沙蔥螢葉甲成蟲觸角感器超微結構及對沙蔥揮發物的觸角電位反應

李 玲, 李 娜, 龐保平

(1. 內蒙古農業大學草原昆蟲研究中心, 呼和浩特 010020; 2. 鄂爾多斯市農牧業技術推廣中心, 內蒙古鄂爾多斯 017200)

沙蔥螢葉甲Galerucadaurica屬于鞘翅目(Coleoptera)葉甲科(Chrysomelidae)螢葉甲亞科(Galerucinae)，是一種近年來在內蒙古草原上猖獗成災的新害蟲，為寡食性害蟲，主要危害沙蔥Alliummongolium、野韭A.ramosum、多根蔥A.polyrhizum等百合科(Liliaceae)蔥屬Allium植物，其中沙蔥是其最適寄主(昊翔等, 2014)。該蟲一年發生1代，幼蟲和成蟲均能危害蔥屬植物莖葉，其中以春季幼蟲為害最重，嚴重影響當地農牧民的生產生活，并對草原生態環境和畜牧業可持續發展構成嚴重威脅。老熟幼蟲和成蟲分別有聚集于石塊、牛糞及雜草叢下化蛹和滯育越夏的習性(昊翔等, 2015)。一般認為，嗅覺在昆蟲的取食和聚集等生命活動中起著至關重要的作用(Fieldetal., 2000; Asahinaetal., 2008)。目前對嗅覺系統在沙蔥螢葉甲寄主植物選擇及聚集過程中的作用知之甚少。因此，急需開展沙蔥螢葉甲嗅覺感受及其機理的研究，而了解觸角感器的結構及觸角電位反應是研究嗅覺系統的基礎。

昆蟲觸角上不同類型的感受器是昆蟲識別揮發性化學信號的基本結構。昆蟲的感受器是由體壁表皮特化形成的，是感受外界信息的最基本的結構單元，感受器的形態學和結構的觀察是感器功能研究的基礎。觸角感器根據其表皮突的外觀可分為：毛形感器(sensilla trichodea)、錐形感器(sensilla basiconica)、刺形感器(sensilla chaetica)、腔錐形感器(sensilla coeloconica)等(Schneider, 1964)。感受器淋巴液中分布著一個或多個嗅覺受體神經元(olfactory receptor neuron, ORN)。ORN具有兩極，其中一極為神經元樹突，伸向觸角感受器的頂端，其膜上分布著能特異性識別氣味分子的嗅覺受體(olfactory receptor, OR)，且OR將接受到的化學信號轉化為電生理信號；另一極為伸向聯系神經元的軸突，軸突將電生理信號傳遞至觸角神經葉放大處理，最終傳遞至大腦(Jacquin-Joly and Merlin, 2004)。大腦將電生理信號加工整合后發出指令，進而通過運動神經元調控昆蟲的行為反應(Kriegeretal., 1993)。國內外學者對鞘翅目許多昆蟲的觸角感器及電生理反應進行了研究，如：斑鞘豆葉甲Colposcelissignata的觸角感器類型有8種，包括毛形感器Ⅰ型和Ⅱ型、刺形感器、錐形感器、指形感器、腔錐形感器、栓錐形感器Ⅰ型和Ⅱ型、鐘形感器和B?hm氏鬃毛(徐偉等, 2020)。馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata成蟲觸角著生感器主要為毛形感器、錐形感器、腔形感器和B?hm氏鬃毛(劉麗玲等, 2021)。張萌萌等(2020)通過電生理及行為生測試驗發現反-3-己烯醇和順-3-己烯醇對東方絹金龜Maladeraorientalis雌成蟲具有顯著的吸引作用。銅綠麗金龜Anomalacorpulenta對水楊酸甲酯有顯著的電生理反應(鞠倩等, 2016)。

