提取方式對十字花科蔬菜中異硫氰酸酯的影響

張堯，Nyasha Makaza，呂城枝，孫娟，宋新杰，Sabir Z Nishanbaev，吳元鋒*，毛建衛

（1.浙江科技學院生物與化學工程學院，浙江 杭州 310023；2.浙江省農業生物資源生化制造協同創新中心（2011協同創新中心），浙江 杭州 310023；3.烏茲別克斯坦科學院植物化學研究所，烏茲別克斯坦 塔什干 100170）

現代流行病學研究表明，經常食用西蘭花、甘藍、花菜、羽衣甘藍、蘿卜等十字花科蔬菜可有效降低癌癥、心血管疾病、糖尿病、阿茲海默癥等疾病的發生率。這是由于這些蔬菜含有豐富的抗壞血酸、膳食纖維、黃酮、類胡蘿卜素、硫代葡萄糖苷等活性成分[1-2]。硫代葡萄糖苷是一類含硫的次生代謝產物，基于衍生氨基酸的差異可將其分為脂肪族、芳香族和吲哚族硫苷三類[3]。當十字花科蔬菜被切割或啃食時，細胞中儲存的內源性黑芥子酶將硫代葡萄糖苷水解為異硫氰酸酯（isothiocyanate，ITC）。但在 Fe2+或上皮硫特異蛋白（epithiospecifier protein，ESP）催化作用下，會轉化為腈類物質[4]（圖1）。

圖1 黑芥子酶對硫代葡萄糖苷的水解作用Fig.1 The hydrolysis effects of myrosinase on glucosinolate

研究表明，ITC具有抑制I型酶、激活II型酶、激活Keap1-Nrf2-ARE通路等多種活性，可顯著降低肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、宮頸癌等癌癥的發生率。同時其還具有抗氧化、提高免疫力、抗氧化等多種功能[1，5-6]。常見的脂肪族ITC包括蘿卜硫素（又名萊菔硫烷，sulforaphane，SF）、萊菔素（sulforaphene，SFE）、芝麻菜素（erucin，ER）、庭薺素（alyssin）、3-甲基亞磺酰丙基異硫氰酸酯（iberin）、3-（甲硫基）丙基異硫氰酸酯（iberverin）等，芳香族ITC主要有異硫氰酸苯甲酯（phenyl benzyl isothiocyanate，BITC）、異硫氰酸苯乙酯（phenyl ethyl isothiocyanate，PEITC）等[1，3，7]。在這些 ITC 中，SF 活性最強[8]，SFE、ER、PEITC 等也具有較強的活性[9-12]。

目前對ITC已有一定研究，主要集中于提取工藝的優化[13-17]。程立等[18]使用純化并固定化后的黑芥子酶生產SFE，使底物轉化率提高2.7～8.0倍。但關于提取劑添加方式的研究尚未見報道。提取ITC的傳統方法是先酶解后提?。╤ydrolysis followed by extraction，HFE），即先加入緩沖液，使硫代葡萄糖苷酶解為ITC，再用有機溶劑提取[19]。本文采用同時加入緩沖液和有機溶劑，即酶解和提取同時進行（simultaneous hydrolysis and extraction，SHE）的方式提取ITC，縮短了提取工藝。進而比較不同提取方式（SHE和HFE）對6種常見的十字花科蔬菜（蘿卜、芥菜、榨菜、甘藍、花菜和西蘭花）種子中ITC種類和含量的影響，以期從蔬菜中獲得高含量和高活性的ITC。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石油醚、乙酸乙酯、甲醇、氯化鈉、無水硫酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鉀、1，2-苯二硫醇乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）（均為分析純）：上海凌峰化學試劑有限公司；NAD（P）H:醌氧化還原酶 1[NAD（P）H:quinone oxidoreductase 1，NQO1]酶活性檢測試劑盒：美國Sigma公司；小鼠黑色素瘤細胞B16、1640培養液、胎牛血清：杭州諾揚生物有限公司；胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素溶液：上海生工生物有限公司。

