植物乳桿菌P9對頭孢曲松鈉作用小鼠腸道菌群的影響

陳苗苗，李可文，熊雪梅，吳夢琦，劉小溪，鄭秋生*

（1.石河子大學藥學院，新疆 石河子 832000；2.東北農業大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150030；3.北京聯合大學生物化學工程學院，北京 100023）

腸道菌群是寄居在人或動物腸道內的正常微生物，這些微生物種類繁多且數量龐大，不同菌種之間相互制約又相互依存，形成了一種動態平衡。隨著人類微生物組項目以及腸道宏基因組學的發展，腸道菌群被認為是一種新的多細胞“器官”，是維持宿主各種生命活動平衡的重要因素[1]，具有參與營養和代謝、抗菌保護、維持腸道黏膜的完整性、調節免疫反應等功能[2]。腸道菌群可以激活腸道免疫系統，在腸道屏障功能中發揮重要作用，同時還可以利用多種天然多糖，將其轉化為有益的代謝物，維持腸道微生態系統的平衡[3]。然而，當宿主或外界環境發生變化，尤其是濫用抗生素時，會導致腸道菌群失調[4]，使腸道內益生菌的豐度降低，干擾有益代謝物的轉化。研究發現，腸道菌群失調與消化系統、代謝系統、中樞神經系統、內分泌系統等一系列疾病有著密切的相關性[5]，因此對腸道菌群失調的調節可能降低這些系統疾病的發生率，對維持機體健康有著重要意義。

益生菌是一種食用后對宿主健康有益的活性微生物，能夠通過改變微生物群的組成或活性的方式產生促進健康作用[6]。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，L.plantarum）是廣泛分布于各種生態環境中的一種益生菌，它具有高度的耐酸性，在發酵后期占據主要地位，被廣泛應用于食品和健康行業[7]。研究發現L.plantarum的基因組可以根據生態位的需要，獲取、組裝、替換或刪除利用碳水化合物的基因盒，因此又被稱為“天然代謝工程師”[8]，具有預防和治療炎癥性腸病、冠心病、腸易激綜合征，以及調節糞便菌群組成等功能[9-10]。植物乳桿菌P9是由Li等[11]從自然發酵酸粥中分離出來的一株菌株，研究顯示它具有降解有機磷農藥的作用，而且其在胃腸液和膽汁中有很強的耐受性，因此可能對腸道菌群具有調節作用。

抗生素是一類由生物、微生物在生命活動過程中產生的具有抗病原體、干擾細胞生長發育的化學物質，但在使用過程中容易產生抗生素濫用，從而導致菌群失調、二重感染、超級細菌產生等危害機體健康的情況。在腸道中，抗生素通過改變細菌代謝產物和腸道微環境，從而影響腸道固有免疫功能，降低宿主腸道菌群的定植能力[12]，導致腸道菌群失調。目前選用頭孢曲松鈉建立菌群失調模型的方法被大多數研究所采用[3]，本研究主要通過灌胃頭孢曲松鈉的方式建立小鼠腸道菌群失調模型，探究L.plantarum P9對小鼠腸道菌群的影響，為益生菌制劑的研制與開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

60只健康雄性balb/c小鼠（4周齡，體重18g～20g）：北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號為SYXK（京）2017-0038。所有動物飼養于北京聯合大學應用文理學院SPF級動物實驗中心，給予每天12 h光照/黑暗交替條件，室內溫度為（20±2）℃，相對濕度為45%～60%。本次動物研究實驗設計及實驗方案通過了北京聯合大學倫理委員會審核和批準，倫理委員會意見書編號：20210601。

1.1.2 試劑

植物乳桿菌P9菌粉（活菌數≥2.0×1011CFU/g）：北京鴻測科技開發股份有限公司；頭孢曲松鈉（純度≥98%）：上海阿拉丁公司；白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）試劑盒、白介素-2（interleukin-2，IL-2）試劑盒、白介素-6（interleukin-6，IL-6）試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒：武漢華美公司；總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒：南京建成生物工程研究所；伊紅美藍瓊脂培養基、疊氮鈉-結晶紫-七葉苷瓊脂培養基、雙歧桿菌選擇性瓊脂培養基、乳酸桿菌選擇性瓊脂培養基：北京陸橋生物技術有限責任公司；膠回收試劑盒（qiagen aquick gel extraction kit）：德國凱杰生物技術有限公司；DNA純化試劑盒（gene JETTM gel extraction kit）：日本賽默飛世爾科技公司；DNA 建庫試劑盒（TruSeq DNA PCR-Free）：美國因美納公司；無水乙醇、二甲苯、中性樹膠：國藥集團化學試劑有限公司；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色液套裝：武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 儀器設備