本研究通過掃描電子顯微鏡初步觀察了沙蔥螢葉甲成蟲觸角上感受器的類型和分布特點，應用氣譜-質譜聯用儀(GC-MS)鑒定了其最適寄主植物——沙蔥的揮發物組分，并利用觸角電位技術(electroantennography, EAG)測定了沙蔥螢葉甲成蟲對寄主植物主要揮發性氣味物質的電生理反應，以期為進一步揭示沙蔥螢葉甲的化學感受機理，并為研發以行為調控為基礎的沙蔥螢葉甲綠色防控技術提供必要的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試昆蟲：沙蔥螢葉甲3齡幼蟲于2017年采自內蒙古錫林郭勒盟鑲黃旗，在人工氣候箱中以沙蔥飼喂至成蟲，羽化后立即將雌雄成蟲分開飼養，選擇3日齡成蟲進行試驗。飼養條件：溫度26±1℃，光周期16L∶8D，相對濕度60%～80%。

1.1.2供試植物：寄主植物沙蔥于2017年采自內蒙古錫林浩特市，移栽到花盆中在室內培養。

1.2 觸角感器類型的觀察及鑒定

在解剖鏡下用手術刀分別切下雌、雄成蟲的觸角各3根，將其浸入70%的酒精中，用超聲波清洗儀清洗2次，每次10 min。然后在70%, 80%, 90%及100%的不同濃度梯度酒精中進行逐級脫水，自然干燥24 h。將干燥的觸角用導電膠粘到樣品臺上，噴金后使用日立S-530型掃描電子顯微鏡觀察并拍照。根據Schneider (1964)的觸角感器分類方法，確定沙蔥螢葉甲雌雄成蟲觸角上分布的感器類型。

1.3 沙蔥揮發物成分的鑒定

采用頂空動態吸附收集法采集沙蔥揮發物。調節氣流計流速0.5 L/min，采集時間6 h，重復收集2次，每次設置一個空白對照。玻璃管吸附柱(內徑3.5 mm)內填充的吸附劑為Super Q(美國Alltech公司)，采集完畢后取下吸附管，用重蒸二氯甲烷(>99.99%)將吸附管中的樣品淋洗于樣品瓶中，將瓶口密封后在-20℃冰箱中保存，待檢測。

利用氣相色譜質譜聯用儀GC(7890B)-MS(5977A)(Agilent，美國)對收集到的沙蔥揮發物樣品進行定性和相對定量分析。樣品進樣量3 μL，進樣口溫度250℃，無分流進樣。色譜柱為HP-5MS，設置升溫程序：40℃ 2 min，以6℃/min的速率上升至250℃，保持2 min。柱氣流量為1.0 mL/min，氣譜/質譜接口溫度為280℃。通過檢索庫Mass Hunter確定揮發物組分。

1.4 觸角電位反應

使用重蒸二氯甲烷將二烯丙基硫醚、1,3-二噻烷、二甲基三硫醚、二烯丙基二硫、二烯丙基三硫醚、二甲基二硫醚、順-2-己烯-1-醇、月桂烯、2-己烯醛、苯甲酸甲酯、己醛、環庚三烯和對二甲苯13種氣味標準品(均購自Sigma-Aldrich公司)分別配制成1 mol/L，測定沙蔥螢葉甲成蟲對不同氣味化合物的觸角電位反應，以二氯甲烷為溶劑對照。另外，將二烯丙基硫醚、順-2-己烯-1-醇、2-己烯醛、苯甲酸甲酯、己醛和二烯丙基二硫6種氣味化合物分別配制成1， 0.1， 0.01, 0.001, 0.0001和0.00001 mol/L 6個濃度梯度，測定沙蔥螢葉甲成蟲對不同濃度化合物的觸角電位反應。

用手術刀將羽化3 d的沙蔥螢葉甲成蟲觸角切下，再將觸角端部切去少許。用導電膠將其固定在兩個金屬電極之間。剪取1 cm×0.5 cm的濾紙片，滴加10 μL的待測樣品后放入巴斯德管中，待基線平穩后踩踏腳踏板，記錄響應值。每個樣品測試雌雄觸角各6根(生物學重復)。