1.2 儀器與設備

RE-200型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；高速冷凍離心機：美國Beckman公司；SCIENTZ-II D超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；Spectra Max酶標儀：美國Molecular Devices公司；高效液相色譜儀、7890A氣質聯用高效色譜儀：美國Agilent Technologies公司；WondaCractODS-2柱：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 ITC提取方式

根據Wu等[20]的方法，分別破碎并稱取100 g蘿卜、芥菜、榨菜、甘藍、花菜、西蘭花種子的粉末，加入700 mL石油醚，振蕩搖勻2 h，過濾除去石油醚，濾渣用相同體積的石油醚繼續脫脂2次。濾渣置于通風干燥櫥中過夜，得到脫脂種子。

先提取后酶解方式（HFE）[19]：30 g脫脂種子加入15 mL 磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH7.0），振蕩搖勻 2 h，再加入35 mL乙酸乙酯，振蕩搖勻4 h，隨后繼續加入2 g氯化鈉，充分混勻15 min后過濾，濾渣用乙酸乙酯再洗滌2次。在乙酸乙酯相中加入10.0 g無水硫酸鈉并過濾，通過旋轉蒸發（45℃）將濾液濃縮并加入5 mL甲醇用于殘留物的溶解定容，儲存于-20℃冰箱中。

同時酶解和提取方式（SHE）[19]：30 g脫脂種子同時加入15 mL磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH7.0）和35 mL乙酸乙酯，振蕩搖勻4 h，后續步驟與HFE相同。

1.3.2 ITC含量測定

根據Liu等[21]的方法，運用環縮合法測定ITC含量。將200μL樣品與300μL磷酸鉀緩沖液（50mmol/L，pH8.5）和 400 μL 1，2-苯二硫醇（10 mmol/L）混勻，于65℃孵育2 h，隨后冷卻至25℃。將反應液于12 000×g離心10 min，取上清液過0.22 μm微濾膜并檢測ITC含量。液相檢測條件為流動相：甲醇和水分別為80%和 20%；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；檢測波長：365 nm。色譜柱為 4.6 mm×250 mm，5 μm WondaCract ODS-2柱。

1.3.3 氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析

各種子中ITC種類和含量按照吳元鋒等[22]的方法測定，通過GC-MS進行檢測。色譜柱為HP-5MS的UI毛細管柱（0.25 μm，30 m×0.25 mm）。1 μL 的上樣量，300℃的氣化室溫度。柱升溫程序為50℃（2 min），升溫至190℃（10℃/min），再升溫至300℃（20℃/min），保持5 min。超高純氦氣作為載氣（分流比為10∶1）。質譜的接口溫度為220℃，電離方式為電子離子化（electronic ionization，EI），電離能量為70 eV，質量范圍為35 amu～500 amu[19]。內標物為環己酮。

1.3.4 提取液對B16細胞的抑制作用

提取液對小鼠B16細胞的抑制作用根據Chiang等[23]的方法，采用噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法檢測。取對數生長期的B16細胞，用含EDTA的胰蛋白酶溶液進行消化，制備成單細胞懸液，接種于 96 孔板中，每孔 100 μL，2×104個細胞/孔，置于37℃和5% CO2的培養箱中培養。待細胞貼壁，加入含有純SF或提取液的培養液，使純SF和HFE組提取液最終濃度為30 μmol/L，每個濃度設置5個復孔；SHE組提取液與HFE組稀釋倍數相同，僅含有培養液的作為空白組。隨后將細胞置于培養箱中，培養24 h，條件為37℃并含有5% CO2。分別加入20 μL無菌MTT溶液（5 mg/mL），反應4 h。除去培養液，分別加入150 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）。反應10 min后在570 nm條件下檢測其OD值，計算24 h后B16細胞的存活率。

1.3.5 提取液對B16細胞NQO1的影響

在24孔板中，分別加入1 mL（含有約2×105個B16細胞）細胞懸液并傳代培養至細胞穩定后加入含有純SF或提取液的培養液（濃度為5 μmol/L），培養24 h。用無菌磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）清洗去除培養液的B16細胞3次，隨后進行胰蛋白酶消化。1 000×g離心細胞懸液5 min后去除上清液，在沉淀中加入細胞裂解液、1 mol/L二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）和蛋白酶抑制劑（體積比為200∶1∶2），冰上裂解 30 min，每隔 10 min 用旋渦混勻器混勻，重復3次，再于12 000×g下離心30 min，取上清液，分裝于-80℃保存備用[19]。