TECAN酶標儀（Inifinite M NANO）：廣州深華公司；低溫超速離心機（Centrifuge 5702 RH）：德國艾本德有限公司；實驗室超純水機（Mili-Q EQ 7000）：美國密理博公司；紫外可見分光光度計（UV-4802）：尤尼柯儀器有限公司；電子分析天平（CPA225D）：德國賽多利斯公司；漩渦振蕩儀（Hula Dancer basic）：德國艾卡公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及給藥

60只小鼠在SPF級動物實驗室適應性喂養一周，溫度為18℃～22℃，濕度為45%～60%，自由飲食和飲水。1周后，隨機取48只小鼠，每只小鼠灌胃0.2 mL頭孢曲松鈉（200 mg/mL），1次/d，連續 5 d，建立小鼠腸道菌群失調模型。然后將這48只小鼠隨機分為4組，每組12只，分別為模型組和低、中、高3個劑量組，L.plantarum P9配方推薦劑量為2×109CFU/60 kg，本實驗采用等效換算的方法，分別以人體推薦劑量的5倍、10倍、30倍為3個劑量組，即低劑量組（L.plantarum P9 1×108CFU/kg）、中劑量組（L.plantarum P9 2×108CFU/kg）、高劑量組（L.plantarum P9 6×108CFU/kg）灌胃給藥，對照組和模型組灌胃生理鹽水，連續23 d。每天同一時間測小鼠體重，并記錄小鼠的狀態、攝食情況等。

1.3.2 樣品采集

L.plantarum P9灌胃23 d后，采集小鼠無菌糞便用于活菌計數和16S rDNA測序。小鼠摘眼球取血，置于1.5 mL離心管中，4℃靜置15 min，4 000 r/min離心15 min，吸取上清液，分裝后于-80℃儲存備用。將小鼠麻醉后斷頸處死，解剖出心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺用離心管分裝好，置于冰中備用。小腸用生理鹽水沖洗，進行稱重并測量小腸長度，將空腸放入組織固定液中，按順序編號，留作病理切片。

1.3.3 臟器系數測定

將解剖出的各組小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺分別進行稱重，按以下公式計算臟器系數。

臟器系數/%=小鼠臟器質量（g）/小鼠體質量（g）×100

1.3.4 血清炎癥因子測定

采用酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）分別測定小鼠血清中白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素 2（IL-2）、白細胞介素 6（IL-6）等炎癥因子的含量，以及腫瘤壞死因子（TNF-α）的水平，操作步驟依據相應試劑盒說明書進行。

1.3.5 肝臟及腸道抗氧化指標測定

取每只小鼠相同位置的肝臟和小腸組織，以1∶9的質量比加入生理鹽水，冰浴下勻漿，再于4℃、4000r/min離心15min后取上清液，分裝后放置于-80℃凍存，用于抗氧化指標測定?？寡趸笜税═-SOD、MDA、GSH以及GSH-Px。測定方法按照相應的試劑盒說明書進行。

1.3.6 小腸病理切片形態學觀察

將選取的空腸組織用石蠟包埋，用切片機切片。石蠟切片依次用二甲苯、無水乙醇、85%和75%酒精脫蠟至水。先后用蘇木素和伊紅染色，再將切片脫水處理，用中性樹膠封片。于顯微鏡下觀察，進行圖像采集分析。結果圖像中細胞核呈現藍色，細胞質呈現紅色。

