昆蟲氣味受體的研究方法與進展

白鵬華, 王 冰, 張仙紅, 王桂榮

(1. 中國農業科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京100193;2. 天津市農業科學院植物保護研究所, 天津300384; 3. 山西農業大學植物保護學院, 山西太谷 030801)

昆蟲靈敏的嗅覺系統用以識別環境中的氣味化合物(例如植物揮發物和昆蟲性信息素)，從而指導昆蟲定位寄主、取食、交配、產卵和逃避傷害等重要生命活動(Zhang RBetal., 2017; Turlings and Erb, 2018; Guo and Wang, 2019; 王冰等, 2021; 游銀偉和張龍, 2021)。昆蟲識別氣味化合物是一個復雜的過程，氣味受體(odorant receptors, ORs)在昆蟲觸角外周嗅覺系統識別氣味分子的過程中起著關鍵作用。氣味分子激活ORs后，將化學信號轉變為電信號，在嗅覺中樞觸角葉內進行編碼整合，進一步傳遞到更高級的中樞神經系統，使昆蟲產生相應的嗅覺行為反應(Montagnéetal., 2015; Fleischeretal., 2018; 劉偉和王桂榮, 2020)。因此，昆蟲氣味受體功能的鑒定有助于揭示昆蟲觸角外周神經系統的嗅覺識別機制(de Fouchieretal., 2017; Fleischeretal., 2018; Bastin-Hélineetal., 2019)。

昆蟲氣味受體從結構上可分為2類：一類是在不同昆蟲間高度保守且廣泛表達的氣味受體共受體(odorant receptor co-receptor, Orco)；另一類是普通氣味受體(ORs)，這類受體在同一物種或不同物種間同源性很低且數量眾多，與Orco共同作用形成復合二聚體，共同感受外界的氣味分子。在鱗翅目中，氣味受體又根據功能劃分為性信息素受體(pheromone receptors, PRs)和普通氣味受體，前者主要識別鱗翅目性信息素組分，后者大多識別植物揮發物等(Breeretal., 2019)。

隨著組學技術的發展，越來越多的昆蟲OR基因被鑒定出來，OR功能的研究方法也不斷深入與發展起來。常用的ORs功能研究涉及到體外和體內兩種方法(Montagnéetal., 2015)，前者包括爪蟾卵母細胞(Xenopusoocytes)異源表達系統結合雙電極電壓鉗技術(two-electrode voltage clamp, TEVC)、轉基因果蠅異源表達系統結合單感器記錄技術(single sensillum recording, SSR)和細胞系異源表達系統結合鈣離子成像技術(calcium imaging)；后者主要有RNA干擾技術(RNA interference, RNAi)和CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated nuclease Cas9)基因編輯技術。深入了解各個研究方法的原理、實施的技術特點和應用范圍，有助于開展行之有效的受體功能鑒定。因此，研究者可以根據研究的目的和現有的技術條件而選擇不同的氣味受體研究方法(Linetal., 2015; Wang Betal., 2016, 2018; Houetal., 2020)。本文主要從基因鑒定、表達定位和生理功能等方面對昆蟲氣味受體的研究進展進行了概述，歸納總結了2015年來昆蟲氣味受體研究的理論和技術發展，比較了不同研究方法的原理、特點和優缺點，為選擇合適的氣味受體功能研究方法提供參考。

1 氣味受體基因的鑒定

氣味受體基因的鑒定是開展氣味受體功能研究的第一步。1991年，第一個氣味受體基因在脊椎動物褐家鼠Ratfmnorvegicus嗅覺上皮組織中發現(Buck and Axel, 1991)。但是由于不同物種中氣味受體基因的同源性較低，無法通過同源比對的方法獲得昆蟲氣味受體基因。直到 1999 年，利用黑腹果蠅Drosophilamelanogaster全基因組測序的方法首次鑒定到昆蟲第一個氣味受體基因(Clyneetal., 1999; Robertsonetal., 2003)。隨著組學技術的飛速發展，科學家們利用基因組、轉錄組、蛋白質組測序結合生物信息學分析等技術手段快速、準確地鑒定了多種昆蟲氣味受體基因 (Montagnéetal., 2015; Breeretal., 2019)。

1.1 基因組測序鑒定氣味受體基因

昆蟲嗅覺基因的鑒定得益于基因組測序技術的巨大進步和生物信息學的逐漸普及?；蚪M測序技術已由第一代發展至第三代。第一代DNA測序技術(例如 Sanger 測序技術)以鏈終止法或鏈降解法為原理，具有準確率高、讀長較長等特點(Venteretal., 2001; 尹傳林等, 2017)，利用該方法測定了一系列模式生物的基因組序列，例如果蠅、線蟲等。但一代測序技術對于基因組較大的物種而言，其測序成本高、耗時長且通量低，無法實現大規?；蚪M測序。為降低測序成本，第二代測序技術(SOLi D 技術、Illumina Solexa技術和 454 技術)應運而生。Solexa 技術和454技術是基于邊合成邊測序的原理，而 SOLi D 技術是基于邊連接邊測序和雙色法的原理。該技術克服了第一代測序技術的缺點，極大地降低了測序成本，提高了測序通量和測序速度，同時保持了高準確性，目前已基本代替了第一代測序技術(Shendureetal., 2017)。但由于其依賴于PCR擴增，易造成拷貝錯誤、信息丟失等缺點，且讀長較短(最多只有200多bp)，導致基因組組裝困難。在此基礎上，第三代測序技術(納米孔單分子測序技術)橫空出世，其主要技術特點是DNA片段不需要擴增，而是以單分子為單位進行測序，顯著提高了讀長，已用于多倍體基因組的測序和組裝。但三代測序技術數據分析過程較為復雜，準確率仍有待提高。

