效。IFI感染患者為確診和臨床診斷患者；不符合上述診斷標準，而明確細菌、病毒感染者為非侵襲性真菌感染患者。按照IFI確診標準將126 例患者分為感染組60 例和未感染組66例。

1.2 儀器與試劑 北京金山川MB-80 快速動態微生物檢測系統、MI-01 智能金屬浴、KJ-201C 微量振蕩器；試劑：北京金山川科技有限公司生產的真菌(1,3)-β-D-葡聚糖檢測試劑盒(光度法)，GKT-1M包裝規格，主要組成包括反應主試劑(成分：G因子、凝固酶原、凝固蛋白原。規格：凍干品，凍干前體積0.2 mL/支)、樣品處理液(成分：表面活性劑0.05%，K+0.01 mol/L，Mg2+0.02 mol/L。規格：0.9 mL/支)；配套材料：喜諾促凝劑型采血管、無熱源專用平底試管、一次性無熱源吸頭。

1.3 方法

1.3.1 G試驗反應主試劑手工振蕩與儀器振蕩溶解方法 選擇專用喜諾促凝劑型采血管采集靜脈血4 mL，3000 r/min 離心10 min，取上層血清0.1 mL，加入0.9 mL 樣品處理液中，使用移液器混勻后，在70℃的MI-01 智能金屬浴加熱15 min，然后自動啟動冷卻程序，冷卻5 min，此時的處理液上層為待測樣品。取該上層樣品0.2 mL(切忌震蕩)加入到反應主試劑瓶子中(凍干品，凍干前體積0.2 mL/支)，反應主試劑手工振蕩溶解方式是使用手指輕輕敲振試劑瓶，肉眼判斷凍干品試劑完全溶解至無色透明；而反應主試劑儀器振蕩溶解方式，則使用KJ-201C 微量振蕩器振蕩反應主試劑瓶10 s 或20 s 以上，然后分別將這兩種溶解方法的復溶液移液至無熱源專用平底試管中(避免氣泡)，將其插入MB-80 儀進行測定，反應結束后，標準曲線將自動計算待測血清中BDG的含量，以此比較反應主試劑手工振蕩溶解與儀器振蕩溶解方式不同對檢測結果的影響。兩種溶解方式的敏感度和特異度計算公式為：敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)。試劑盒檢驗結果解釋：＜60 pg/mL，無深部真菌感染(隱球菌、接合菌除外)；60～100 pg/mL，為觀察期，應連續監測；＞100 pg/mL，懷疑為深部真菌感染，建議臨床結合癥狀治療(本次研究判定為陽性檢測結果)。

1.3.2 質量控制 使用同一批號試劑盒配套質控品(含BDG112.5 pg/mL，靶值225 pg/mL，質控范圍160～290 pg/mL)與樣本一同檢測，使用常規質量控制規則。

1.3.3 數據資料收集整理 通過衛寧健康常規檢查系統與臨床信息系統CIS采集分析。

1.4 統計學方法 應用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。計數資料比較采用χ2檢驗，計量資料符合正態分布，以均值±標準差(±s)表示，組間兩兩比較采用t檢驗。均以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者的G 試驗反應主試劑手工振蕩溶解與儀器振蕩溶解檢測結果比較 感染組與未感染組患者G 試驗反應主試劑儀器振蕩溶解方法較手工振蕩溶解方法有較低的標準差，兩組兩種溶解方法檢測結果比較差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1。感染組G 試驗反應主試劑手工振蕩溶解方法與儀器振蕩溶解方法檢測結果的敏感度分別為81.7%、90.0%；未感染組兩種溶解方法檢測結果的特異度分別為84.8%、92.4%。兩種方法檢測結果的敏感度和特異度比較差異均有統計學意義(P＜0.05)。后者檢測結果敏感度與特異度分別較手工溶解方法提高8.3%與7.6%，見表2。

表1 感染組與未感染組反應主試劑手工振蕩溶解與儀器振蕩溶解檢測結果比較(±s)

表1 感染組與未感染組反應主試劑手工振蕩溶解與儀器振蕩溶解檢測結果比較(±s)

組別感染組未感染組t值P值例數6066手工振蕩復溶方法(pg/mL)137.27±45.8654.79±21.5412.780.001儀器振蕩復溶方法(pg/mL)119.73±26.0545.50±16.1718.970.001

表2 兩組患者的反應主試劑手工振蕩溶解與儀器振蕩溶解陽性率比較[例(%)]

2.2 G 試驗反應主試劑手工振蕩溶解與儀器振蕩溶解方法室內質控失控率比較 反應主試劑手工振蕩溶解與儀器振蕩溶解后，同時使用同一批號試劑盒附帶質控品進行檢測，隨機挑選112 d 室內質控數據，分析室內質控失控率，儀器振蕩較手工振蕩溶解方法失控率降低8.04%，差異有統計學意義(χ2=7.74，P=0.010＜0.05)，見表3。

表3 手工振蕩與儀器振蕩溶解方法室內質控失控率比較[例(%)]

