絲素-殼聚糖支架對骨髓間充質干細胞黏附、增殖和成骨分化的影響

丘雨蓓, 李德雄， 陳江

口腔臨床中常面臨各種原因造成的顱頜面骨組織缺損或骨量不足。隨著生物材料研究的進展，越來越多的研究將注意力集中在人工合成的骨修復材料上[1]。近年來，天然高分子材料因其來源廣、加工性能好、組織相容性佳等優點備受研究者的關注。殼聚糖(chitosan, CS)是目前發現的唯一與細胞外基質糖胺聚糖化學結構相似的多聚糖，具有良好的親水性和抗菌性[2]。但CS降解速度過快，機械強度低，一般不單獨用于制作三維支架，而常與其他材料混合使用。絲素蛋白(silk fibroin, SF)是一種天然纖維蛋白，具有良好的力學性能，含有α-螺旋、無規則卷曲和β-折疊三種結構，與骨組織中的膠原蛋白結構相似但卻無明顯的抗原性[3]。當SF的α-螺旋和無規則卷曲轉變成穩定的β-折疊結構時，能明顯降低其水溶性。研究發現，CS溶液和SF溶液混合后會促進β-折疊形成，降低材料的降解速率，提高機械性能，并能保留兩種材料的優點[4]。本研究擬采用SF和CS為原材料制備三維多孔支架，檢測骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)在該材料上的黏附、增殖及成骨分化，探討其作為骨修復材料的可能。

1 材料與方法

1.1 SF-CS支架制備 將2 g CS粉(美國Sigma公司)溶解于100 mL 0.2 mmol/L乙酸溶液，磁力攪拌至CS完全溶解。將2 g的SF粉(實驗組前期制備)溶解于100 mL去離子水中。將制備好的SF溶液和CS溶液按體積比3∶1比例混合，攪拌均勻后倒入24孔板中并置于-20 ℃冰箱冷凍。24 h后放入預冷好的真空冷凍干燥機(FD-1E-50，北京博醫康實驗儀器有限公司)中干燥(-54 ℃，80 Pa)后用無水乙醇室溫交聯6 h。去離子水完全置換無水乙醇后再次冷凍干燥24 h，最終得到SF-CS支架。

1.2 SF-CS支架物理性能表征

1.2.1 支架表面形貌和孔徑檢測 將SF-CS支架用導電膠固定于檢測圓臺上，表面噴金處理，室溫下掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy，SEM，QUANTA450，美國FEI公司)觀察其表面形貌特征，并隨機測量3個樣本共75個孔徑，計算孔徑平均值。

1.2.2 支架孔隙率和吸水率檢測 采用無水乙醇檢測支架的孔隙率。在量筒中裝入10 mL無水乙醇(V1)，將底面積為2 cm2、高為1 cm的SF/CS復合材料放入量筒中，待充分浸泡后，記錄此時的乙醇體積為V2；取出材料后，剩余的乙醇體積記錄為V3，計算材料的孔隙率(共檢測10個樣品)：

孔隙率(%)=[(V1-V3)/(V2-V3)]×100%

采用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)檢測材料的吸水率。將材料浸入PBS溶液中，待完全溶脹后取出，去除表面水分，稱質量，記錄濕態支架的質量為W1，后將材料置于65 ℃烘箱中完全烘干，稱質量，記錄干態支架的質量W2，計算支架的吸水率：

吸水率(%)=[(W1-W2)/W2]×100%

1.2.3 支架力學性能測量 制備高1.0 cm、直徑1.5 cm樣品，室溫下采用萬能材料試驗機(中國島津公司)檢測SF-CS支架濕態下(PBS為浸泡液體)的壓縮強度，載荷0.1 kN，加載速度為 1 mm/min，壓縮量為80%，每組測量10個樣本，計算平均值。