基因組測序技術的飛速發展大幅度降低了測序成本，越來越多的昆蟲基因組序列被公布。昆蟲基因組學重大專項 “5000種昆蟲基因組測序計劃(i5k)” 提出在2020年前后完成5 000種節肢動物基因組的測序和分析工作。在i5k全球性計劃基礎之上，中國農業科學院深圳農業基因組研究所聯合浙江大學、西南大學等單位在2018昆蟲基因組與綠色防控大會上共同推出了 “TOP1000昆蟲基因組計劃”。自2015-2019年通過基因組測序方法從27種昆蟲中共鑒定了2 543個OR基因，覆蓋了昆蟲8個目，主要集中在鱗翅目、雙翅目、半翅目、鞘翅目、蜚蠊目、直翅目、膜翅目和蜻蜓目(表1)。其中，煙草天蛾Mauducasexta和草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda等8種鱗翅目昆蟲中鑒定出569個OR基因，占OR基因總數的21.75%(表1; 圖1)(Kanostetal., 2016; Liu Hetal., 2019)；6種雙翅目昆蟲中鑒定出319個OR基因；5種半翅目昆蟲中鑒定出437個OR基因；3種鞘翅目昆蟲中鑒定出664個OR基因。

圖1 2015-2019年利用基因組和轉錄組測序鑒定昆蟲氣味受體基因的數量

表1 2015-2019年利用基因組測序鑒定的昆蟲氣味受體基因

1.2 轉錄組測序鑒定氣味受體基因

轉錄組測序技術具有成本低、測序效率高和時空表達等特點，可以分析昆蟲不同發育階段、不同組織和性別等樣品的差異表達基因。該技術可用于非模式昆蟲或基因組信息未知的昆蟲氣味受體基因鑒定。觸角是昆蟲嗅覺系統的重要組成部分，大量OR基因是根據觸角轉錄組數據鑒定出來的，如大灰優蚜蠅Eupeodescorollae、黏蟲Mythimnaseparata、桃小食心蟲Carposinasasakii、黑肩綠盲蝽Cyrtorhinuslividipennis、稻水象甲Lissorhoptrusoryzophilus(Wang Betal., 2017; Duetal., 2018a; Tianetal., 2018; Wang GYetal., 2018; Zhang XXetal., 2019)(表2)。

表2 2015-2019年利用轉錄組測序鑒定的昆蟲氣味受體基因

續表2 Table 2 continued

續表2 Table 2 continued

此外，OR基因在一些昆蟲的非嗅覺組織如喙、下顎須、足和生殖器甚至翅等中均有表達，這些基因在識別氣味化合物中也發揮著重要作用(Xiaetal., 2015; Maetal., 2016; Guoetal., 2018)。

據不完全統計，2015-2019年，通過轉錄組測序技術從89種昆蟲中共鑒定了5 111個OR基因(圖1; 表2)。其中鱗翅目昆蟲中鑒定的OR基因數量達1 898個，分布在36種昆蟲，主要為棉鈴蟲Helicoverpaarmigera及其近緣種、小菜蛾Plutellaxylostella、桃小食心蟲Carposinasasakii和蘋果蠹蛾Cydiapomonella等重要農業害蟲；其他目昆蟲依次是鞘翅目(19種, 897個OR基因)、膜翅目(13種, 1 118個OR基因)、半翅目(9種, 406個OR基因)、雙翅目(7種, 306個OR基因)和直翅目(5種, 486個OR基因)(圖1; 表2)。OR基因數量在不同昆蟲種類間差異很大，如松褐天牛腫腿蜂Sclerodermussp.的觸角中僅有8個OR基因，而班氏跳小鋒Aenasiusbambawalei的觸角中多達226個OR基因(表2)。OR基因數目在不同物種間的顯著差異性，說明了昆蟲嗅覺識別能力的復雜性與不同基因的重要功能密切相關，這可能與其生存的生態環境和承受的自然選擇壓力不同有關(Leal, 2013; 何艷艷等, 2019)。

盡管轉錄組測序技術已廣泛應用于OR基因鑒定，但轉錄組測序的精確度尚未達到基因組測序技術水平，很多低表達的基因和長度較長的基因很難鑒定出來。如基于基因組測序數據在棉鈴蟲H.armigera體內鑒定出87個OR基因，而基于轉錄組測序數據僅挖掘出60個OR基因(Zhang Jetal., 2015; Liu Hetal., 2019)。因此，未來仍需要基因組與轉錄組測序技術相結合，并利用多種生物信息學手段深入全面分析基因數據，尋找出更多的未知氣味受體基因。