1.3.7 腸道典型微生物含量測定

用抗生素造成小鼠腸道菌群失調模型，分別采集小鼠給予受試物（L.plantarum P9菌粉）前以及最后一次給予受試物后的無菌新鮮糞便，對糞便中的腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌、乳桿菌和產氣莢膜梭菌進行計數。糞便樣品用稀釋液稀釋至合適濃度，分別接種于相應選擇培養基中，于（36±1）℃下培養。腸球菌在疊氮鈉-結晶紫-七葉苷瓊脂培養基中培養48 h，腸桿菌在伊紅美藍瓊脂培養基中培養24 h，雙歧桿菌在雙歧桿菌選擇性培養基中厭氧培養48 h，乳桿菌用乳桿菌選擇性培養基培養48 h，產氣莢膜梭菌用產氣莢膜梭菌選擇性培養基厭氧培養24 h。計算出每克糞便中的菌落數（cfu/g)，再取對數進行計算。

1.3.8 腸道菌群結構16s rDNA高通量測序

灌胃結束后，收集各組小鼠的無菌新鮮糞便，采用十六烷基三甲基溴化銨/十二烷基磺酸鈉（cetyltrimethylammonium bromide/sodium dodecyl sulfate，CTAB/SDS）法提取樣本中微生物DNA，檢測濃度及純度后，用無菌水將DNA稀釋成1 ng/μL，使用特異性引物 515F（5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'）和806R（3'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-5'） 對細菌16S rRNA的V3～V4區進行PCR擴增，產物用2%瓊脂凝膠進行電泳檢測，再用Qiagen試劑盒純化。使用TruSeq ?DNApcr無樣品制備試劑盒生成測序文庫，用Qubit@2.0熒光計和安捷倫生物分析儀2100系統評估文庫質量，在Illumina NovaSeq平臺上對文庫進行雙末端測序。測序原始數據經拼接、過濾后得到有效數據，在有效數據的基礎上進行OTUs（operational taxonomic units）聚類和物種注釋及豐度分析，再經T檢驗得到樣本間群落結構差異特征。

1.4 數據分析處理

測量所得的各種數據采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。小鼠細胞炎癥因子、抗氧化指標、臟器系數均采用平均值±標準差的形式表示，除腸道菌群計數采用獨立樣本T檢驗分析組間差異，其余數據均采用單因素方差分析LSD法分析組間差異，當P＜0.05時則認為數據有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌P9對小鼠體質量和攝食量的影響

各組小鼠的體質量和攝食量隨時間的變化如圖1所示。

圖1 植物乳桿菌P9對小鼠體質重及攝食量的影響（n=12）Fig.1 Effect of L.plantarum P9 on body weight and food intake level of mice（n=12）

由圖1可知，體質量曲線和攝食量曲線都呈緩慢上升的趨勢，但各組之間差別不明顯。一方面，由于小鼠處于身體發育階段，隨著周齡的增長，體質量和攝食量都有所增長；另一方面，說明本實驗所灌胃的頭孢曲松鈉和L.plantarum P9菌粉對小鼠的體質量和攝食量無明顯影響。

2.2 植物乳桿菌P9對小鼠臟器系數的影響

臟器系數是反映藥物對動物機體各器官作用的參數，其變化可提示臟器的形態病理學改變，臟器系數降低提示可能有萎縮或退行性病變，臟器系數升高則可能有水腫、增生或充血[13]。本次實驗中，各組小鼠的臟器系數如表1所示。

表1 植物乳桿菌P9對小鼠各臟器系數的影響（n=12）Table 1 Effect of L.plantarum P9 on organ coefficient in mice（n=12）%

由表1可知，無論是模型組與對照組，還是低劑量組、中劑量組、高劑量組與模型組相比較，小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺的臟器系數均無明顯差異，說明頭孢曲松鈉和L.plantarum P9灌胃對小鼠的臟器無明顯影響。吳思謀等[14]的研究中通過高脂飲食和灌胃頭孢曲松的方式能檢測到小鼠臟器系數的明顯差異，而本實驗中臟器系數無顯著差異，說明小鼠臟器系數可能與飲食因素、抗生素灌胃劑量和灌胃持續時間有關系。

2.3 植物乳桿菌P9對小腸長度和質量的影響

各組小鼠小腸的長度和質量如圖2所示。

圖2 植物乳桿菌P9對小鼠小腸長度和質量的影響（n=12）Fig.2 Effect of L.plantarum P9 on length and weight of intestine in mice（n=12）