2.3 G 試驗反應主試劑手工振蕩溶解與儀器振蕩溶解方法室內質控統計數值比較 隨機挑選30 d室內質控數據進行獨立樣本t 檢驗分析，手工振蕩溶解與儀器振蕩溶解檢測結果的室內質控統計數值均值分別為(241.41±47.35)pg/mL、(209.37±8.97)pg/mL，顯示使用儀器振蕩溶解方法所獲得的檢測結果均值更接近靶值(225 pg/mL)，明顯降低了標準差，差異有統計學意義(t=3.64，P＜0.05)。

2.4 儀器振蕩溶解方法振蕩時間長短對室內質控數值影響 隨機挑選30 d 室內質控數據進行獨立樣本t 檢驗分析，儀器振蕩溶解10 s與20 s以上兩種方法，其室內質控統計數值均值分別為(209.88±1.65)pg/mL和(209.27±1.33) pg/mL，兩種方式檢測結果的均值均接近靶值(225 pg/mL)，均有較低的標準差，同時顯示均值、標準差與儀器振蕩時間延長(＞10 s)非線性關系，差異無統計學意義(t=1.56，P＞0.05)。

3 討論

IFI 為常見疾病，主要由真菌侵入人體血液或組織，并生存和繁殖，進而引起相應組織器官損傷或發生炎癥反應，嚴重威脅患者生命健康安全[8]。G試驗具備操作簡便、敏感度和特異度均較高等優勢，廣泛應用于臨床，成為IFI早期診斷的常用檢測方法[9]。

目前，G試驗多數采用BDG抗原檢測法檢測BDG含量，BDG可特異性激活鱟變形細胞裂解產物中的G因子，從而激活凝血酶原形成凝固酶，使裂解物凝固。主要通過以下兩種方法檢測BDG濃度：一種是比濁法(濁度法)，即根據凝固后濁度增加引起吸光度或透光率的變化來檢測BDG含量。另一種是顯色法(光度法)，即在試劑中加入顯色底物，活化的凝固酶將底物中的黃色發光基團(對硝基苯胺)釋放出來，通過吸光度的變化來檢測BDG 含量[10]。因此G試驗反應主試劑(凍干品)是否完全溶解，將影響吸光度或透光率的變化，從而影響實驗結果的準確性。

有研究報道，較多干擾因素可引起G試驗假陽性結果，極大影響了G 試驗的敏感度與特異度[11-14]。最新研究顯示BDG 形態均一性也是影響G 試驗的因素之一，BDG 以三螺旋結構為主，但同時也存在單鏈和雙螺旋結構等其他形態。目前對樣本進行前處理主要有加熱稀釋法和堿處理法，前者很難使BDG形態均一化[15]，而后者可使多聚體形態轉化為單鏈結構，從而獲得均一的BDG[16]。因此有學者提出用堿處理法提高試驗的特異度，但堿處理法可能需要自動化儀器設備，更高的檢測成本。通過文獻搜索顯示，大量學者研究更傾向利用G 試驗聯合痰真菌培養與半乳甘露聚糖抗原檢測(GM試驗)來提高IFI早期診斷的敏感度與特異度，而在原有儀器設備基礎上，通過優化G試驗檢測流程，改良G試驗主試劑溶解方式等方面的應用研究卻被忽視，未能得到足夠的重視[9-10，17-18]。

目前關于G 試驗反應主試劑溶解的標準操作要求、振蕩溶解時間長短、原理、影響因素等方面的研究報道極少。在本研究中，實驗結果顯示感染組反應主劑手工振蕩溶解后檢測結果的敏感度與未感染組反應主劑手工振蕩溶解后檢測結果的特異度分別為81.7%、84.8%，與孟文晴等[9](82.1%、85.5%)、黃永杰等[18](82.30%、85.42%)研究基本一致，而使用儀器振蕩溶解后的檢測結果顯示，其顯著提高了感染組的敏感度(90.0%)與未感染組的特異度(92.4%)，降低了標準差。原因可能是儀器振蕩溶解的頻率、力度控制比手工法更恒定均勻，能使反應主劑中的G 因子、凝固酶原等內容物徹底溶解，從而更容易被樣本中的BDG 特異性激活，使檢測的敏感度和特異度增加。室內質控統計數值均值結果也顯示，儀器震蕩溶解法檢測結果的均值更接近靶值，降低了G試驗(光度法)檢測結果的失控率與標準差。同時通過儀器振蕩復溶10 s 與20 s 兩種方法檢測結果差異無顯著性推測，儀器振蕩10 s已經可以充分溶解反應主試劑(凍干品)內容物，不會造成其溶解不完全，避免了因殘留的凍干品顆粒增多，而導致吸光度增加引起的假陽性。

綜上所述，在相同的條件下，G實驗(光度法)反應主試劑采用儀器振蕩(振蕩10 s即可)溶解方式的檢測結果與手工振蕩溶解檢測結果相比，前者能降低G試驗的標準差，提高檢測的敏感度與特異度。