草地貪夜蛾三個SfruPBPs對本種及同域種勞氏粘蟲性信息素及腺體組分的親和力

鄭樹壕, 司玉曉, 閆 祺, 郭慧芳, 董雙林,*

(1. 南京農業大學植物保護學院, 農作物生物災害綜合治理教育部重點實驗室, 南京 210095;2. 江蘇省農業科學院植物保護研究所, 南京 210014)

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda屬鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)，具有很強的遷飛擴散能力，但長期以來局限于在美國、墨西哥、巴西等中美洲地區發生和危害(Pashleyetal., 1985; Pashley and Martin, 1987; Andrews, 1988; Cruzetal., 1999)。直到2016年，草地貪夜蛾在非洲被發現，并很快蔓延到歐洲和亞洲(Goergenetal., 2016; Feldmannetal., 2019)；在我國，2018年12月首次在云南發現草地貪夜蛾，次年即擴散到許多其他省份(吳秋琳等, 2019)。草地貪夜蛾屬多食性害蟲，主要為害禾本科的玉米和水稻，2017年在非洲玉米主產地造成53%的損失(Dayetal., 2017)，2019年云南靖江市由于草地貪夜蛾入侵造成的直接經濟損失達2 900萬元(張瓊等, 2020)。根據寄主喜好性，草地貪夜蛾分為玉米型和水稻型(Pashleyetal., 1985; Pashley and Martin, 1987)，兩者在形態上高度相似，通常以細胞色素氧化酶Ⅰ(cytochrome oxidase I, COI)和磷酸甘油醛異構酶(triose phosphate isomerase, Tpi)基因序列來區分(Meagher and Gallo-Meagher, 2003; Nagoshi, 2010)。我國發生的草地貪夜蛾為玉米型，但摻雜少量水稻型的基因型(陳冬平等, 2020; 王亞如等, 2020)，尚未有在田間大面積危害水稻的報道。對草地貪夜蛾發生區域和發生量的嚴密監測意義重大。

性信息素用于害蟲監測和測報具有靈敏度高、特異性強、高效方便等優點，并已在草地貪夜蛾得到應用，但突出問題是誘芯的種特異性不高。生產上常用的二元或三元組分誘芯常常誘捕到相當比例的勞氏粘蟲Leucanialoreyi(Meagheretal., 2019; 沈嘉彬等, 2019)，給準確計數草地貪夜蛾蟲量進而測報其種群動態帶來困難。有關草地貪夜蛾性信息素的組成，迄今已從雌蛾性信息素腺體中鑒定到13種組分，但不同地理種群間有所差異(Sekul and Sparks, 1967; Tumlinsonetal., 1986; Descoinsetal., 1988; Batista-Pereiraetal., 2006; 江南紀和王琛柱, 2019; Jiangetal., 2021)。在這些組分中，Z9-14∶Ac和Z7-12∶Ac被普遍證實有田間雄蛾引誘活性(Tumlinsonetal., 1986)，Z11-16∶Ac在美國賓夕法尼亞州地理種群中具有活性(Fleischeretal., 2005)，生產上應用的誘芯主要由這些組分配制而成。值得注意的是，勞氏粘蟲等幾種粘蟲外形和草地貪夜蛾相近，且性信息素組分高度重合，除共享Z9-14∶Ac和Z7-12∶Ac這2種主要行為活性組分外，12∶Ac等4種組分也在兩種雌蛾腺體中并存(Sekul and Sparks, 1967; Tumlinsonetal., 1986; Descoinsetal., 1988; Hoetal., 2002; 江南紀和王琛柱, 2019; Jiangetal., 2021)。自然條件下，推測兩種害蟲依靠各自特有組分來達到性信息素通訊系統間的隔離。

