不同亞麻籽膠添加量對大豆分離蛋白成膜性能的影響

胡海玥，石可歆，李海嶺，李子來，袁哲，周彩瑩，楊晨，3*，汪建明*

（1.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.山東天驕生物技術有限公司，山東 菏澤 274108；3.優滋福（天津）食品科技有限公司，天津 300457）

隨著現代食品工業科學技術的不斷更新與發展，可食用膜作為一種具有可降解性能的環保新型食品包裝出現在人們的視野中。同時，為了增加其柔韌性并降低脆性，常使用甘油、山梨糖醇等作為增塑劑，降低聚合物分子間的內聚力，增加聚合物鏈的流動性[1]。將各類可食用的材料應用于食物保鮮方面具有非常悠久的歷史，比如將食用蠟涂抹在食品表面用于保鮮，但保鮮效果不佳[2]。

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）是一種常見的食品添加劑，多數以低溫脫溶大豆粕為原料生產，其蛋白質含量在90%以上，蛋白質內部存在氫鍵、肽鍵、疏水鍵、二硫鍵、離子鍵等化學結構，具有一定的穩定性，并含有人體必需氨基酸[3-4]。SPI來源廣泛，具有良好的成膜能力[5-6]。但是單一的SPI膜存在機械強度不足、功能性較差[7]等缺點，從而導致其應用范圍受到限制。Yan等[8]研究SPI與多酚結合物的形成對蛋白質結構和乳化性能的影響，結果表明表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）的加入改變了SPI多肽鏈的二級結構和三級構象，可見β-鏈含量減少，α-螺旋和無規則卷曲含量增加。SPI與EGCG以質量比3∶200共價結合后，復合物表現出最佳的溶解性和乳化性能。陽暉[7]通過探究仙草膠對可食性蛋白膜功能特性的影響及作用機理，發現仙草膠和蛋白質分子之間存在著相互作用，如共價交聯和分子間氫鍵作用，添加適量仙草膠會使蛋白膜中無序結構減少，而有序結構增加；而添加過量仙草膠會破壞膜的結構，導致無序結構增加。因此，以SPI為成膜基質，添加其他具有功能性的物質，能夠提高膜的物理-機械強度和增加功能性。亞麻籽膠（faxseed gum，FG）是一種綠色安全的食品添加劑，由國家綠色食品發展中心認定[9-10]，在食品工業中，因其具有良好的增稠性、乳化性和乳化穩定性[11]，被廣泛用作增稠劑、乳化劑和穩定劑[12-13]。一般來說，在食品配方中添加增稠劑會改變其流變特性，通過增加增稠劑的濃度，不僅會增加流體的剪切黏度，還會增加流體的拉伸黏度[14]。Jiang等[15]利用FG和魔芋葡甘聚糖制備新型復合凝膠的水膠體，研究結果表明，復合凝膠的微觀結構變得致密，孔徑變??；FG和魔芋葡甘聚糖分子鏈之間表現出強烈的相互作用和協同效應。

本研究以SPI作為成膜基質，探究不同FG添加量對SPI膜的作用機理，將SPI與FG以不同質量比復配，以甘油為增塑劑制備復合膜，對復合膜的橫截面微觀結構、二級結構、熱穩定性進行分析，并對成膜液的流變特性、粒徑進行測定。本研究旨在為今后研究多糖與SPI的作用機制提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI（98%，食品級）：山東萬得福生物科技有限公司；FG（99%，食品級）：浙江一諾生物科技有限公司；甘油（食品級）：天津津東天正精細化學試劑廠；氫氧化鈉（分析純）：天津市津科精細化工研究所；溴化鈉（分析純）：天津市華東試劑廠。

1.2 儀器與設備

HJ-6A恒溫磁力攪拌器：上海易友儀器有限公司；GZX-9030MBE電熱鼓風干燥箱：上海博旭醫療生物儀器股份有限公司；D-500高剪切分散均質機：德國維根技術（北京）有限公司；FGG1800通風櫥：武漢貝科科技股份有限公司；NICOLET IS50傅里葉變換紅外光譜儀：德國Thermo Scientific公司；SU1510掃描電子顯微鏡：日本Hitachi公司；Q50熱重分析儀：美國TA Instruments有限公司；Bettersize2600激光粒度分析儀：黑龍江丹東百特儀器有限公司；MARS60動態流變儀：德國HAAKE有限公司。