由圖2可知，小腸長度無顯著差異，3個劑量組和模型組的小腸質量比對照組稍有提高，但無顯著差異（P＞0.05），說明頭孢曲松鈉和L.plantarum P9未對小鼠的小腸造成器質性改變。

2.4 植物乳桿菌P9對小鼠血清中炎癥因子的影響

炎癥是機體受到外界刺激時的一種防御反應[15]，IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α 是機體常見的炎癥因子。IL-1β由活化巨噬細胞產生；IL-2由T輔助細胞產生，又稱T細胞生長因子；IL-6是由多種淋巴細胞或非淋巴細胞產生；TNF-α是由單核-巨噬細胞產生，這4種均為促炎細胞因子[16]，其水平的高低對反應機體的炎癥有重要價值。腸道菌群的失調則通常會促進全身炎癥反應，導致多種疾病發生[17]，所以本次實驗中測定了各組小鼠這4種炎癥因子含量變化，結果見表2。

表2 小鼠血清中炎癥因子水平Table 2 The level of inflammatory factor in mice serum

由表2可知，與對照組相比，模型組的IL-1β、IL-2、IL-6及 TNF-α 含量極顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，低、中、高 3 個劑量組的 IL-2、IL-6、TNF-α 含量極顯著降低（P＜0.01），中劑量組和高劑量組的IL-1β含量極顯著降低（P＜0.01），說明灌胃頭孢曲松鈉導致小鼠機體產生明顯的炎癥反應，而L.plantarum P9可以減輕小鼠由頭孢曲松鈉造成的炎癥反應，中劑量組和高劑量組效果更為明顯。

2.5 植物乳桿菌P9對小鼠肝臟及小腸抗氧化指標的影響

機體的抗氧化系統是一個復雜而完善的整體[18]，當小鼠腸道菌群失調時，會破壞這個整體的平衡性。SOD是一種廣泛存在于生物機體的抗氧化金屬酶，能夠催化超氧陰離子歧化生成過氧化氫和氧，其活力值越高代表抗氧化的能力越強[19]。MDA是氧自由基攻擊生物膜后形成的脂質氧化代謝物，其含量反映了體內脂質的過氧化程度[20]，含量越高提示機體的抗氧化能力越弱。GSH是體內重要的還原劑，參與多種生物氧化過程，對蛋白質合成、DNA修復、細胞膜轉運以及細胞增殖、分化、凋亡等多種生物過程具有重要意義[21]，低水平的GSH還會導致氧化應激，進而影響免疫系統的功能。GSH-Px是一種過氧化物分解酶，其作用是消除機體產生的過氧化氫和有機氫過氧化物，降低活性氧對機體的破壞[22]，此外它還參與細胞信號轉導、前列腺素合成的調節、蛋白質相互作用等過程。本實驗中測定的各組小鼠肝臟和腸道組織MDA、GSH含量和T-SOD、GSH-Px活性如表3。

表3 植物乳桿菌P9對小鼠肝臟和小腸抗氧化指標的影響Table 3 Effect of L.plantarum P9 on antioxidant index in mice's liver and intestine

由表3可知，與對照組相比，模型組小鼠肝臟GSH 含量顯著降低（P＜0.05），而 T-SOD、GSH-Px活性極顯著下降（P＜0.01），MDA含量極顯著上升（P＜0.01）。隨著L.plantarum P9灌胃劑量的增加，小鼠肝臟中各抗氧化物質水平有所恢復，與模型組相比，高劑量組的GSH含量和T-SOD、GSH-Px活性極極顯著上升（P＜0.01），MDA含量極顯著下降（P＜0.01）。模型組腸道GSH含量和GSH-Px活性相對于對照組極顯著降低（P＜0.01），MDA 含量顯著上升（P＜0.05），T-SOD 活性顯著下降（P＜0.05）。與模型組相比，中劑量組和高劑量組小鼠腸道MDA含量顯著下降（P＜0.05），高劑量組GSH-Px活性極顯著升高（P＜0.01），T-SOD活性顯著升高（P＜0.05），GSH 含量極顯著升高（P＜0.01）。由此可見，灌胃頭孢曲松鈉后小鼠肝臟和小腸的抗氧化能力呈現不同程度的下降趨勢，而L.plantarum P9能使抗氧化指標恢復至對照組水平，說明L.plantarum P9對頭孢曲松鈉小鼠的肝臟和小腸的氧化應激水平有著調控作用。