1.5 數據分析

在SPSS軟件中對觸角電位反應值進行數據分析。雌雄之間差異顯著性分析采用成對樣本t檢驗，顯著水平為0.05；不同化合物及不同濃度之間差異顯著性分析所用方法為單因素方差分析，Duncan氏檢驗方法，顯著水平為0.05。

2 結果

2.1 沙蔥螢葉甲成蟲觸角基本形態特征、感器類型及分布情況

沙蔥螢葉甲雌雄成蟲觸角均為線狀，共11節，由柄節、梗節和鞭節組成。通過掃描電子顯微鏡觀察發現柄節和梗節表皮較為平滑，感器分布較少。鞭節表皮呈魚鱗狀，分布著大量感器，且從第1節到末節感器數量逐漸增多。

沙蔥螢葉甲觸角上分布的感器類型主要有5種，分別是B?hm氏鬃毛(B?hm bristles, BB)、毛形感器(sensilla trichodea, ST)、刺形感器(sensilla chaetica, SC)、錐形感器(sensilla basiconica, SB)和鐘形感器(sensilla campaniformia, SCa)。此外，在觸角表面還發現許多表皮孔(epidermal pore, P)，觸角各節均有分布。

2.1.1B?hm氏鬃毛：B?hm氏鬃毛(BB)呈刺狀垂直于觸角表面，基部深陷于觸角表皮內，成簇地著生于柄節和梗節基部，每簇約15根左右，長度為9.3～11.32 μm(圖1: A和B)。

圖1 沙蔥螢葉甲成蟲觸角感器類型

2.1.2毛形感器：毛形感器根據形態和大小可分為3類，即毛形感器1、毛形感器2和毛形感器3。

毛形感器1(ST1)呈長毛狀，基部到端部逐漸變尖細，近端部彎曲呈弧形，與觸角表面形成角度較小，多成匍匐狀。長度為95.24～123.81 μm，主要分布在梗節和柄節(圖1: B)。

毛形感器2(ST2)細長呈針狀，徑直向前，與觸角表面呈30～40°，長約28.05～47.56 μm，具有明顯的縱紋。主要分布在鞭節，基部位于鱗片縫隙中，數量較多(圖1: C)。

毛形感器3(ST3)長度較短，尖細如刺，表面光滑，長度約為9.76～14.63 μm。主要分布在鞭節第5～9節(圖1: C)。

2.1.3刺形感器：刺形感器(SC)與毛形感器2形狀相似，但其端部較為鈍圓。著生于觸角表皮的凹穴內，與觸角表面呈60°左右夾角，明顯高于其他類型感器。長度為44.44～74.07 μm，主要分布在鞭節，在鞭節末節頂端分布最密(圖1: C和E)。

2.1.4錐形感器：錐形感器(SB)比毛形感器和刺形感器都短，其表面光滑，端部鈍圓(圖1: D)。根據形態可分為錐形感器1(SB1)和錐形感器2(SB2)。零散分布于鞭節第6-9節，數量較少。

錐形感器1(SB1)頂端鈍圓，基部向端部逐漸變細，向前彎曲如指狀，長度為11.56 μm，與錐形感器2相比更為尖細。

錐形感器2(SB2)著生于四周表皮隆起的凹窩內，表面光滑，端部鈍圓，近圓柱形，長度為10.67 μm。

2.1.5鐘形感器：鐘形感器(SCa)邊緣隆起略高于觸角表皮，中間呈錐形突起。在雌雄觸角鞭節最后1節均只發現1個此類感器(圖1: F)。

2.2 沙蔥揮發物成分分析

采用頂空動態收集法和GC-MS技術測定了沙蔥的揮發物成分。結果顯示，沙蔥揮發物主要由32種化合物組成(表1)，其中，含量最高的為二烯丙基二硫，其次為烯丙基甲基二硫醚，這兩個組分均為含硫化合物，占總量的43.16%；其他組分相對含量均不到10%。 含硫化合物共有9種，占總量的49.3%。