1.3 FG/SPI成膜液及復合膜的制備

準確稱取SPI粉末5 g，溶于100 mL蒸餾水中，磁力攪拌10 min至SPI完全溶解，調節pH值至10，加入2 mL甘油，放入80℃水浴鍋攪拌加熱30 min，將FG按照 0%、1%、2%、3%、4%、5%的添加量與 SPI充分混合（分別用 FG-0、FG-1、FG-2、FG-3、FG-4、FG-5 表示），繼續加熱30 min，然后均質5 min，冷卻至室溫（25℃），靜置30 min，獲得成膜液，備用。

將70 mL成膜液倒入20 cm×20 cm的亞克力平板上，鋪勻，放入通風櫥內干燥24 h后取出揭膜。將膜放入裝有飽和NaBr溶液的干燥器中，平衡2 d后進行測定。

1.4 成膜液流變特性測定

參考 Murillo-Martínez等[16]的方法，并稍作修改。取一定量的成膜液滴于動態流變儀測試臺平行板上，選用CP50錐板，將平行板的間距設定為1 mm，在25℃下進行試驗。在靜態流變性能測定中，設定模式為控制速率，將剪切速率設置為0.01 s-1～100 s-1。測定動態流變性能時，先對成膜液進行應變掃描，確定成膜液的線性黏彈性區，頻率為10 Hz～0.1 Hz。設定模式為控制應變，測定成膜液的儲能模量（G′）和損耗模量（G″）。

1.5 成膜液粒徑測定

參考Zuo等[17]的方法，用激光粒度分析儀測定分析成膜液的粒徑分布。分散相和水的折射率分別為1.570和1.333，測試溫度為25℃。在分析前用蒸餾水將樣品稀釋至1/1 000。

1.6 膜橫截面的微觀結構觀察

應用掃描電子顯微鏡觀察膜的橫截斷面，將樣品用液氮進行淬斷，用導電膠將膜垂直固定于載物臺上，噴金，將斷面放大1 000倍觀察。

1.7 膜的紅外光譜檢測

應用傅里葉變換紅外光譜儀采集蛋白膜在4 000 cm-1～400 cm-1的紅外吸收光譜，應用衰減全反射附件，分辨率為4 cm-1，掃描次數為32[18]。

1.8 膜的熱失重分析

參考雷會寧[19]的方法，應用熱重分析儀測定膜的熱失重曲線，稱取5 mg～8 mg膜樣品，以氮氣為載氣，測定溫度為0℃～600℃，升溫速率為20℃/min。

1.9 數據統計分析方法

采用SPSS 23.0軟件進行方差分析和差異顯著性分析。試驗所得數據利用Excel進行數據整理，通過Origin 2018軟件對試驗數據進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 FG添加量對成膜液靜態流變特性的影響

成膜液的流變學行為與其性質和結構有著很強的關聯性[7]。如果成膜液的黏度過高，可能會導致成膜時膜內氣泡難以消除，但如果黏度過低，成膜時膜的厚度會較薄，導致性能的降低。不同FG添加量對成膜液表觀黏度的影響如圖1所示。

圖1 不同FG添加量對成膜液表觀黏度的影響Fig.1 The effect of different FG addition amount on the apparent viscosity of film-forming liquid

所有樣品在剪切速率為0.1 s-1～100 s-1時均表現出剪切稀化現象，屬于假塑性流體（非牛頓流體）。這種現象主要是由于成膜液內部結構隨著剪切速率增加而被破壞，導致黏度降低[20]。由圖1可知，與FG-0成膜液相比，FG-1、FG-2和FG-3成膜液的表觀黏度略有下降，可能是由于FG-0成膜液表現出了弱凝膠狀態[15]，而FG的添加，阻礙了SPI自身的作用，使空間位阻效應發生，導致這種弱凝膠狀態被破壞，從而造成成膜液表觀黏度的下降[21]。陽暉[7]在仙草膠/SPI成膜液中也發現添加少量的仙草膠會使蛋白質與仙草膠成膜液表觀黏度降低，推測是仙草膠會引起蛋白質交聯，使有效分子體積增大。在制備成膜液的過程中，添加FG后繼續加熱30 min，這時，FG和SPI易發生美拉德反應[20]，使蛋白質發生交聯，增大其分子的有效體積[22]，也會使成膜液的表觀黏度降低。而FG-4和FG-5成膜液的表觀黏度與FG-0成膜液相比有了提升，原因可能是過量的FG未能與SPI作用。根據Liu等[14]的研究結果，FG是一種陰離子雜多糖，D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、L-半乳糖、D-半乳糖醛酸和L-鼠李糖是FG的主要成分。FG作為一種水膠體，具有明顯的保水能力和流變特性，以及弱凝膠性能，可以與水反應，使更多的水分子被固定，從而導致表觀黏度的增加。