2 氣味受體結構特征

在昆蟲氣味受體基因鑒定的基礎之上，科學家們深入研究了昆蟲氣味受體蛋白結構，闡明ORs結構和生理功能之間的關系。Benton等(2006)首次揭示了昆蟲氣味受體的二級結構，其典型結構是7次跨膜蛋白，N端位于細胞質膜內，C端位于胞膜外。在胞內(intracellular, IC)和胞外(extracellular, EC)各形成3個Loop 環，其中胞外環1(extracellular loop 1, ECL1)通常由15～24個氨基酸組成，胞外環2(ECL2)由20～35個氨基酸組成，胞外環3(ECL3)最多由17個氨基酸組成；組成胞內環1(intracellular loop 1, ICL1)的氨基酸數量一般少于20，胞內環2(ICL2)由15～21個氨基酸組成，胞內環3(ICL3)氨基酸序列由16～180個氨基酸組成(Tiwarietal., 2019)。ORs的Loop環、C端和N端氨基酸序列的長度與其功能特異性是密切相關的(Palczewskietal., 2000)，其中具有較大胞外結構的胞外環2可能是昆蟲識別外界氣味分子的結合位點(Jacquin-Joly and Merlin, 2004)。黑腹果蠅D.melanogasterOR43a通過保守的C末端與共受體OR83b結合形成蛋白復合物，OR43a 和OR83b的ICL3 之間存在物理互作現象，成功確定了OR和Orco互作關系(Bentonetal., 2006)。隨著生物信息學的快速發展，利用生物信息學工具能夠快速預測昆蟲氣味受體蛋白二級結構。Liu YP等(2018)通過TMHMM 2.0 (https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)網站預測了小菜蛾P.xylostella的性信息素受體PxylOR8, PxylOR41和 PxylOR45 具有7個跨膜結構域，且具有細胞內N末端和細胞外C末端的拓撲結構；向候君等(2018)利用SOPMA軟件(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析出斑翅果蠅DrosophilasuzukiiOrco二級結構中α螺旋占比為50.21%，直鏈延伸占比為20.16%，β轉角占比為8.64%，無規則卷曲占比為20.99%。

在二級結構的基礎上，三維結構的解析更有助于揭示氣味受體的結構與其生理功能之間的關系。解析蛋白質三維結構的主要研究方法有X射線晶體學技術、核磁共振技術和冷凍電鏡技術。由于X射線晶體學和核磁共振技術適用于水溶性蛋白結構解析，因此多種昆蟲OBPs 的三維結構大多是利用以上兩種方法完成的(張玉等, 2019; 杜亞麗等, 2020)。但這兩種技術不適用大分子蛋白結構解析，因此無法實現膜蛋白ORs的三維結構研究。冷凍電鏡技術(cryo-electron microscopy, Cryo-EM)的快速發展為揭示大分子蛋白生物結構與功能互作機制提供了技術支撐。該技術與X射線晶體學技術和核磁共振技術相比，在樣品處理方面有著極大的優勢，無需將大分子樣品制成晶體，只需在低溫下通過透射電子顯微鏡即可獲得生物大分子的近 “原子級” 的分辨率成像，經過圖像處理和重構計算，模擬出生物大分子的三維結構。冷凍電鏡技術已成功應用于昆蟲氣味受體結構研究，Butterwick等(2018)利用該技術首次揭示了分辨率為3.5?的寄生性榕小蜂ApocryptabakeriOrco晶體結構，del Mármol等(2021)利用該技術解析了原始昆蟲石蛃Machilishrabei的MhraOR5晶體結構。Butterwick等(2018)和del Mármol等(2021)發現昆蟲氣味受體的4個蛋白質亞基組成了選擇性離子通道，4個亞基松散地結合在通道的中心孔上，就像一朵花瓣。離子通道由1個胞外離子通道入口和4個胞內離子通道出口組成，離子通道最窄處的S7b 上的疏水氨基酸V469和L473是調控離子通道選擇性的關鍵氨基酸位點(Butterwicketal., 2018)。該離子通道在氣味配體刺激后出現胞外Ca2+內流和陽離子非選擇性的離子電導，進一步說明了氣味分子激發的氣味受體信號轉導是通過開放的離子通道實現的(Satoetal., 2008)。Butterwick等(2018)發現寄生性榕小蜂A.bakeriOrco的其中一個亞基的第1-6部分跨膜結構在胞外形成配體結合口袋(ligand-binding pocket)，也稱“受體口袋”。del Mármol等(2021)利用冷凍電鏡技術揭示了石蛃M.hrabei的MhraOR5與其配體丁香酚和驅蟲劑避蚊胺的結合機制，研究發現將受體口袋上的蛋氨酸Met209突變為更小的疏水氨基酸時(纈氨酸或丙氨酸)，擴大了受體口袋，從而增加了受體對較大分子避蚊胺的親和力，而降低了對較小分子丁香酚的親和力。這可能是因為丁香酚結構較小，無法很好契合較大的受體口袋。del Mármol等(2021)揭示了昆蟲氣味受體蛋白口袋的單個氨基酸的突變就足以改變其結合特性，進而影響受體與化合物的相互作用，有助于揭示昆蟲氣味受體基因家族的分子演變，為進一步闡明氣味識別機制提供了重要依據。

3 氣味受體的表達和定位

基因表達和蛋白定位等信息有助于推測氣味受體的特異性功能，為后續功能研究提供理論基礎。目前主要利用半定量反轉錄PCR(semi-quantitative reverse transcription PCR, RT-PCR)、實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)、原位雜交(insituhybridization)和免疫組織化學(immunohistochemistry)等生物化學、分子生物學技術手段分析OR基因的時空表達和ORs定位。

熒光原位雜交用于分析氣味受體RNA水平的組織定位，Hou等(2020)利用此方法發現半紫毛頂蛾Eriocraniasemipurpurella的氣味受體EsemOR3, EsemOR4和EsemOR5主要定位在識別性信息素的耳形感器內部，因此推測這些受體可能參與了性信息素識別過程。此外，不同熒光染料標記多種蛋白可以用來分析ORs之間或ORs與其他嗅覺蛋白之間的互作關系。Forstner等(2009)使用地高辛和生物素對多音天蠶Antheraeapolyphemus的ApolOR1和PBP基因分別進行熒光標記，結果表明ApolOR1和3個PBP基因均能在一種毛形感器中共表達，說明了PBPs與淋巴液中性信息素特異性結合并將其運送至ApolOR1，進而引發嗅覺反應。Yang K等(2017)通過雙色原位雜交實驗，發現煙青蟲H.assulta觸角上C類型毛形感器內不同的神經元內可以共表達性信息素受體基因HassOR14b和HassOR6或者HassOR14和HassOR16，揭示了不同功能的PRs在同一類型毛形感器內組合表達的分子機制；Pregitzer等(2019)報道沙漠蝗Schistocercagregaria的33個OR基因能夠與性信息素識別相關的感覺神經元膜蛋白(sensory neuron membrane protein, SNMP)基因SNMP1 共表達，初步推測這些OR基因可能參與了沙漠蝗的性信息素識別過程。