1.3 細胞接種 將SF-CS支架切成厚度為1 mm的圓片，環氧乙烷滅菌后放入24孔板中。每孔加入1 mL完全培養基(L-DMEM培養基+10% FBS+1%青/鏈霉素)浸潤2 h后，每個樣本接種5×104個BMSCs。對照組將相同數量的BMSCs直接接種于24孔板中。將孔板放置于37 ℃、體積分數為0.05的 CO2培養箱中，每3 d更換1次培養基。所有細胞實驗均重復3次，每組3個樣本。

1.4 細胞黏附 細胞培養1 d后，光鏡下觀察對照組細胞的黏附形態，SEM觀察實驗組細胞的形態。去除培養基，PBS輕輕沖洗，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS清洗3次，梯度乙醇脫水(30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%)，每次10 min；CO2臨界點干燥，樣本表面噴金，采用SEM觀察細胞在材料上的黏附情況。

1.5 細胞增殖 細胞培養1、3、7 d后采用CCK-8法檢測細胞增殖。去除原培養基，每孔加入50 μL CCK-8和 500 μL完全培養基，37 ℃孵育 2 h后，每孔吸出100 μL加入新的96孔板種，酶標儀(美國Bio-Rad公司)測量450 nm波長處吸光度值OD。

1.6 細胞成骨分化相關基因表達檢測 細胞接種方式同1.3。細胞培養24 h后去除原培養液，更換成含成骨誘導液的完全培養基(完全培養基+10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉+0.1 μmol/L地塞米松+50 mg/L維生素 C)，每 3 d更換1次培養液。細胞成骨分化誘導7 d后，采用TRIZOL法(美國Invitrogen公司)及RNA提取試劑盒(日本TaKaRa公司)提取細胞的總RNA，將RNA逆轉錄(ABI 2720,美國Thermo Fisher Scientific公司)成cDNA，實時熒光定量PCR(quantitative realtime PCR， qPCR)檢測實驗組和對照組細胞Runt相關轉錄因子-2(runt-related transcription factor-2，Runx-2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)及骨鈣素(osteocalcin,OC)基因的表達水平。實驗以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內參，采用 2-ΔΔCt法計算各組基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 成骨基因引物序列Tab.1 The primer sequences for osteogenic genes

1.7 統計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統計處理，采用獨立樣本t檢驗進行組間差別比較。P<0.05 為差別有統計學意義。

2 結 果

2.1 SF-CS支架的結構特征 SF-CS支架物理形貌如圖1所示。所獲得的樣本為白色海綿狀圓柱體，與24孔板外形一致。SEM下，支架呈三維多孔結構，孔徑為(251.16±69.85) μm?？紫堵屎臀史謩e為(89.10±2.74)%和(280.25±9.07)%，壓縮強度為(0.54±0.07) mPa。

SF-CS：絲素-殼聚糖。A～C：支架外觀；D～E：支架表面形貌掃描電鏡觀(D： ×40；E： ×400)。圖1 SF-CS支架形貌特征Fig.1 The morphology characters of SF-CS scaffold

2.2 SF-CS支架對細胞黏附的影響 SF-CS支架三維多孔結構對細胞黏附形態產生了明顯的影響。對照組BMSCs呈紡錘多角狀，緊貼培養皿底面呈二維生長(圖2A)。實驗組細胞貼附在SF-CS支架孔壁上，并沿著孔壁外形呈三維方向生長，細胞胞體變形和拉伸明顯，部分細胞伸出細長的偽足黏附到遠處的孔壁上，細胞胞體呈懸空狀(圖2B)。

SF-CS：絲素-殼聚糖；BMSCs：骨髓間充質干細胞。A： BMSCs在培養皿中的黏附形態( ×100)；B：BMSCs在SF-CS支架上的黏附形態掃描電鏡觀( ×2 500，箭頭所指為BMSCs)。圖2 BMSCs黏附形態Fig.2 The cell adhesion and morphology of BMSCs