2.2 FG添加量對成膜液動態流變特性的影響

動態流變學可以反映各種組分之間的相互作用和結構特征[23]。因此，應用小幅度振蕩剪切，研究FG添加量對成膜液動態流變特性的影響。圖2為FG添加量對成膜液G′和G″的影響。

圖2 不同FG添加量對成膜液G′和G″的影響Fig.2 The effect of different FG addition amount on the G′and G″of film-forming liquid

由圖2可知，所有成膜液的儲能模量（G′）和損耗模量（G″）均隨著頻率升高而逐漸增大，因此所有的成膜液都可以被認為是彈性弱凝膠。在0.1 Hz～10 Hz頻率范圍內，所有成膜液的G′都大于其相應的G″，表示成膜液的不可逆變性程度小于可逆變性程度，即彈性行為大于黏性行為。這種現象可能是由于分子鏈有足夠的時間在低頻下解開和重新排列[15]，表明成膜液是黏性流體。因為纏結點在臨時交聯連接區中發揮作用，所以分子鏈在高頻下解開的時間較短[24]。但是由于在膠體懸浮液中不存在糾纏效應，這意味著FG和SPI具有良好的相容性，這兩個組分之間具有緊密的交聯網絡結構[25]。當FG添加量為1%～3%時，FG中的親水基團[13]減弱了SPI分子自身之間的相互作用，減少凝集。Guerrero等[26]研究發現，添加少量的多糖會導致蛋白質分子之間的作用被減弱。而FG-4和FG-5成膜液的G′和G″高于FG-0，FG有很強的吸水性，其水溶液具有較高的黏度，該現象可能與過量的未與SPI反應的FG有關，即過量的FG抑制了SPI分子之間的相互作用[27]，影響SPI的凝膠結構，從而增大成膜液的G′和G″值。

2.3 FG添加量對成膜液粒徑的影響

動態光散射可以在一定程度上反映FG對成膜液中粒徑分布的影響。圖3是不同FG添加量對復合膜成膜液粒徑的影響。

圖3 FG添加量對成膜液粒徑的影響Fig.3 The effect of FG addition amount on the particle size of the film-forming liquid

由圖3可知，不同成膜液的粒徑分布均呈現雙峰狀態。FG-0成膜液的粒徑為14.86 μm，隨著FG添加量的增大，成膜液的平均體積也隨之發生變化，在添加量為0%～2%時，粒徑隨FG添加量增加而增大，FG-1粒徑為 33.47 μm，FG-2粒徑為 55.62 μm，FG-3粒徑為58.38 μm。這可能是因為FG與SPI相互作用并聚集[28]，致使粒徑增大。當FG添加量大于3%時，成膜液的粒徑增加量變大，FG-4的粒徑為75.67 μm，FG-5的粒徑下降至68.44 μm，這種現象可能是由于大量的FG不能與蛋白質分子交聯，從而導致FG自身聚集，使成膜液的粒徑增大，從而證明了流變學中當FG添加量大于3%時的成膜液黏度增大這一推測。所有添加FG的成膜液的粒徑均大于單一SPI成膜液。

2.4 FG添加量對膜斷面微觀結構的影響

膜斷面的微觀結構可以在一定程度上反映膜是否具有均一性和致密性[29]。FG/SPI復合膜橫截斷面微觀結構如圖4所示。

圖4 FG/SPI復合膜斷面掃描電鏡圖（1 000×）Fig.4 Scanning electron micrograph of cross-section of FG/SPI composite film（1 000×）

由圖4可知，所有膜的橫截斷面均表現出了較為緊密的狀態，不同的FG添加量對其膜斷面的紋理有一定的影響。FG-3的斷面最為平整，其余FG添加量的膜均存在一定程度上呈現鱗片狀或條紋的紋理，但均勻致密，沒有出現FG與SPI不融合的情況，說明成膜液中的各組分之間相容性較好。單一SPI膜（FG-0）、FG-1和FG-2的橫截面有一定的褶皺，原因可能是FG添加量不足，大多數蛋白質分子未與FG發生交聯，蛋白質分子之間形成了作用力，出現了聚集的趨勢。