免疫組織化學用于分析氣味受體蛋白水平上的組織定位，可以更為直觀地觀察氣味受體蛋白的組織分布情況。Benton等(2006)利用免疫組織化學方法證明了黑腹果蠅D.melanogasterOrco(OR83b)與OR43a互作形成復合體并在神經元樹突上準確定位并維持其穩定性。Auer等(2020)利用CRISPR/Cas9技術敲除果蠅DrosophilasechelliaOR22a后，通過免疫組織化學方法證明了OR22a在突變體觸角部位不能成功表達和定位，為進一步闡明OR22a嗅覺功能提供了有利證據。與熒光原位雜交相比，免疫組織化學需要制備氣味受體的特異性抗體，而膜蛋白抗體制備相對復雜，因此氣味受體定位研究仍以原位雜交方法為主。

半定量RT-PCR和qRT-PCR常用于研究OR基因在不同組織、發育階段和性別中的表達模式。半定量RT-PCR方法相對簡捷，主要根據電泳條帶的明暗程度反映OR基因的表達量，但該方法無法量化。實時熒光定量PCR將基因表達量數值化，準確度高于半定量檢測方法。至今為止，通過半定量RT-PCR和qRT-PCR方法解析了多數昆蟲氣味受體的表達譜，為后續功能特異性研究提供理論依據。大部分OR基因在成蟲期的觸角中高表達，少數在幼蟲期表達，如棉鈴蟲H.armigera、中國梨咯木虱C.chinensis和梨小食心蟲G.molesta(Dietal., 2017; Xuetal., 2019; Chenetal., 2020)。研究顯示，鱗翅目昆蟲雄蟲通過觸角上靈敏的嗅覺系統識別同種雌蟲釋放的特異性信息素來尋找合適的配偶，因此參與性信息素識別的PRs一般特異性地表達于雄蟲觸角(Fleischeretal., 2018; Liu YPetal., 2018; Bastin-Hélineetal., 2019; Liu XLetal., 2019)。OR基因除了在觸角內高表達或特異性表達外，也有少部分OR基因在喙、產卵器和足等其他組織中表達(Chooetal., 2018; Duetal., 2018a; Guoetal., 2018)。如煙青蟲H.assulta氣味受體基因HassOR31在產卵器中表達量顯著高于觸角和其他組織中的表達量，經體外功能驗證表明該氣味受體可以幫助雌蟲精確選擇寄主植物作為產卵地點(Li RTetal., 2020)。

綜上所述，OR基因表達特異性與其生理功能密切相關，分析OR基因在不同組織、不同性別、不同發育階段的表達特性以及ORs在昆蟲組織中的定位情況，將為功能基因篩選提供理論依據。

4 氣味受體的功能研究方法

隨著生物技術的快速發展，關于ORs功能研究的方法逐漸多樣化，主要分為體內和體外研究方法。常用的體外功能研究方法為爪蟾卵母細胞表達系統結合雙電極電壓鉗技術(TEVC)，利用轉基因果蠅異源表達系統結合單感器記錄技術，以及細胞系異源表達系統結合鈣離子成像技術。體內功能研究方法有RNA干擾(RNAi)技術和CRISPR/Cas9基因編輯技術。本文查閱了2015-2019年昆蟲氣味受體功能鑒定的文獻，統計了利用不同研究方法鑒定ORs功能的文章數量(圖2)。統計結果表明：體外功能研究方法在5年內ORs功能研究中占比75.76%，其中爪蟾卵母細胞表達系統結合雙電極電壓鉗技術占比43.94%，其次是轉基因果蠅異源表達系統結合單感器記錄技術占比19.70%，再次是HEK293細胞系異源表達系統(占10.61%)，該數據說明了爪蟾卵母細胞表達系統結合雙電極電壓鉗技術在ORs功能研究中具有普遍適用性；體內表達方法以CRISPR/Cas9基因編輯技術(12.12%)和RNAi技術(12.12%)為主。不同研究方法的作用機理和方法特點各不相同，下面將從功能研究方法的使用特點、應用范圍和影響因素進行詳盡的闡述，為ORs功能研究方法的選擇提供一定的借鑒作用。