氣味結合蛋白(odorant binding protein, OBP)在昆蟲性信息素等氣味分子的識別和感受中起重要作用。OBP是一類水溶性小分子蛋白，高濃度存在于昆蟲嗅覺感器的感器液腔中，負責識別并運輸氣味分子穿越感器液腔到嗅覺神經元樹突膜上的氣味受體(odorant receptor, OR)部位，此處氣味分子被釋放后單獨或以氣味分子-OBP復合體的形式激活OR(Leal, 2013)。在鱗翅目昆蟲中，OBP分為普通氣味結合蛋白(general odorant binding protein, GOBP)、信息素結合蛋白(pheromone binding protein, PBP)和觸角結合蛋白(antennal binding protein, ABP)(Vogtetal., 1991, 1999)。其中，PBP在性信息素敏感的感器中表達，負責對性信息素分子的結合和運輸，具有很高的配體親和力和特異性(Vogt and Riddiford, 1981)，與性信息素通訊系統的高度靈敏性和種特異性相一致。研究PBP對草地貪夜蛾及同域近緣種勞氏粘蟲性信息素組分的結合能力，將有助于了解兩種昆蟲在性信息素通訊系統水平上的隔離機制，也可為種特異性誘芯的開發提供依據。草地貪夜蛾具有4個PBP基因，其中3個在觸角中表達，暗示其在性信息素感受中起作用(劉蘇等, 2020)。本研究針對這3個觸角中表達的PBP基因，通過體外重組表達并純化后，測定了PBP蛋白對草地貪夜蛾及勞氏粘蟲性信息素及腺體組分的親和力，以期為明確兩種昆蟲性信息素通訊間的隔離機制及開發種特異性的性信息素誘芯提供基礎。

1 材料與方法

1.1 昆蟲飼養與組織收取

草地貪夜蛾幼蟲于2019年7月采集自江蘇東臺玉米田(32°45′N, 120°23′E)，在室內利用甜菜夜蛾Spodopteraexigua人工飼料(黃春霞等, 2002)進行繼代飼養。飼養溫度為27±1℃，相對濕度為70%±5%，光周期為14L∶10D。成蟲飼喂10%蜂蜜水。收取3日齡雄蟲觸角50對，重復3次，置于-80℃保存備用。

1.2 RNA提取和cDNA第1鏈的合成

使用Trizol Reagent (Invitrogen, 美國)提取總RNA。 RNA的質量和濃度由NanoDrop2000(Thermo Scientific, 美國)檢測，OD260/OD280比值均為1.8～2.0。根據試劑盒說明書，使用HiScript?III RT SuperMix (諾唯贊, 南京)從1 μg總RNA中合成cDNA第1鏈，-20℃保存備用。

1.3 PBP基因原核表達載體的構建

根據NCBI上草地貪夜蛾PBP1, PBP2和PBP3的cDNA序列(GenBank登錄號分別為MN541407, MN541408和MN541409)，去除信號肽編碼序列后設計上下游引物，用于PBP基因的克??；去除信號肽序列后，設計包含BamHⅠ和XhoⅠ限制性內切酶位點的同源重組引物(表1)，用于基因的原核表達。引物由南京金斯瑞公司合成。

表1 引物信息

以成蟲觸角cDNA為模板，采用高保真性DNA聚合酶2×Phanta Max Master Mix(諾唯贊，南京)按照說明書進行PCR擴增。PCR反應體系(25 μL): 2×Phanta Max Master Mix 12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, cDNA模板1 μL, ddH2O 9.5 μL。反應條件: 95℃預變性3 min; 95℃變性15 s, 55℃退火15 s, 72℃延伸40 s, 35個循環; 72℃總延伸5 min。使用1.2%凝膠電泳檢測PCR產物并使用Axyprep DNA凝膠回收試劑盒(康寧生命科學，蘇州)進行膠回收。PCR產物回收后連接到pEASY-Blunt3載體(全式金，北京)并轉化到大腸桿菌EscherichiacoliTrans1-T1感受態細胞(全式金，北京)中，提取質粒DNA并測序驗證。將含有目的基因片段的重組質粒DNA和pET-30a(+)質粒(Novagen，德國)DNA分別進行雙酶切(BamHⅠ和XhoⅠ)(Fermentas，加拿大)，然后將目的片段連接到pET-30a(+)載體，再轉化到Trans1-T1感受態細胞中。用含卡那霉素的LB平板進行篩選，挑取陽性克隆進行測序。