2.3 SF-CS支架對BMSCs增殖能力的影響 兩組細胞的增殖趨勢良好。隨著培養時間的增加，細胞數量均明顯增加。在各個檢測時間點，實驗組的細胞增殖均高于對照組，差別有統計學意義(P<0.05，圖3)。

與對照組比較，△：P<0.05。圖3 骨髓間充質干細胞在不同時間點的增殖情況Fig.3 The cell proliferation of bone mesenchymal stem cells for different culture period

2.4 SF-CS支架對BMSCs成骨分化相關基因表達的影響 實驗組和對照組細胞成骨分化誘導7 d后，qRT-PCR檢測結果顯示，SF-CS支架上培養的細胞成骨分化相關基因Runx-2、ALP及OC的mRNA表達水平均高于對照組，差別有統計學意義(P<0.05,圖4)。

Runx-2:Runt相關轉錄因子-2；ALP：堿性磷酸酶；OC：骨鈣素。與對照組比較，△：P<0.05。圖4 骨髓間充質干細胞成骨分化相關基因表達水平Fig.4 The osteogenic gene expressions level in bone mesenchymal stem cells

3 討 論

理想的骨修復支架材料應具有良好的加工性能，當填充在骨缺損及骨量不足區域時，能為新骨的生長提供三維空間，同時具有一定的孔徑和孔隙率，能為組織細胞的黏附、生長及分化提供微環境。本研究通過冷凍干燥法制備了SF-CS支架，在掃描電鏡下，SF-CS支架呈現三維多孔形貌，孔徑和孔隙率與人體骨組織(50～300 μm，75%～90%)相似，具有一定的機械強度，能滿足非承重區如牙槽骨缺損骨修復支架的物理性能要求。

BMSCs是骨愈合過程中最重要的細胞，它的高度自我復制能力和多向分化潛能使其成為組織再生研究中應用得最為廣泛的種子細胞。細胞在材料表面的黏附是細胞-材料相互作用的第一步，也是細胞實現增殖、遷移、分化等行為的基礎。材料表面是否有利于細胞的黏附和生長，是評價材料生物性能的一個重要指標[5]。本研究中，BMSCs在SF-CS支架上具有良好的黏附能力，支架的三維多孔結構明顯影響了細胞的黏附形態，細胞沿著孔壁外形鋪展，并伸出細長偽足黏附至遠處孔壁。研究發現，絲狀偽足是細胞發生遷移的重要途徑[6]，說明SF-CS支架具有良好的生物相容性，有利于細胞的黏附和遷移。

BMSCs在材料上呈現出良好的增殖趨勢，CCK-8檢測結果表明，BMSCs在SF-CS支架上的增殖率高于二維平面培養的對照組，與既往的研究結果相似[7]。在細胞的成骨分化檢測中，實驗組BMSCs 成骨分化相關基因Runx-2、ALP及OC的表達水平較對照組細胞上調。Runx-2及ALP是BMSCs成骨分化早期的重要標志，OC是BMSCs成骨分化晚期的重要標志，這些結果說明SF-CS支架能促進BMSCs的成骨分化。以往研究表明，細胞外基質的微納形貌會對細胞功能產生巨大的影響[8-9]。相對于二維平面生長的對照組細胞，細胞在SF-CS三維支架上沿著多孔結構呈立體生長，鋪陳面積大，胞體更為拉伸。細胞形態的變化會導致細胞骨架發生形變，這種形變能直接產生力學刺激并通過細胞膜上的相關蛋白傳遞到細胞內部，激活下游一系列信號通路，如MAPK通路、β-catenin通路等，從而對細胞增殖及分化等生物學行為產生影響[10]。ZHANG等[11]發現，BMSCs具有更為拉伸的細胞形態和更大的細胞鋪展面積時，有利于成骨向分化。

綜上所述，本研究通過冷凍干燥法制備的三維多孔SF-CS支架利于BMSCs黏附，促進其增殖和成骨分化，提示該材料具有作為骨修復材料的潛能，后續將進行體內實驗進一步驗證該材料的成骨性能。