圖2 2015-2019年昆蟲氣味受體功能鑒定方法發文統計

4.1 氣味受體的體外功能研究方法

4.1.1爪蟾卵母細胞表達系統結合雙電極電壓鉗技術：第一個完成功能鑒定的昆蟲氣味受體是黑腹果蠅D.melanogasterDmelOR43a，通過爪蟾卵母細胞表達結合雙電極電壓鉗技術證實了DmelOR43a能夠識別果實中常見的氣味分子環己酮、環己醇、苯甲醛和苯甲醇(Wetzeletal., 2001)。該系統是將體外合成的OR和Orco的cRNA共同注射到爪蟾卵母細胞中，體外培養3～5 d，將氣味配體灌流通過爪蟾卵母細胞對其進行刺激，利用雙電極電壓鉗技術記錄刺激前后的電流差，從而確定氣味受體與配體之間的功能。隨著該技術不斷地完善和改進，目前已成為昆蟲氣味受體功能研究中最常用的體外研究方法。據不完全統計，2015-2019年利用該技術對ORs功能的研究占所有研究方法的43.94%，該技術在2019年ORs研究中占比高達61.90%，且主要應用于鱗翅目昆蟲氣味受體功能研究(圖2)。在爪蟾卵母細胞表達系統中，雙委夜蛾A.dissimilis氣味受體AdisOR1對性信息素(順)-9-十四碳烯醇[(Z)-9-tetradecenol]和(順)-9-(反)-12-十四碳烯二烯醇[(Z)-9-(E)-12-tetradecadienol] 具有強烈的電生理反應(Liu XLetal., 2019)；二點委夜蛾A.lepigone性信息素受體OR3特異識別性信息素(順)-7-十二碳烯乙酸酯[(Z)-7-dodecenyl acetate] (Zhang YNetal., 2019)；蘋果蠹蛾C.pomonella氣味受體CpomOR2a和CpomOR5均能被其次要性信息素組分(反)-8-(反)-10-十二碳二烯醇乙酸酯 [(E,E)-8, 10-dodecadien-1-yl acetate] 所激活(Tianetal., 2021)。該系統也適用于鱗翅目昆蟲普通氣味受體的配體篩選，如Wu H等(2019)借助該系統發現煙青蟲H.assulta氣味受體HassOR23特異性識別植物揮發物(反)-β-法尼烯[(E)-β-farnesene]而躲避天敵；Wang等(2020)通過該系統證明了煙青蟲H.assulta氣味受體HassOR67能夠識別煙草Nicotianatabacum揮發物壬醛(nonanal)進而引誘雌成蟲產卵；Guo等(2021)利用爪蟾卵母細胞表達系統全面測定了棉鈴蟲H.armigera44個氣味受體對67種寄主植物揮發物的反應，鑒定了28個氣味受體的配體，繪制了棉鈴蟲氣味受體家族編碼寄主植物揮發物的功能圖譜，揭示了棉鈴蟲氣味受體通過組合編碼的方式識別復雜的寄主揮發物。爪蟾卵母細胞表達系統不僅廣泛應用于鱗翅目昆蟲氣味受體功能研究，在其他目昆蟲中也有報道(Zhang RBetal., 2017; Zhang RBetal., 2019; Liu YPetal., 2020; Zhangetal., 2021)。Li HM等(2020)利用該系統檢測了大灰優蚜蠅E.corollae氣味受體EcorOR25能夠特異性識別14種芳香族化合物，如丁香酚(eugenol)和甲基丁香酚(methyl eugenol)等，表明EcorOR25可能是大灰優蚜蠅識別芳香族化合物的主要受體；Liu YP等(2020)的研究揭示了柑橘大實蠅B.minax氣味受體BminOR24能夠識別常見植物揮發物芳樟醇(linalool)，說明BminOR24可能參與了寄主識別等生命過程；Zhang等(2021)利用雙電極電壓鉗技術對3種盲蝽象性信息素受體功能進行研究，結果表明綠盲蝽A.lucorum性信息素受體AlucOR2/51、苜蓿盲蝽A.lineolatusAlinOR4/6 和中黑盲蝽AdelphocorissuturalisAsutOR6均能夠識別性信息素組分(反)-2-己烯基丁酸酯[(E)-2-hexenyl butyrate]，而對另一個組分丁酸己酯(hexyl butyrate)反應較弱，闡明了不同種盲蝽象性信息素受體對性信息素識別的分子機制。

爪蟾卵母細胞表達系統結合雙電極電壓鉗技術之所以成為目前應用最廣的體外功能研究方法，得益于其細胞個體大、易培養、操作簡單、結果穩定等優點，且注射氣味受體cRNA后能在短時間內表達并實現功能記錄(Wang Betal., 2016)，適用于氣味配體的快速篩選(Guoetal., 2021)。

4.1.2轉基因果蠅異源表達系統結合單感器記錄技術:轉基因果蠅異源表達系統是繼爪蟾卵母細胞表達系統之后的第二大類體外功能研究方法，在2015-2019年ORs功能研究中占比19.70%(圖2)。該系統主要有兩個突變體系統，即果蠅“empty neuron”空神經元系統和 “OR67dGAL4knock-in” 突變系統。Dobritsa等(2003)建立了果蠅 “empty neuron” 空神經元系統，該系統敲除果蠅錐形感器內嗅覺受體神經元ab3A上表達的氣味受體基因OR22a和OR22b，從而獲得果蠅空神經元 “△halo” 突變體，利用GAL4/UAS系統以OR22a的啟動子驅動Gal4的表達，進一步使UAS驅動下游異源OR基因在 “△halo” 空神經元中表達，再利用單感器記錄技術記錄錐形感器ab3A神經元對氣味配體的反應。de Fouchier等(2017)利用該系統成功解析了?；页嵋苟闟.littoralis氣味受體 SlitOR35, SlitOR4, SlitOR14, SlitOR17和SlitOR31的功能。