根據Liu等[21]的方法對NQO1活性進行測定。工作液：25 mmol/L Tris-HCl緩沖液、0.67 mg/mL牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、0.72 mmol/L MTT、0.01%（體積分數）吐溫-20和0.03mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（oxidized form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP+）（體積比為 827∶13∶133∶7∶20）；混合液：50 μmol/L甲萘醌、2 U/mL葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和工作液（體積比為 1∶20∶1 000）；現用現配，避光。按體積比1∶4混勻樣品溶液與混合液，每隔1 min檢測OD610，檢測7 min后加入25 μL濃度為0.3 mmol/L的雙香豆素以停止反應，每隔1 min檢測610 nm處的吸光度（OD610），檢測7 min。MTT的還原量通過斜率計算。通過蛋白質檢測試劑盒測定蛋白質含量，以BSA為標準蛋白質。NQO1活性以還原MTT的量表示，單位為nmol/（min·mg）。

1.4 數據統計分析

每項試驗進行3次以上，試驗結果以平均值±標準差來表示，數據用SPSS 22.0進行單因素方差分析。統計學顯著性為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 提取方式對ITC含量的影響

通過環縮合法測定了SHE和HFE對ITC含量的影響，結果如表1所示。

表1 兩種提取方式對不同種子中ITC含量的影響Table 1 Effects of two extraction methods on ITC content in different seeds

由表1可知，采用SHE提取時，蘿卜種子的ITC含量最高，其次是西蘭花、甘藍和花菜種子，芥菜和榨菜種子的ITC含量較低。提取方式對蘿卜種子和西蘭花種子中ITC含量有顯著影響（P＜0.05），SHE組比HFE組分別提高了2.98倍和0.40倍。而對于芥菜、榨菜、甘藍和花菜種子，SHE組ITC含量略高于HFE組，但是無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 提取方式對ITC種類和含量的影響

通過GC-MS分析了不同種子提取液中ITC的種類和含量，結果如表2所示。

表2 兩種提取方式對不同種子中ITC的種類和含量Table 2 Effects of two extraction methods on the kinds and content of ITC in different seeds

續表2 兩種提取方式對不同種子中ITC的種類和含量Continue table 2 Effects of two extraction methods on the kinds and content of ITC in different seeds

在不同種子中，西蘭花種子中ITC的種類最豐富，共13種。其次為花菜、甘藍、蘿卜、芥菜和榨菜種子。作為一種抗癌活性較高的活性物，SF的含量和提取方式一直受到人們的關注。SF在西蘭花種子中的含量最高，采用SHE時可達（134±35）mg/100 g?；ú撕透仕{種子中也含有SF，但西蘭花種子中SF的含量顯著高于這些種子。從表2可看出，alyssin和raphasatin分別只存在于西蘭花和蘿卜種子中。ER、iberverin和iberin在甘藍、花菜和西蘭花種子中均存在，但這3種ITC在不同蔬菜種子中含量有差異。甘藍和花菜種子中iberverin和iberin的含量均高于西蘭花，其中采用SHE時，甘藍和花菜種子中iberverin的含量分別是西蘭花種子的1.47倍和1.76倍。除蘿卜種子外，PEITC存在于其他各種所測蔬菜種子中，但是含量均不高。