FG-3的橫截斷面平整，無明顯紋理或突起，這可能是因為當FG添加量為3%時，減弱了SPI分子之間的相互作用。當FG添加量大于3%時，即FG-4和FG-5的復合膜橫截面也出現了褶皺，根據對成膜液流變特性的測定，發現FG-4和FG-5的成膜液黏度較高，導致其成膜比FG添加量為0%～3%的成膜液要困難，不容易形成均一穩定的體系，這個現象與張盼[30]的研究結論相似。也可能是FG之間的作用使其出現了團聚的現象，從而使膜的橫截面變得不均勻，影響其宏觀性質。

2.5 FG添加量對膜二級結構的影響

采用傅里葉變換紅外光譜分析研究FG添加量對膜二級結構的影響，結果見圖5。

圖5 FG添加量對復合膜二級結構的影響Fig.5 The effect of FG addition amount on the secondary structure of the composite film

所有膜樣品在1 031 cm-1～1 039 cm-1處都顯示出一個特征性吸收峰，這是在制作膜過程中所添加的甘油的特征峰[17]。所有膜樣品在酰胺I帶和酰胺Ⅱ帶處均顯示特征峰。3 270 cm-1～3 273 cm-1主要反映了分子間羥基的伸縮振動變化[31]。2 923 cm-1～2 924 cm-1代表的是-CH2拉伸。添加了FG后，3 273 cm-1處峰位置和強度的細微變化表明了氫鍵的產生[32]，證明了SPI和FG之間存在氫鍵的相互作用。1 630 cm-1～1 650 cm-1代表的是C=N伸縮振動峰，這里的形狀也發生了細微的改變，而這種改變在FG-2時最大，代表有一定的美拉德反應在FG和SPI之間產生，從而導致結構的改變。由此可得，FG對SPI膜的化學結構有一定的影響?；瘜W結構的變化，可以引起膜宏觀性質的改變，在對膜的橫截面微觀結構進行觀察時發現，FG-3的膜橫截面相較其他膜而言較為均一致密，也與氫鍵的產生有關[33]。

2.6 FG添加量對膜熱穩定性的影響

測定材料的熱失重分解溫度可以判斷其熱穩定性[18]。FG 添加量對復合膜熱重（thermal gravimetry，TG）和差熱重（differential thermal gravimetry，DTG）曲線的影響如圖6所示。

圖6 FG添加量對復合膜TG和DTG曲線的影響Fig.6 The effect of FG addition amount on the TG and DTG curves of composite film

由圖6可知，所有膜均經歷了3個階段的熱損失。25℃至100℃為第一個熱降解階段，這個階段的質量損失主要是因為膜中的水分蒸發。100℃至250℃為第二個熱降解階段，此階段主要為增塑劑甘油的蒸發；250℃以上為第三個熱降解階段，此階段為蛋白質和FG的損失階段。

熱失重分解溫度的最高點，可以在一定程度上代表膜的耐高溫性能[34]。FG添加量為0%時，即FG-0，其熱失重分解溫度最高點為285.00℃；隨著FG添加量的增大，復合膜的最高熱失重分解溫度呈現先上升（FG-1為 310.36℃，FG-2為 312.65℃，FG-3為317.84℃）后下降（FG-4為 298.38℃，FG-5為297.87℃）的趨勢。但添加了FG的復合膜的耐高溫性能均優于單一的SPI膜。當FG添加量為4%和5%時，最高熱失重分解溫度周圍均有與之相近的峰，這可能代表的是未與SPI結合的FG的分解溫度峰。

3 結論

本文探究了不同FG添加量（0%～5%）對SPI膜的作用機理，通過對成膜液特性進行探究，發現所有成膜液均屬于假塑性流體，彈性行為大于黏性行為，說明FG與SPI具有良好的相容性，具有較為緊密的網絡結構，添加了FG的復合膜的熱穩定性能均較單一的SPI膜有了提升，最高熱失重分解溫度從FG-0的285.00℃，提升至FG-3的317.84℃。粒徑結果顯示，FG與SPI可以產生聚集體。但是當添加量為4%和5%時，未能與SPI分子發生反應的FG阻礙SPI分子之間的相互作用，導致膜的斷面重新出現紋理，最高熱失重分解溫度下降，化學反應減弱。掃描電鏡分析表明，所有膜的斷面均為緊密的狀態，當FG添加量為3%時，復合膜的斷面無明顯紋理或突起。通過紅外光譜分析，FG可以與SPI產生一定的氫鍵相互作用，從而提升膜的各種性能。本研究探究了FG對SPI成膜液以及復合膜的影響，可為今后深入研究FG對蛋白質成膜特性影響提供一定的參考。