2.6 植物乳桿菌P9對小鼠小腸形態的影響

各組小鼠的小腸空腸段病理切片經HE染色后，結果如圖3所示。

圖3 小鼠小腸切片形態觀察（200×）Fig.3 Morphological observation of intestine section of mice（200×）

由圖3可知，各組小鼠小腸的絨毛結構完整、邊緣整齊、數量豐富，絨毛長度和隱窩厚度都沒有明顯差異，未見絨毛腫脹或絨毛脫落。黏膜上皮內有排列整齊的單層柱狀細胞，固有層腸腺數量豐富，中央乳糜管結構清晰可見，肌纖維形態正常、排列規則，未見明顯炎癥。說明抗生素和L.plantarum P9均未對小鼠小腸形態造成明顯改變。

2.7 植物乳桿菌P9對小鼠典型腸道微生物含量的影響

腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌和產氣莢膜梭菌都是人類和動物腸道的正常菌群，其數量一般處于相對穩定狀態。本實驗探究了L.plantarum P9對頭孢曲松鈉小鼠腸道中這5中常見菌群的具體影響，結果見圖4。

圖4 植物乳桿菌P9對小鼠腸道菌群計數的影響Fig.4 Effect of L.plantarum P9 on intestinal flora count in mice

如圖4所示，在給予抗生素后，小鼠糞便中的腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌、乳桿菌數量比對照組極顯著減少（P＜0.001），產氣莢膜菌含量無明顯變化?？股卦鞊p停止后，模型組各類微生物含量有所恢復，其中腸桿菌含量與同期對照組相比極顯著升高（P＜0.001），乳桿菌含量有所下降，腸球菌和雙歧桿菌無明顯差異。各劑量組與灌胃L.plantarum P9之前比，腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌、乳桿菌含量均有所恢復，與同時期模型組相比，腸球菌、腸桿菌含量有所降低，中高劑量組雙歧桿菌、乳桿菌含量明顯升高。

在給予L.plantarum P9前，模型組和低、中、高劑量組的上述種類微生物，除產氣莢膜菌外，都明顯下降，模型成立。產氣莢膜菌是一種廣泛分布于環境、動物及人體胃腸道的厭氧致病菌，其芽孢具有極強的抗逆性，不易殺死[23]，本研究顯示，抗生素和益生菌均無法影響產氣莢膜菌在腸道的數量。雙歧桿菌和乳桿菌都是腸道中的有益細菌，此實驗中抗生素能使它們的數量下降，而L.plantarumP9能使它們含量有所上升。模型組與對照組相比腸球菌、腸桿菌含量上升，而在3個劑量組中它們的含量均減少，這2種細菌都具有抗生素耐藥性，其中腸球菌對多種抗生素表現為固有耐藥機制，而且具有獲得新抗菌耐藥機制的能力[24]；腸桿菌對頭孢菌素類、頭霉素類、加酶抑制劑類抗生素表現為耐藥[25]，說明抗生素造?？赡芴岣吡四退幖毦暮?，而L.plantarum P9可使耐藥菌含量降低。

2.8 干預對小鼠腸道微生物多樣性的影響

利用16s rDNA高通量測序可以從整體水平檢測出腸道菌群的變化。

2.8.1 基于OTUs聚類的Venn分析

實驗采集了5組小鼠共30個樣本進行16S rDNA高通量測序。經過對短讀序列拼接，平均每個樣品測得85 151條標簽，質控有效數據量為64 800。以97%的一致性將序列聚類成OTUs，共得到3 394個OTUs。將所有樣本均一化處理后繪制Venn圖，當樣本組數大于5時則展示為花瓣圖，見圖5。

圖5 基于OTUs聚類的Venn圖Fig.5 The Venn diagram based on OTUs cluster analysis

如圖5所示，對照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組OTUs數目分別為1 730、2 332、1 529、858、1 442，模型組與其他各組相比OTUs數量有所增加，但與對照組相比模型組特有的OTUs數目為859，3個劑量組特有的 OTUs數目為 680、373、599。