1.4 PBP的誘導表達與純化

PBP的誘導表達與純化參考已報道的方法(Zhangetal., 2021)。將1.3節經測序驗證后的質粒轉入大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，接種于LB 培養基后培養至 OD600= 0.6～0.8 后加入 IPTG(終濃度為1 mmol/L)進行PBP誘導表達。誘導后菌液經超聲波破碎并用SDS-PAGE檢測。將含有包涵體蛋白的溶液通過Ni-NTA瓊脂糖磁珠(Ni磁珠)(金斯瑞，南京)進行純化，得到帶有His標簽的融合蛋白。為防止His標簽對熒光競爭結合實驗結果造成影響，使用腸激酶(金斯瑞，南京)在22℃條件下反應10～14 h切除His標簽。

1.5 熒光競爭結合實驗

共測試14種氣味物質，均為草地貪夜蛾或勞氏粘蟲性信息素腺體浸提液組分，其中E7-12∶Ac,Z9-12∶Ac, 11-12∶Ac,Z10-14∶Ac,Z11-14∶Ac,Z9-14∶Ald和Z11-16∶Ald為草地貪夜蛾特有組分，Z7-14∶Ac為勞氏粘蟲特有組分，其他為共有組分(Sekul and Sparks, 1967; Tumlinsonetal., 1986; Descoinsetal., 1988; Hoetal., 2002; 江南紀和王琛柱, 2019; Jiangetal., 2021)(表2)。這14種氣味物質中，Z9-14∶Ac和Z7-12∶Ac已證實對兩種害蟲具有田間雄蛾引誘活性(Tumlinsonetal., 1986)，因此是性信息素組分；其他組分在田間誘捕試驗中沒有發現明顯的雄蛾引誘活性，本文中稱為“腺體組分”，但不排除其中的某些組分可能在近距離內促進兩性間交配而起到性信息素的作用。本研究所使用的14種氣味物質中，Z11-14∶Ac和16∶Ac購自沈陽北欣貿易有限公司，另外12種氣味物質均購自常州寧錄生物科技有限公司。熒光競爭結合實驗測定方法同實驗室前期報道(Liuetal., 2012; 魏丹等, 2013)。首先檢測PBP 蛋白對熒光探針1-NPN的結合能力。將PBP重組蛋白溶液加入50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液中，總體系為250 μL，使蛋白的終濃度為2 μmol/L，按2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18和20 μmol/L的終濃度梯度加入1-NPN(濃度為0.5 mmol/L)，每次反應2 min，在337 nm激發，記錄熒光強度，計算蛋白與1-NPN的結合常數Ki, 然后利用競爭結合實驗測定氣味物質和PBP重組蛋白的結合能力。在競爭結合實驗中, PBP重組蛋白和1-NPN的濃度均為2 μmol/L，反應時間為2 min，在337 nm激發，記錄熒光值(初始熒光值)，然后被測氣味物質(濃度0.05 mmol/L)按0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.6, 2.0, 2.4, 2.8, 3.2, 3.6和4.0 μmol/L的終濃度梯度加入到PBP重組蛋白與熒光探針的混合溶液中，反應2 min后記錄熒光值。實驗在25℃條件下進行。利用公式Ki=IC50/(1+[1-NPN]/K1-NPN)計算各氣味物質的結合常數，其中[1-NPN]為未結合的1-NPN濃度，K1-NPN為1-NPN與PBP的結合常數。利用GraphPad Prism 6.0軟件分析PBP與1-NPN的結合實驗數據。