果蠅錐形感器 “空神經元” 系統可用于大多數昆蟲氣味受體的功能鑒定，但不適用于毛形感器中表達的法尼醇受體(DmelOR83c)和鱗翅目性信息素受體的功能鑒定(Syedetal., 2006; Montagnéetal., 2012; Ronderosetal., 2014; Wang Betal., 2016, 2018)。研究發現在缺失昆蟲感覺神經元膜蛋白SNMP1 的突變果蠅品系中，表達性信息素受體 DmelOR67d 的神經元無法識別果蠅性信息素(順)-十八碳烯醇醋酸鹽(cis-vaccenyl acetate, cVA)，但轉入SNMP1 基因后對cVA的反應恢復正常，這說明 SNMP1 對果蠅感受性信息素是必不可少的(Bentonetal., 2007)。不僅如此，SNMP1 對于鱗翅目昆蟲毛形感器中表達的PRs感受性信息素配體也是必需的(Syedetal., 2010; Breeretal., 2019; Lemkeetal., 2020; Liu Setal., 2020)。為此，研究人員開發了另一種果蠅突變系統，即 “OR67dGAL4knock-in” 突變系統(Kurtovicetal., 2007)。該系統利用GAL4/UAS將目的OR基因表達在果蠅at1毛形感器空神經元中，再結合SSR技術記錄表達異源受體的神經元的功能(Kurtovicetal., 2007)?！癘R67dGAL4knock-in” 突變系統已廣泛應用于鱗翅目昆蟲PRs的配體篩選和功能研究。如蘋果蠹蛾C.pomonella受體CpomOR6a在轉基因果蠅毛形感器at1神經元中表達時能夠靈敏地識別性信息素拮抗劑(反)-8-(反)-10-十二碳二烯-1-醇乙酸酯[(E,E)-8,10-dodecadien-1-yl acetate] (Cattaneoetal., 2017)；Wang B等(2018)利用該系統異源表達煙青蟲H.assulta、棉鈴蟲H.armigera和煙芽夜蛾Heliothisvirescens3個近緣種的性信息素受體OR13，結果顯示3種昆蟲的OR13均能夠特異性識別性信息素成分(順)-11-十六碳烯醛(cis-11-hexadecenal)。

轉基因果蠅技術為OR基因異源表達提供了觸角感器淋巴液等生理環境以及蛋白組件。該方法采用單感器記錄技術使得待測氣味分子以氣體形式進入至感器內部，更符合真實的細胞環境。然而該系統也存在一定的缺點，例如獲得轉基因果蠅品系過程復雜且耗時長，操作復雜、且難度較大(Wang Betal., 2016)。

Wang B等(2016, 2018)比較了爪蟾卵母細胞表達系統與轉基因果蠅異源表達系統在ORs功能研究上的適應性，結果表明兩個研究方法得到的結果是一致的，說明了這兩個系統均適用于氣味受體功能研究。因此，在進行ORs功能鑒定時，可以先采用爪蟾卵母細胞表達系統在體外快速篩選氣味受體對應的配體，再結合轉基因果蠅異源表達系統進一步精確地鑒定氣味受體的功能，實現雙系統快速且準確鑒定ORs與配體之間的一一對應關系。使用不同表達系統鑒定ORs功能對溶劑選擇也有一定的要求，例如溶劑正己烷揮發性強，更適合于轉基因果蠅系統中對特定化合物激活的受體功能檢測；而石蠟油具有重復性好的特點，適合高通量篩選化合物；二甲基亞砜溶解性較好，是爪蟾卵母細胞系統的較為理想的溶劑。

4.1.3細胞系異源表達結合電生理技術:細胞系異源表達系統結合鈣離子成像方法也成功應用于昆蟲氣味受體的功能研究。該技術原理是將構建好的OR和Orco的基因表達載體轉染到細胞系并啟動瞬時表達，利用膜片鉗或者鈣離子成像技術檢測氣味受體對配體的反應。常用細胞系主要包括人類胚腎細胞系(HEK293細胞系)和草地貪夜蛾S.frugiperda卵巢細胞系(Sf9細胞系)等。HEK293細胞系在異源細胞系表達中應用最為廣泛，目前已在蘋果蠹蛾C.pomonella、紅醋栗穿孔蛾Lamproniacapitella和半紫毛頂蛾E.semipurpurella等昆蟲中成功應用(Cattaneoetal., 2017; Yuvarajetal., 2018; Houetal., 2020)。除了常用的HEK293細胞系，Xu 等(2015)通過Sf9細胞系異源表達系統明確煙青蟲H.assulta性信息素受體HassOR13能夠特異性識別性信息素成分(順)-11-十六碳烯醛[(Z)-11-hexadecenal]。但有報道表明，Sf9細胞系異源表達OR基因系統中具有功能反應的細胞比例較低(Corcoranetal., 2014)。

體外功能研究方法簡便易行，但是缺乏體內真實的細胞生理條件及細胞表達的上游環境(Miazzietal., 2019a, 2019b)。因此，研究人員通過在反應體系中添加相應的PBP，提高了性信息素受體對性信息素的敏感性和選擇性(Grosse-Wildeetal., 2006; Sunetal., 2013; Changetal., 2015; Zhang QHetal., 2017)。近期，Hou等(2020)系統地比較了兩種體外功能研究方法，結果表明借助爪蟾卵母細胞表達系統異源表達半紫毛頂蛾E.semipurpurellaEsemOR4能夠特異性識別性信息素成分(順)-6-壬烯-2-醇[(R,Z)-6-nonen-2-ol]，而HEK293細胞系表達系統則未能識別該配體，說明了爪蟾卵母細胞結合雙電極電壓鉗技術更加能夠準確地反映OR識別氣味配體的功能。

4.2 氣味受體體內功能研究方法

盡管體外功能研究能夠記錄ORs的功能反應特征，但ORs在昆蟲體內的生理特性及其作用機理并不十分清楚。因此，體內功能研究方法應運而生，為真實、準確地研究氣味受體功能提供了新途徑。