表1 沙蔥揮發物組分及含量

2.3 沙蔥螢葉甲成蟲對沙蔥揮發物的觸角電位反應

從沙蔥揮發物中挑選了13種化合物分別配制成1 mol/L進行觸角電位試驗。從圖2中可看出，雌成蟲對二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫、順-2-己烯-1-醇、2-己烯醛、苯甲酸甲酯和己醛表現出較強的觸角電位反應，EAG值均大于0.5 mV，其中對2-己烯醛的觸角電位反應最為強烈，顯著高于對其他化合物；雄成蟲對2-己烯醛和二烯丙基二硫也表現出較強的觸角電位反應，EAG反應值大于0.5 mV。除二甲基二硫醚和對二甲苯外，雌成蟲對多數氣味化合物的EAG反應值均高于雄成蟲，且雌成蟲對二烯丙基硫醚的觸角電位反應值顯著高于雄成蟲(P<0.05)，對其余氣味化合物的EAG值在雌雄之間差異不顯著(P>0.05)。

圖2 沙蔥螢葉甲成蟲對寄主植物揮發物(1 mol/L)的觸角電位反應

從沙蔥螢葉甲成蟲對不同氣味化合物的觸角電位試驗中篩選了6種反應值較強的化合物，包括二烯丙基硫醚、順-2-己烯-1-醇、2-己烯醛、苯甲酸甲酯、己醛和二烯丙基二硫，將其稀釋成不同濃度梯度，檢測沙蔥螢葉甲成蟲對不同濃度的這6種化合物的觸角電位反應。結果顯示(圖3)，隨著二烯丙基硫醚濃度的增加，雌雄成蟲的EAG反應值均呈上升趨勢，且在濃度為0.1和1 mol/L時雌雄成蟲的EAG值顯著高于對其他濃度梯度的EAG值(P<0.05)，當二烯丙基硫醚濃度在0.01 mol/L時，雌雄之間的EAG反應值存在顯著性差異(P<0.05)。順-2-己烯-1-醇在0.01 mol/L濃度下時成蟲的EAG值下降，之后隨著濃度的增加EAG值逐漸上升；沙蔥螢葉甲成蟲對0.1 mol/L 2-己烯醛的觸角電位反應最強，EAG值顯著高于對其他濃度梯度2-己烯醛的(P<0.05)，雌雄之間差異不顯著(P>0.05)。苯甲酸甲酯濃度為0.1 mol/L時，沙蔥螢葉甲雌成蟲的EAG值最高，顯著高于對0.001 mol/L苯甲酸甲酯(P<0.05)，雄成蟲對不同濃度苯甲酸甲酯的EAG值均無顯著差異(P>0.05)。沙蔥螢葉甲成蟲對己醛的EAG值隨著濃度的增加呈上升趨勢，在1 mol/L時，EAG值最高，顯著高于對其他濃度梯度(P<0.05)，其次為0.1 mol/L，各濃度下雌雄之間的EAG值無顯著差異(P>0.05)。二烯丙基二硫在濃度為0.01 mol/L時，沙蔥螢葉甲成蟲的EAG值達到飽和之后不再上升，在0.01～1 mol/L濃度之間時，沙蔥螢葉甲成蟲的EAG值顯著高于對其他低濃度梯度的EAG值(P<0.05)，雌雄之間的EAG值差異不顯著(P>0.05)?？傮w來說，當化合物濃度為1 mol/L時，測試的這6種化合物(除2-己烯醛外)均能激發沙蔥螢葉甲成蟲產生最強的觸角電位反應。