2.8.2 Alpha物種多樣性分析

Alpha物種多樣性結果見圖6。

圖6 Alpha物種多樣性分析Fig.6 Alpha species diversity analysis

由物種累積箱形圖可見（圖6A）隨著樣本量的增加，可觀察到的物種數目增加，即物種多樣性增加，且圖形位置趨于平緩，表明環境中的物種不會隨樣本量增加而急劇增加，樣本量充分，可以進行數據分析。物種多樣性曲線（圖6B）反映了各組樣本中的物種數量，可見頭孢曲松鈉誘導小鼠腸道菌群失調時，物種數目顯著增加，而L.plantarum P9灌胃可以降低小鼠腸道物種數量。通過Wilcoxon秩和檢驗（圖6C）可以發現，測得的物種數在模型組與高劑量組、中劑量組、低劑量組間均具有顯著性差異（P＜0.05），而在對照組與模型組、中劑量組、高劑量組間均無顯著性差異（P＞0.05）。Shannon指數反映了不同組間樣本均一性的差別，當同一組中各樣本OTUs序列數均一性越大時，Shannon指數越大，由圖6D可見與模型組相比低劑量組、中劑量組、高劑量組的Shannon指數都具有顯著性差異（P＜0.05），與對照組相比模型組和低劑量組無顯著差異（P＞0.05），而對照組與中劑量組、對照組與高劑量組組間有顯著性差異（P＜0.05），低劑量組、中劑量組、高劑量組3組互相無顯著差異，說明L.plantarum P9使樣本均一性發生了改變。

2.8.3 多樣品比較分析

多樣品比較分析（beta diversity）是對不同樣品中的微生物群落進行比較分析，采用Qiime軟件計算unifrac距離，進行降維分析，主坐標分析法（principal co-ordinates analysis，PCoA）提取主要元素和結構，選取貢獻率最大的組合作圖，結果如圖7所示。

圖7 基于weighted unifrac距離的PCoA分析圖Fig.7 PCoA analysis chart based on weighted unifrac distance

加權unifrac方法（weighted unifrac）能從樣本中的物種有無和物種豐度兩方面反映群落結構關系，群落中組成結構相似度高的更傾向于聚集在一起，而組成差異大的樣本會分散排列?？梢姶藢嶒炛心Ｐ徒M樣本比較集中，相似度較高。而對照組和低、中、高劑量組樣本分散度較大，除模型組外的其他4個置信圈重疊部分較多，說明組間差異不顯著。此項分析表明灌胃頭孢曲松鈉后小鼠腸道菌群結構發生了改變，而L.plantarum P9能使小鼠腸道菌群結構有所恢復。

2.8.4 物種相對豐度分析

物種相對豐度分析結果見圖8。

圖8 門水平物種豐度柱形圖和屬水平物種豐度柱形圖Fig.8 Column diagram of species abundance at phylum level and at genus level

在物種組成方面，在門水平選取豐度排名前10（top 10）的物種繪制柱形圖（圖8A），對照組的主要菌有擬桿菌門（Bacteroidota）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobiota），在 top 10中占比91.3%，其中擬桿菌門占49.41%，厚壁菌門占35.3%，疣微菌門占6.59%。在屬水平選取豐度排名前10的屬繪制柱形圖（圖8B），各組的優勢菌屬有阿克曼氏菌屬（Akkermansia）、杜氏桿菌屬（Dubosiella）、毛螺旋菌屬（Lachnospiraceae_NK4A136_group）。Top 10的菌屬在模型組的總豐度相對較低，在低、中、高劑量組相對較高。模型組Akkermansia豐度有所降低，擬普雷沃氏菌屬（Alloprevotella）豐度有所升高，而在給予L.plantarum P9后，Akkermansia豐度升高，Alloprevotella豐度降低。除此之外，低、中、高劑量組的普雷沃菌屬（Prevotellaceae_UCG-001）、別樣桿菌屬（Alistipes）相對于對照組和模型組明顯升高，高劑量組Dubosiella相對于其他組明顯升高。此部分結果概括說明了L.plantarum P9能改善小鼠腸道因灌胃頭孢曲松鈉造成的菌群變化。

