磷酸酶和張力蛋白同源物在創傷性顱腦損傷患者外周血單個核細胞中的表達及與神經功能恢復的關系

丁錦榮，管義祥，劉小江

南通大學附屬海安醫院神經外科，江蘇 南通 226600

顱腦損傷是臨床中發病率較高的創傷類型，病死率居所有創傷首位[1]。據相關研究報道[2]，我國每年約60萬例顱腦損傷發生，病死率65%～80%。神經功能恢復與創傷性顱腦損傷患者的預后有關，腦部神經功能恢復越差，預后也越差[3-4]。目前臨床中尚缺乏對創傷性顱腦損傷患者神經功能恢復狀況進行預測的特異性標志物?；A醫學研究報道[5]，磷酸酶和張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologues，PTEN)在間充質干細胞外分泌體中的表達與海馬區神經干細胞的增殖能力有關，可通過調控多種細胞間的信號傳導促進細胞凋亡，推測PTEN在外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中的表達可能參與腦損傷的病理過程。目前PTEN在創傷性顱腦損傷患者PBMC中的表達及與神經功能恢復的關系尚不清楚。本研究前瞻性研究2019年6月—2021年5月筆者醫院收治的創傷性顱腦損傷患者臨床資料，探討PTEN在創傷性顱腦損傷患者PBMC中的表達及與神經功能恢復的關系。

資料與方法

1 一般資料

納入標準：(1)年齡>18歲；(2)經影像學檢查確診為顱腦損傷[6]；(3)格拉斯哥昏迷評分(Glasgow coma score，GCS)3～11分；(4)受傷至入院治療時間<12h。排除標準：(1)腦疝或惡性腫瘤；(2)免疫系統或代謝功能障礙；(3)合并其他部位損傷；(4)心、肝、腎、免疫系統或血液系統等嚴重疾??；(5)合并血液系統疾病或凝血功能障礙；(6)既往腦創傷史；(7)精神疾病。

本組創傷性顱腦損傷患者(82例)、健康志愿者(75例)，分別記為腦傷組和健康對照組。腦傷組男性54例，女性28例；年齡31～64歲，平均53.1歲。健康對照組男性42例，女性33例；年齡32～68歲，平均55.5歲。本研究患者及家屬均簽署知情同意書，獲筆者醫院醫學倫理委員會批準(JCZ21028)。

2 PBMC分離及PTEN mRNA表達檢測方法

采集所有研究對象外周血10mL(創傷性顱腦損傷患者于入院后治療前、健康者于體檢當天)，使用PBMC分離液分離PBMC(北京康瑞納生物科技有限公司)，用于逆轉錄-聚合酶鏈反應法(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測。提取PBMC總RNA，反轉錄為cDNA，設計PTEN和內參基因β-actin上下游引物，PTEN上游引物：5’-GGGCTAGTTTGCAAAGTTT-3’，下游引物：5’-ACATTTCGCTAGCCTGAAAT-3’，產物長度125 bp；β-actin上游引物：5’-ATTGCATTTGCATTCTGAC-3’，下游引物：5’-GCCATGGTGAGCGTATTAC-3’，產物長度118 bp；引物序列、大小均由上海生工生物公司合成。按反應條件進行擴增：95℃，3min；95℃，10s；60℃，20s；72℃，30s；40個循環。根據2-△△Ct計算PTEN mRNA相對表達量。

3 治療方法

依據《顱腦創傷和腦科危重癥治療學》[7]，給予創傷性顱腦損傷患者降低顱內壓、營養支持及通氣等規范治療。

4 資料收集

收集可能影響創傷性顱腦損傷患者的神經功能恢復的相關因素，主要包括性別、年齡、體質量指數(BMI)、受傷至入院治療時間、住院時間、吸煙史、飲酒史、是否為開放性損傷、是否合并糖尿病、高血壓、高血脂癥、是否進行手術、致傷原因、顱腦損傷嚴重程度、合并疾病數量、GCS[8]、昏迷時間及PTEN mRNA。

5 觀察指標

(1)比較兩組研究對象臨床資料及PTEN mRNA在PBMC中的表達；(2)治療1個月后統計創傷性顱腦損傷患者的神經功能恢復情況，采用改良Rankin量表(modified rankin scale，mRS)[9]對創傷性顱腦損傷患者的神經功能恢復情況進行評定，并分為恢復良好組(mRS評分0～2分)和恢復不良組(mRS評分3～6分)；(3)比較恢復良好組和恢復不良組患者的臨床資料；(4)Logistic回歸分析影響創傷性顱腦損傷患者的神經功能恢復的危險因素；(5)分析PTEN mRNA對創傷性顱腦損傷患者的神經功能恢復不良的預測效能。

6 統計學分析

結 果

1 兩組研究對象臨床資料及PTEN mRNA在PBMC中的表達比較

兩組研究對象性別、年齡、BMI比較，差異無統計學意義(P>0.05)；腦傷組PTEN mRNA高于健康對照組(P<0.05)。見表1。

2 創傷性顱腦損傷患者的神經功能恢復情況

本組82例創傷性顱腦損傷患者，21例患者神經功能恢復不良，神經功能恢復不良發生率25.61%。

3 恢復良好組和恢復不良組患者臨床資料比較

恢復不良組住院時間、開放性損傷占比、進行手術占比、重度顱腦損傷占比、昏迷時間及PTEN mRNA均多于恢復良好組(P<0.05)，GCS則低于恢復良好組(P<0.05)。見表2。