圖3 沙蔥螢葉甲成蟲對不同濃度化合物的觸角電位反應

3 討論

鞘翅目昆蟲常見的觸角感器有毛形感器、刺形感器、錐形感器及板形感器等。本研究首次對沙蔥螢葉甲成蟲觸角進行了掃描電鏡觀察，發現沙蔥螢葉甲成蟲觸角上具有毛形感器、刺形感器、錐形感器、鐘形感器和B?hm氏鬃毛共5種類型感器，其中，毛形感器分布最廣、數量最多(圖1)。有研究表明，油菜藍跳甲Psylliodeschrysocephala的毛形感器表皮壁較厚，壁上有毛孔，具有觸覺和嗅覺功能(Bartletetal., 1999)。在許多鱗翅目昆蟲中，毛形感器被證明與性信息素的特異性識別有關。例如，利用單感器記錄技術表明雄蛾觸角上的毛形感器對雌蛾釋放的性信息素相關化合物很敏感(Maidaetal., 2000; Pophofetal., 2005; Wuetal., 2015)。此外，毛形感器也被證明參與寄主植物揮發物的識別(Andersonetal., 2009; Tanakaetal., 2009)。刺形感器在觸角上的著生特點是，無論在什么位置都直立于觸角表面，并且比其他感器明顯高出許多，這一形態特點易于首先接觸到物體，因而被認為具有感受機械刺激的功能(Schneider, 1964)。一些研究發現刺形感器表皮壁較厚，具有頂孔，存在感覺神經元樹突，推測其可能具有味覺功能(Maetal., 2016)。棉鈴蟲Helicoverpaarmigera觸角上的刺形感器對果糖反應敏感，且對果糖有特異性反應的味覺受體HarmGR4在刺形感器中表達(Jiangetal., 2015)。錐形感器也是昆蟲觸角上常見的感器類型，是典型的嗅覺感器類型，其作用主要是感受和識別寄主植物揮發物和環境中的其他信息化合物。前人通過原位雜交和免疫組織化學等技術，發現許多昆蟲的嗅覺相關蛋白在錐形感器中特異性表達或高表達，且對寄主植物揮發物具有很強的結合能力(Xuetal., 2013; Zhangetal., 2013; Sunetal., 2014, 2015)。目前對鐘形感器的研究較少，一般認為鐘形感器為有孔結構，感受器穿過表皮而伸出，與腔錐感器有聯系，對氣味、二氧化碳、溫濕度敏感；也有一些學者認為鐘形感器沒有孔，表皮呈蘑菇狀突起插入表皮圓柱狀凹陷內，是一種溫濕度感器。有研究表明歩甲Pterostichusaethiops觸角鐘形感器中的感覺細胞A對低溫較為敏感(Meriveeetal., 2003)。B?hm氏鬃毛是一種感受重力的機械感器，當遇到機械刺激時，能夠緩沖重力的作用力，從而控制觸角位置下降的速度(Schneider, 1964)。在蛾類飛行中，B?hm氏鬃毛能夠調控觸角姿態使其保持在合適的位置上，當切除此類感器后會導致蛾類在飛行中觸角與翅的碰撞(Krishnanetal., 2012)。

我們采用頂空動態收集法和GC-MS技術從沙蔥中鑒定出32種揮發性化合物，其中含硫化合物共有9種，占總量的49.3%(表1)。烏仁張嘎(2011)采用水蒸氣蒸餾法提取、乙醚萃取沙蔥中的揮發油, 利用 GC -MS從沙蔥揮發油中共鑒定出37 種化合物，多為含硫化合物，與本研究結果一致。劉世巍等(2007)采用水蒸氣蒸餾法提取、乙醚萃取沙蔥中的揮發油, 利用GC -MS分析其化學成分，共鑒定出15種組分，主要為酯類、醛類、酸類、酮類及烷烴化合物。與本研究結果完全不同，這可能是由于沙蔥生長地及揮發物收集方法的不同所造成的。