2.8.5 物種顯著性差異分析

利用T檢驗對各組間的差異物種進行分析，繪制heatmap圖，見圖9。

圖9 組間差異物種分析heatmap圖Fig.9 The heatmap diagram of species differences between groups

從屬水平看，與對照組相比，模型組擬普雷沃氏菌屬（Alloprevotella）豐度極顯著增多（P＜0.01），厭氧支原體屬（Anaeroplasma）、腸單胞菌屬（Intestinimonas）、庫特氏菌屬（Kurthia）豐度顯著增多（P＜0.05），氣味桿菌屬（Odoribacter）豐度極顯著減少（P＜0.01）。Alloprevotella是從人類口腔分離出來的新型菌，臨床研究顯示，Alloprevotella感染與下頜骨骨髓炎和口腔鱗狀癌有密切聯系[26]。Anaeroplasma是柔膜體綱8個屬之一，是引起人和動物呼吸系統、泌尿系統、生殖系統炎癥的主要致病菌[27]。Intestinimonas是小鼠腸道的一種能產生丁酸鹽的細菌，對抗生素有一定耐藥性[28]。Kurthia為一種食品致腐階段性參與菌，具有抗逆性和多重降解功能，研究顯示它能夠降解農田中殘留的抗生素[29]。上述結果表明抗生素造損后上述致病菌及具有抗生素抗性的微生物豐度有所增加。

灌胃L.plantarum P9后，與模型組相比，低、中、高劑量組的腸球菌屬（Enterococcus）豐度顯著減少（P＜0.05），腸桿菌屬（Enterobacter）、魏斯氏菌屬（Weissella）、乳球菌屬（Lactococcus）豐度極顯著減少（P＜0.01），而 Prevotellaceae_UCG-001、理研菌屬（Alistipes）、擬桿菌屬（Bacteroides）豐度有所增加。低劑量組杜氏桿菌（Dubosiella）豐度極顯著升高（P＜0.01），顫螺旋菌屬（Oscillibacter）、Colidextribacter、惰性真桿菌（[Eubacterium]_siraeum_group）豐度極顯著升高（P＜0.01）；中劑量組 Colidextribacter豐度顯著減少（P＜0.05），阿克曼菌（Akkermansia）豐度顯著上升（P＜0.01）；高劑量組卡斯特蘭尼氏菌屬（Castellaniella）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）豐度顯著升高（P＜0.05），Intestinimonas豐度顯著降低（P＜0.05）。腸球菌、腸桿菌和雙歧桿菌的結果與2.7部分相吻合。魏斯氏菌、乳球菌、杜氏桿菌都屬于乳酸菌，目前關于魏斯氏菌抗生素耐藥性暫無報道，但研究顯示乳球菌對大多數常用抗生素具有不同程度耐藥性[30]，阿克曼菌是一種黏蛋白分解細菌，研究顯示其與肥胖、代謝性疾病、炎癥呈負相關，不僅可以保護小腸上皮細胞完整性，還可以通過調節T細胞發揮抗炎作用[31]。說明灌胃L.plantarum P9后，與模型組相比具有抗生素抗性的細菌豐度減少，同時腸道內一些有益細菌豐度有所增加。

綜上所述，灌胃抗生素使小鼠腸道對抗生素有耐藥性和降解功能的細菌增加，使得它們的OTUs數目高于對照組和3個劑量組，而灌胃L.plantarum P9后能夠降低這些細菌的數目，使其恢復至對照組水平，其中高劑量組的效果更加明顯。

3 結論

本文探究了植物乳桿菌P9對頭孢曲松鈉誘導的腸道菌群失調小鼠的作用，結果顯示植物乳桿菌P9能夠降低小鼠因腸道菌群失調導致的全身炎癥反應，提高肝臟和小腸的氧化應激水平。灌胃抗生素頭孢曲松鈉導致小鼠腸道對抗生素耐藥的細菌豐度增加，而植物乳桿菌P9可以降低耐藥細菌的豐度，植物乳桿菌P9具有調節腸道菌群的作用。