4.2.1基因沉默技術：RNA干擾(RNA interference, RNAi)是基因沉默常用的技術手段。Fire等(1998)首次在秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans中證明了雙鏈 RNA(double-stranded RNA, dsRNA)是基因沉默的有效方法。RNAi技術主要作用機制可分2步，1)切割外源dsRNA：dsRNA進入細胞后被細胞內的核酸內切酶Dicer剪切成小干擾RNA(siRNA)；2)目的基因沉默：siRNA解鏈后，反義鏈與RNA誘導沉默復合物(RNA-induced silencing complex, RISC)結合，再與目的基因mRNA 結合并將其降解，從而引起靶標基因功能沉默(Bernsteinetal., 2001)。

dsRNA通常以注射、飼喂、浸泡和涂抹等方法進入昆蟲體內，其中注射方式最為常用且效果最好。RNAi技術發展早且相對成熟，具有簡單、便捷的特點，在半翅目和膜翅目昆蟲氣味受體功能驗證研究中得以廣泛應用。Zhang RB等(2017)發現注射dsApisOR5后的豌豆蚜Acyrthosiphonpisum喪失了其對蚜蟲報警信息素(反)-β-法尼烯[(E)-β-farnesene]的識別能力，說明ApisOR5在豌豆蚜識別報警信息素的過程中發揮著重要作用，為以該受體為靶標篩選高效穩定的蚜蟲驅避劑奠定了理論基礎；Wang YL等(2017)報道干擾荔枝蝽平腹小蜂AnastatusjaponicusAjapOR35基因后，其對具有產卵吸引效應的化學物質(反)-α-法尼烯[(E)-α-farnesene]和β-石竹烯(β-caryophyllene)的EAG 反應值下降，說明AjapOR35可能與其寄主定位和產卵行為密切相關。

RNAi技術也具有一定的局限性，例如在鞘翅目昆蟲中基因沉默效率較高，但在鱗翅目昆蟲中干擾效果不太理想(胡少茹等, 2019; 曹松等, 2020)，主要原因是dsRNA易被鱗翅目昆蟲體內的核酸降解酶降解，致使RNAi效率較低(Shuklaetal., 2016; Guanetal., 2018)。其次，當外源合成的dsRNA/siRNA以飼喂、浸泡和涂抹等方法進入昆蟲體內，需要穿透害蟲腸道圍食膜、細胞膜甚至體壁等屏障，進而降低沉默效率。再次，雖然傳統的注射方式效果較好，但易對昆蟲造成損傷且不易操作。RNAi技術的另一個缺陷是具有時效性，沉默效果會隨著時間的推移慢慢消失，而且不能夠穩定遺傳(Linetal., 2015; Chenetal., 2020)。隨著納米科學的不斷發展，納米材料作為一種dsRNA遞送載體，可以提高dsRNA穿透害蟲體壁等屏障的能力，提升沉默效率。相較于傳統的遞送策略，納米載體介導的RNAi遞送系統具有高效、穩定、低劑量、緩釋等優點(Yanetal., 2021)。因此，RNAi技術結合納米載體有望快速實現RNAi農藥商品化，為害蟲防控提供了新思路。

4.2.2基因編輯技術：基因編輯是指利用核酸內切酶在基因組的特定位置產生位點特異性雙鏈斷裂，誘導細胞自身的 DNA 損傷修復機制對切口位置進行非同源末端連接或同源重組修復，從而產生基因插入、缺失等多種突變類型?；蚓庉嫾夹g已從第一代的鋅指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFNs)技術發展到第二代轉錄激活樣效應因子核酸酶(transcription activator-like efector nucleases, TALENs)技術，再到第三代CRISPR/Cas系統[clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated proteins]。新興起的CRISPR/Cas9 技術依靠單鏈向導RNA(single-guide RNA, sgRNA)對原間隔序列毗鄰基序(protospacer adjacent motif, PAM)上游約20 nt的靶序列識別，再通過Cas9核酸酶進行切割，實現基因組定點編輯。

隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術的不斷完善，該技術已成功用于昆蟲傳統氣味受體共受體(Orco)和鱗翅目昆蟲性信息素受體(PRs)等的功能研究(圖2)。Fandino等(2019)敲除煙草天蛾M.sexta氣味受體共受體基因MsexOrco后，其對性信息素和寄主植物揮發物等氣味的電生理反應顯著降低，說明了MsexOrco在煙草天蛾嗅覺識別過程中的必要性；敲除印度跳蟻Harpegnathossaltator的Orco基因后，其工蟻對信息素的感受能力明顯下降且突變體的觸角葉體積和嗅小球的數量明顯減少(Yanetal., 2017)。CRISPR/Cas9技術以其操作的便捷性，高效的基因編輯能力在鱗翅目昆蟲氣味受體功能研究中漸受青睞。Chang HT等(2017)利用CRISPR/Cas9技術敲除棉鈴蟲H.armigera性信息素受體基因HarmOR16后，突變體雄蟲喪失了對(順)-11-十六碳烯醇[cis-11-hexadecenol]的趨避行為反應，且不能區分雌蟲是否性成熟，進而與未成熟的雌蟲進行交配，導致后代存活率降低。該項研究結果揭示了HarmOR16受體參與調控棉鈴蟲H.armigera選擇最優交配時間的分子機制。Garczynski等(2017)等通過該技術發現蘋果蠹蛾C.pomonella性信息素受體基因CpomOR1-/-突變體雌蟲的產卵量及卵孵化率均顯著下降，證明了CpomOR1與其雌蟲的生殖能力密切相關。Liu XL等(2020)利用 “體外(爪蟾卵母細胞表達系統)+體內(CRISPR/Cas9技術)” 雙系統證實了PxylOR35和PxylOR49共同決定小菜蛾P.xylostella雌蛾的產卵選擇性，揭示了小菜蛾雌蟲利用植物揮發物定位寄主進行產卵的關鍵分子機制。Guo等(2021)發現鱗翅目中存在一個高度保守的直系同源基因(棉鈴蟲H.armigera氣味受體基因HarmOR42及其同源基因)且形成獨特的進化分支，并通過“體外(爪蟾卵母細胞表達系統)+體內(CRISPR/Cas9技術)” 雙系統證明了棉鈴蟲氣味受體HarmOR42能夠特異識別被子植物花香的主要揮發物苯乙醛(phenylacetaldehyde)，說明該受體在鱗翅目昆蟲尋找寄主植物特別是花的過程中發揮至關重要的作用。CRISPR/Cas9技術在其他目昆蟲中也有報道，Guo等(2020)借助 “體外(爪蟾卵母細胞表達系統)+體內(CRISPR/Cas9技術)” 雙系統證實了LmigOR35是東亞飛蝗L.migratoria群聚信息素4-乙烯基苯甲醚(4-vinylanisole)的特異性受體，繼而對東亞飛蝗群居信息素功能進行了全面而充分的鑒定和驗證。