EAG測試結果表明，二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫、順-2-己烯-1-醇、2-己烯醛、苯甲酸甲酯和己醛6種化合物能引起沙蔥螢葉甲雌成蟲較為強烈的觸角電位反應，二烯丙基二硫和2-己烯醛能引起沙蔥螢葉甲雄成蟲較為強烈的觸角電位反應(圖2)，說明這些化合物可能在成蟲定位寄主植物過程中發揮作用。其中二烯丙基硫醚和二烯丙基二硫屬于硫化物，具有強烈的刺激性氣味，是蔥、蒜等百合科蔥屬植物的標志性成分(何洪巨等, 2004; Chengetal., 2014; Lietal., 2015)。同時，二烯丙基二硫(別名大蒜素)也是沙蔥揮發物中含量最高的組分，這一結果與沙蔥螢葉甲只取食沙蔥、多根蔥、野韭等百合科蔥屬植物相一致(昊翔等, 2014)。此外，除二甲基二硫醚和對二甲苯外，雌成蟲對其他化合物的EAG值均高于雄成蟲(圖2)，這種現象在其他昆蟲中也常有出現。同種昆蟲由于性別和生理狀態的差異，植物揮發物組分在其行為反應中所起的作用不同，因而對植物揮發物各組分的敏感性也不同(李祥等, 2021)。美國白蛾Hyphantriacunea雌、雄蛾對寄主植物揮發物的觸角電位反應不同。斑鞘豆葉甲Colposcelissignata雌、雄成蟲對不同揮發物的EAG反應也存在顯著差異(樊瑞冬等, 2021)。我們前期對沙蔥螢葉甲嗅覺相關基因表達譜的研究表明，多數氣味結合蛋白基因OBP和化學感受蛋白基因CSP在雌蟲觸角中的表達量顯著高于雄蟲，說明雌性具有較為靈敏的嗅覺系統(Lietal., 2017, 2018)。 另外，當化合物濃度在0.1 mol/L時2-己烯醛和濃度為1 mol/L時測試的另外5種化合物均能激發沙蔥螢葉甲成蟲產生最強的觸角電位反應(圖3)，說明在這個濃度范圍內，沙蔥螢葉甲對化合物的電生理反應較為敏感。

觸角電位技術能夠記錄昆蟲整根觸角上全部嗅覺感器的總電位反應。沙蔥的6種化合物能夠引起沙蔥螢葉甲成蟲較為強烈的觸角電位反應，而本研究中觀察到的沙蔥螢葉甲成蟲觸角感器包括了毛形感器和錐形感器兩類嗅覺感器，其中毛形感器有3種，錐形感器有2種，且毛形感器的數量較多，分布最廣(圖1)，推測毛形感器和錐形感器在沙蔥螢葉甲識別寄主揮發物的過程中發揮了重要作用。Pophof等(2005)通過單感器記錄技術表明仙人掌螟Cactoblastiscactorum觸角上的毛形感器對信息素相關化合物很敏感。桉樹天牛Phoracanthasemipunctata觸角上的錐形感器對植物揮發物有特異反應(Lopesetal., 2002)。沙蔥螢葉甲觸角單個感受器的具體功能需通過觸角單感器記錄系統進行進一步研究。

綜上所述，本研究首次對沙蔥螢葉甲成蟲觸角感器的類型和分布特點進行了觀察，并根據前人對其他昆蟲觸角感器的研究推測了沙蔥螢葉甲觸角各類感器的功能；采用頂空動態收集法和GC-MS分析了沙蔥螢葉甲的最適寄主植物沙蔥的揮發物成分，并通過EAG試驗測試了沙蔥螢葉甲成蟲對沙蔥主要揮發物的電生理反應。今后，還需利用透射電鏡觀察該蟲觸角感器的超微結構，利用單細胞電位記錄等方法確定各類感器的功能，為深入研究沙蔥螢葉甲的化學感受機制奠定一定基礎。還需結合行為及田間試驗對能夠引起沙蔥螢葉甲觸角電位反應的活性物質進行進一步驗證和篩選，以期開發出安全、高效的植物源引誘劑。