為敘述方便，本文將PBP和氣味物質間結合能力按Ki<1.00 μmol/L, 1.004.00 μmol/L分別定義為強、中、無明顯結合能力。

2 結果

2.1 草地貪夜蛾3個SfruPBPs的誘導表達與純化

經過IPTG誘導表達10 h后，收集菌液離心得到菌體后進行超聲波破碎，破碎液離心后經SDS-PAGE分析發現，目的蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中，在上清中很少。對帶有His標簽的目的蛋白進行純化，大小為21 kD左右。為防止His標簽對實驗造成的影響，對融合蛋白進行腸激酶酶切，去除His標簽。去除標簽后3個SfruPBPs大小均在16 kD左右，與預測的3個SfruPBPs的分子量一致(圖1)。

圖1 草地貪夜蛾3個SfruPBPs重組蛋白的表達與純化

2.2 草地貪夜蛾3個SfruPBPs與不同氣味物質的結合能力

結果表明，3個SfruPBPs溶液的熒光值隨1-NPN濃度的增加而增加并趨于飽和；SfruPBP1, SfruPBP2和SfruPBP3與1-NPN的結合常數(K1-NPN)分別為4.61±1.0, 9.05±1.1和3.72±0.7 μmol/L(圖2)。因此，1-NPN可以作為探針用于后續的競爭性結合實驗。

圖2 3個SfruPBPs重組蛋白與1-NPN的結合曲線

利用熒光競爭結合實驗測定了3個SfruPBPs對14種氣味物質的結合能力，發現3個SfruPBPs對氣味物質的結合譜明顯不同。SfruPBP1僅對草地貪夜蛾性信息素主組分Z9-14∶Ac結合并具有強結合能力(Ki=0.80 μmol/L)；SfruPBP3則僅對腺體組分Z9-12∶Ac具有中等結合能力(Ki=1.36 μmol/L)；而SfruPBP2對包括性信息素次要組分Z7-12∶Ac在內的7種組分具有結合能力，其中對Z7-12∶Ac, 12∶Ac,E7-12∶Ac和Z10-14∶Ac具有強結合能力(Ki<1.00 μmol/L)，對Z9-14∶Ac,Z9-12∶Ac和11-12∶Ac有中等結合能力(1.00 μmol/L

3 討論

本研究測定了草地貪夜蛾3個SfruPBPs對草地貪夜蛾及勞氏粘蟲性信息素或性信息素腺體組分共14種氣味物質的結合特性，發現草地貪夜蛾3個SfruPBPs均可結合本種的性信息素或腺體組分，但不同PBP的配體譜明顯不同；此外，3個SfruPBPs對勞氏粘蟲腺體特有組分Z7-14∶Ac均無明顯結合能力(圖3; 表2)。研究結果為進一步明確草地貪夜蛾對性信息素的感受機制，以及草地貪夜蛾與勞氏粘蟲性信息素通訊系統間的隔離機制提供了重要基礎。

圖3 3個SfruPBPs重組蛋白與14種氣味物質的競爭結合曲線

表2 草地貪夜蛾3個SfruPBPs重組蛋白對本種及勞氏粘蟲性信息素和其他腺體組分的親和力

就腺體內含量及田間雄蛾引誘活性而言，Z9-14∶Ac和Z7-12∶Ac分別是草地貪夜蛾性信息素的主組分和次要組分，常以不同比例構成二元誘芯用于田間害蟲測報和誘捕(Tumlinsonetal., 1986; Unbehendetal., 2014; Jiangetal., 2021)。在被測14種氣味中， SfruPBP1對性信息素主組分Z9-14∶Ac特異性強結合(Ki=0.80 μmol/L)(表2)；SfruPBP2則對性信息素次要組分Z7-12∶Ac強結合，并對主組分具中等結合能力；SfruPBP3對2種性信息素組分均無明顯結合能力(圖3;表2)。在個別草地貪夜蛾地理種群中，Z11-16∶Ac也被證明具有一定的田間誘捕活性(Fleischeretal., 2005)，但本研究發現3個SfruPBPs對該組分均沒有明顯的結合能力，這與在大部分研究中該組分不具田間行為活性的結論(Tumlinsonetal., 1986; Unbehendetal., 2014)是一致的。結合劉蘇等(2020)對草地貪夜蛾3個PBPs的組織表達分析結果，我們推測SfruPBP1和SfruPBP2在雄蟲識別性信息素中起主要作用，SfruPBP3起輔助作用。