與基因沉默技術相比，CRISPR/Cas9技術能夠徹底沉默目的基因表達，因此結果更為準確且能穩定遺傳。該技術可以實現同時剪切靶基因上多個靶標位點，設計更加靈活(Gaoetal., 2016)。但也具有一定局限性，例如基因編輯技術步驟較為復雜，需要通過多代篩選來獲得純合突變品系，操作過程對儀器平臺以及操作人員熟練程度要求較高。同時，該系統存在一定的脫靶現象，但通過兩個sgRNA靶標一個基因可以有效降低脫靶率(Kleinstiveretal., 2016; Zhang DBetal., 2017)。

5 小結與展望

昆蟲嗅覺系統在昆蟲行為選擇過程中發揮著重要作用，其中氣味受體是外周神經系統中接收嗅覺識別信號的關鍵蛋白，研究ORs的功能對于解析昆蟲嗅覺編碼機制十分重要。自21世紀始，關于昆蟲ORs的研究論文層出不窮。Montagné等(2015)綜述了2000-2014年(15年)期間昆蟲ORs的研究進展以及研究技術的發展歷程。在此基礎上，本文針對2015年以來(近5年)有關昆蟲OR研究工作的發文情況進行了統計分析，歸納總結了昆蟲OR基因鑒定、表達定位、蛋白結構等的研究方法、原理和特點等。分析結果顯示，2015-2019年利用基因組測序技術在27種昆蟲中鑒定了2 543個OR基因，利用轉錄組測序技術從89種昆蟲中鑒定了5 111個OR基因(表1; 表2)，為昆蟲ORs結構和功能的研究奠定基礎。隨著結構生物學的發展，利用冷凍電鏡技術實現了昆蟲ORs蛋白結構的解析，為揭示大分子蛋白生物結構與功能互作機制提供了技術支撐。此外，本文重點綜述了昆蟲氣味受體功能研究常用技術的原理和特點，分析了各自的優勢和不足，列舉了重要害蟲ORs的研究進展，為ORs研究方法的選擇提供一定的借鑒作用(Wang Betal., 2016, 2018; Caoetal., 2020; Houetal., 2020)。

盡管昆蟲氣味受體功能研究已經取得了重大進展，但是仍有以下幾個方面需要深入研究：1)昆蟲體內擁有大量氣味受體基因，隨著生物信息學的快速發展，應繼續挖掘重大農林害蟲的嗅覺基因，并且針對每一個特異性基因開展功能研究，全面系統揭示害蟲識別寄主植物、交配和產卵以及躲避天敵等行為的分子機制。發展更加簡便快捷、高靈敏度且重復性好的基因功能驗證手段仍是未來一段時間內的主要目標。2)目前鱗翅目昆蟲中的PRs功能研究取得了較大的進展，但其他目昆蟲的ORs功能研究仍然較少。近年來，在害蟲識別配偶和寄主植物的嗅覺分子機制進行了深入研究，而有關昆蟲如何協同識別性信息素和寄主植物揮發物的分子機制尚未明確。此外，天敵昆蟲與害蟲之間的氣味識別機制研究仍不夠深入，挖掘天敵識別害蟲的關鍵嗅覺基因，有助于篩選天敵昆蟲行為調節劑，降低靶標害蟲危害。3)氣味受體功能研究正從基因水平轉向蛋白結構層面，冷凍電鏡技術的快速發展促進了昆蟲氣味受體三級結構的解析。氣味受體蛋白晶體結構結合蛋白組學等方法有助于揭示氣味分子與ORs的結合機制及其激活模式，從結構生物學角度深入探討每一種昆蟲如何演化出自己的獨特受體，從而特異性識別寄主植物、配偶和天敵等化學線索。4)盡管我們針對氣味受體功能基礎研究取得了一些進展，但如何將這些理論成果應用于害蟲防控更值得我們深入思考。RNAi技術在害蟲防治領域已取得突破性進展，但由于dsRNA合成成本較高，少有成熟產品問世。隨著合成生物學的飛速發展，通過改造工程菌有望實現低成本、大規模合成dsRNA，這一技術為開發新型昆蟲行為調節劑提供了新視角。同時，基因編輯技術的發展為基于轉基因昆蟲進行害蟲防治提供了新途徑，通過敲除害蟲關鍵靶標基因，干擾害蟲交配和定位寄主，壓低田間蟲口數量，實現綠色防控。