與HFE相比，SHE使蘿卜種子中SFE含量提高了3.26倍并使西蘭花種子中ER含量增加了1.63倍。采用SHE時，蘿卜種子中的ER、raphasatin、B，4-I-1和SFE，以及芥菜、甘藍、花菜和西蘭花種子中的iberverin含量有顯著提高（P＜0.05）。但SHE對BUITC、BT、3-MI、iberin nitrile、PEITC、alyssin 和 ERN 的影響較小。在西蘭花種子中，ER可以在雙氧水作用下轉化為其結構類似物SF[24]，SF也可以被腸道微生物或酶類代謝為ER[25-26]。但有機溶劑對黑介子酶的影響尚未研究，也沒有關于SF被有機溶劑催化為ER的報道。試驗表明西蘭花中SF含量不受SHE和HFE影響。因此，采用SHE可以提高ER含量的原因還需進一步探究。除ITC外，研究分析了各種腈類物質，如iberin nitrile、iberverin nitrile、ERN、SFN 等，但含量均較低。與ITC不同，腈類物質沒有生物學活性[27]。腈類物質含量不受SHE和HFE影響（P＞0.05），這說明ESP活性不受有機溶劑影響。

2.3 不同種子提取液對B16細胞活性的影響

蘿卜、甘藍、花菜和西蘭花種子提取液對B16細胞活性的影響如圖2所示，通過SHE和HFE獲得的種子提取液稀釋至其ITC濃度等于SF標準品濃度。由于芥菜和榨菜種子提取液中ITC含量較低，未進行分析比較。

圖2 不同提取方式和種子提取液對B16細胞存活率的影響Fig.2 Effects of different extraction methods and seed extracts on the survival rate of B16 cells

由圖2可以看出，SHE組種子提取液細胞抑制率均顯著高于HFE組（P＜0.05），特別是蘿卜種子，這與表1中SHE組ITC含量較高的結果一致。作為陽性對照，30 μmol/L的SF標準品可以使B16細胞的存活率降低至67%，說明SF對B16細胞有很強的抑制作用，與文獻[28]研究結果一致。采用HFE獲得的蘿卜種子提取液對B16細胞的抑制作用不同于陽性對照（P＜0.05），而其他種子提取液對B16細胞的影響與陽性對照相似（P＞0.05）。

2.4 不同種子提取液對B16細胞NQO1活性影響

NQO1是一種黃素蛋白酶，它以NADP（H）為受體，催化醌類及其衍生物失去兩個電子，從而保護細胞免受醌類物質代謝過程中產生的活性氧及親電物質的損傷[29]。因此，檢測NQO1活性，是評價提取液抗氧化活性的重要手段，。不同提取方式和種子提取液對B16細胞NQO1活性的影響見圖3。

圖3 不同提取方式和種子提取液對B16細胞NQO1活性的影響Fig.3 Effects of different extraction methods and seed extracts on the NQO1 activity of B16 cells

由圖3可知，各種子提取液對B16細胞的NQO1活性有不同的影響。HFE組的西蘭花種子提取液對NQO1誘導活性與純SF無顯著差異（P＞0.05），而SHE組則顯著高于SF（P＜0.05），這是由于SHE組產生了更多的ER，從而提高了總ITC的含量。兩組花菜種子提取液對NQO1的誘導活性均高于純SF，而甘藍種子提取液誘導活性則低于純SF。SHE組甘藍種子提取液對NQO1活性誘導作用高于HFE組提取液，但是無顯著差異（P＞0.05）。HFE組蘿卜種子提取液誘導作用低于純SF，但是無顯著差異（P＞0.05），但是SHE組蘿卜種子提取液的誘導作用則顯著低于HFE組（P＜0.05），這有可能是因為SHE組中ITC的含量過高導致細胞大量死亡，從而導致酶活性反而下降。

3 結論

不同提取方式對十字花科蔬菜中ITC種類和含量有不同的影響。SHE提取的ITC含量要高于HFE，特別是蘿卜和西蘭花種子，分別提高了2.98倍和0.40倍。與HFE相比，SHE使蘿卜種子中SFE含量提高了3.26倍并使西蘭花種子中ER含量增加了1.63倍。對于蘿卜、甘藍、花菜和西蘭花種子，SHE提取液對B16細胞的抑制率高于HFE提取液。SHE組西蘭花種子提取液的NQO1誘導活性高于HFE組，但蘿卜種子的誘導活性卻相反。

本研究為從蔬菜中獲得高含量和高活性的ITC奠定基礎，也為蔬菜中天然活性成分的分析提供依據。