草地貪夜蛾與斜紋夜蛾Spodopteralitura和甜菜夜蛾為同屬近緣種，其中后兩者均為我國重要農業害蟲，比較3種昆蟲PBP同源基因的表達模式及對性信息素組分的選擇性差異，可以為PBP基因的進化及功能分化研究提供線索。在入侵種草地貪夜蛾中，3個PBPs對性信息素主組分Z9-14∶Ac的結合能力順次減弱(SfruPBP1>SfruPBP2>SfruPBP3)(圖3;表2)，與斜紋夜蛾和甜菜夜蛾3個PBPs對各自主組分Z9,E11-14∶Ac或Z9,E12∶Ac結合能力的結果(Liuetal., 2012, 2013)類似。但不同的是，草地貪夜蛾SfruPBP1特異性結合主組分Z9-14∶Ac，對不同組分具明顯的選擇性，而斜紋夜蛾和甜菜夜蛾的3個PBPs雖然對性信息素組分的結合能力順次減弱，但相同PBP在不同組分間沒有明顯的選擇性(Liuetal., 2012, 2013)，這種差異的原因需要進一步探索。比較發現，草地貪夜蛾3個PBPs在雌雄蟲觸角中的表達模式與斜紋夜蛾和甜菜夜蛾也存在不同。根據劉蘇等(2020)結果，草地貪夜蛾PBP1和PBP2均為雄蟲觸角高表達(雄/雌分別約為2.8和3.7)，且在雄蛾觸角中PBP2的表達量高于PBP1(PBP2/PBP1=1.3)。而在斜紋夜蛾和甜菜夜蛾中，僅PBP1為雄蟲觸角高表達(雄/雌分別為6.0和2.7)，且PBP1的表達量顯著高于PBP2(PBP1/PBP2分別為3.0和11.0)(Liuetal., 2012, 2013)。表達模式的不同可能與其PBP的配體選擇性的差異相關。

在使用草地貪夜蛾性信息素二元(Z9-14∶Ac和Z7-12∶Ac)或三元(Z9-14∶Ac,Z7-12∶Ac和Z11-16∶Ac)不同比例的誘芯進行田間雄蛾誘捕時，常常能同時誘捕到相當比例的勞氏粘蟲(Meagheretal., 2019; 沈嘉彬等, 2019)，但自然情況下兩種害蟲并不會交叉吸引，說明某些種特異性的性信息素次要組分在起作用。結合現有文獻報道(Hoetal., 2002; 江南紀和王琛柱, 2019)，在雌蛾性信息素腺體組分中，除6種共有組分外，草地貪夜蛾還特有7種組分(E7-12∶Ac,Z9-12∶Ac, 11-12∶Ac,Z10-14∶Ac,Z11-14∶Ac,Z9-14∶Ald和Z11-16∶Ald)，而勞氏粘蟲特有2種組分(Z7-14∶Ac和Z7-16∶Ac)。本研究對這些特有組分(Z7-16∶Ac除外)的測定結果表明，草地貪夜蛾SfruPBP對本種特有組分E7-12∶Ac,Z9-12∶Ac, 11-12∶Ac和Z10-14∶Ac有不同程度的結合能力，而對勞氏粘蟲特有組分Z7-14∶Ac無明顯結合能力(表2)，說明這些組分均可能在兩種害蟲性信息素通訊隔離中起作用。此外，Ho等(2002)報道，勞氏粘蟲雄蛾對其2個特有組分Z7-14∶Ac和Z7-16∶Ac均有明顯的觸角電位反應，也說明這2種組分可能在種間隔離中發揮作用。進一步分析勞氏粘蟲PBP對兩種害蟲共有及特有組分的結合能力，將有助于更全面認識兩種害蟲性信息素通訊間的隔離機制，并為開發兩種害蟲的特異性田間誘芯提供指導。