4 影響創傷性顱腦損傷患者神經功能恢復的危險因素

以住院時間、GCS、昏迷時間、PTEN mRNA(均為連續變量)、開放性損傷(否=0，是=1)、進行手術(否=0，是=1)、顱腦損傷嚴重程度(重度=0，輕中度=1)為自變量，創傷性顱腦損傷患者的神經功能恢復情況為因變量，恢復不良=1，恢復良好=0，進行Logistic回歸分析，多因素分析結果顯示，重度顱腦損傷、GCS及PTEN mRNA均為影響創傷性顱腦損傷患者神經功能恢復的危險因素(OR=2.852、3.374、4.011，P<0.05)。見表3。

5 PTEN mRNA對創傷性顱腦損傷患者神經功能恢復不良的預測效能

ROC曲線分析顯示，PTEN mRNA對創傷性顱腦損傷患者神經功能恢復不良預測的最佳截斷點1.72，靈敏度71.43%，特異度80.33%，AUC值0.784。見圖1。

表1 兩組患者臨床資料及PTEN mRNA在PBMC中的表達比較

表2 恢復良好組和恢復不良組患者臨床資料比較

表3 影響創傷性顱腦損傷患者的神經功能恢復的多因素Logistic回歸分析

ROC：受試者工作特征

討 論

顱腦損傷指頭部由于遭受外界劇烈、嚴重傷害所導致的腦挫裂傷、顱內水腫等，近年來隨著交通事故的頻發，創傷性顱腦損傷的發生率呈逐年升高趨勢[10-11]。顱腦損傷具有并發癥多、致殘病死率高等特點，嚴重影響了患者預后。據相關研究表明[12]，顱腦損傷患者神經功能恢復與預后密切相關。目前臨床中尚缺乏對顱腦損傷患者神經功能恢復進行有效評估預測的高特異性標志物，探討PTEN在創傷性顱腦損傷患者PBMC中的表達及與神經功能恢復的關系具有十分重要的臨床意義。

本研究結果顯示，腦傷組PTEN mRNA高于健康對照組，提示相比健康者，創傷性顱腦損傷患者PTEN mRNA異常偏高。PTEN為具有蛋白性和脂性雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因，主要分布于細胞核和細胞質中。既往研究表明[13-14]，PTEN參與多種細胞間的信號傳導，其可通過磷酸化調控與受體結合，形成復雜的調節網絡，與神經元的凋亡密切相關，在中樞神經系統損傷防護、再生中具有重要作用。本研究中創傷性顱腦損傷患者神經功能恢復不良發生率25.61%，提示創傷性顱腦損傷患者神經功能恢復不良發生率較高，本研究結果與朱輝和周樹生[15]研究結果相近。本研究結果表明，恢復不良組住院時間、手術治療占比、開放性損傷占比、重度顱腦損傷占比、昏迷時間及PTEN mRNA均多于恢復良好組，GCS則低于恢復良好組。經Logistic回歸分析結果顯示，重度顱腦損傷、GCS及PTEN mRNA均為影響創傷性顱腦損傷患者神經功能恢復的危險因素，提示重度顱腦損傷、GCS及PTEN mRNA均為影響創傷性顱腦損傷患者神經功能恢復的危險因素，臨床中需逐一控制各項因素對創傷性顱腦損傷患者的影響，以降低神經功能恢復不良的發生率。重度顱腦損傷、GCS均與創傷性顱腦損傷患者的病情直接相關，可直接影響患者神經功能的恢復[16-17]。PTEN所編碼的蛋白質與中樞神經系統神經干細胞的增殖、分化能力有關，據相關研究報道[18]，PTEN可通過調控相關通路活性影響mTOR等下游關鍵分子的表達，近而抑制神經元再生，并可阻礙神經損傷后的再生修復。ROC曲線分析顯示，PTEN mRNA對創傷性顱腦損傷患者的神經功能恢復不良預測的最佳截斷點1.72，靈敏度71.43%，特異度80.33%，AUC值0.784，提示PTEN mRNA可作為預測創傷性顱腦損傷患者神經功能恢復不良的重要參考指標。本研究創新之處在于有針對性的對創傷性顱腦損傷患者PTEN在PBMC中的表達進行分析，并探討PTEN與神經功能恢復的相關性，以期通過PTEN表達情況對該類患者神經功能恢復狀況進行評估。

綜上所述，PTEN在創傷性顱腦損傷患者PBMC中的表達與神經功能的恢復存在一定的相關性，PTEN mRNA可作為預測創傷性顱腦損傷患者神經功能恢復不良的重要參考指標，建議在臨床中對創傷性顱腦損傷患者PBMC中PTEN mRNA的表達進行監測，以降低神經功能恢復不良的發生率。

作者貢獻聲明：丁錦榮：論文修改及審校、資料搜集、論文撰寫；管義祥：研究指導、論文修改、經費支持、病例隨訪、數據整理；劉小江：資料收集、論文撰寫、文獻檢索、病例資料整理及統計學分析/研究(內容)設計