驅動蛋白Eg5的抑制劑及其抗腫瘤作用機制

林揚， 楊宇豪， 蔣啟凌(綜述)， 魏雅嵐， 佘振宇(審校)

驅動蛋白Eg5(kinesin-5)，又名驅動蛋白超家族成員11(kinesin family member 11，KIF11)，是一種廣泛表達于人體正常組織的蛋白，對紡錘體微管組裝、染色體排列和分離具有重要作用。在有絲分裂前期，Eg5蛋白定位于紡錘體微管和中心體，且沿微管正向運動。在有絲分裂的前中期，Eg5蛋白協同驅動蛋白-14調控中心體分離，維持紡錘體結構并促進染色體排列。同時，周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinase 1，Cdk1)通過磷酸化激活Eg5蛋白，調控紡錘體微管組裝[1]。

據報道，Eg5蛋白在多種惡性腫瘤中異常表達。因此，Eg5蛋白作為抗腫瘤藥物的作用靶點，其抑制劑在腫瘤化療過程的作用受到廣泛關注。從作用機制來看，相比于抗微管藥物或免疫抑制劑，Eg5抑制劑的抗腫瘤活性和特異性更強。Eg5抑制劑作為抗腫瘤藥物，其臨床前的基礎研究結果較有意義，但臨床上單藥治療效果不佳?；谒幬锖铣珊陀盟幏桨傅倪M一步研究，研究人員合成了更多種類的Eg5抑制劑，并且改進了部分藥物的用藥方案。本綜述探討Eg5蛋白在細胞分裂過程中的功能及其抑制劑的抗腫瘤機制，并深入分析Eg5抑制劑在臨床應用方面的潛力及其意義。

1 Eg5蛋白的結構及其在細胞周期中的調控機制

Eg5蛋白由N端的馬達結構域、螺旋卷曲結構域和C端的尾部結構域構成。在真核細胞中，Eg5蛋白利用ATP水解釋放的能量，沿微管正向運動。Eg5蛋白的尾部結構域可抑制其與ATP的結合，減緩Eg5蛋白的運動速度，并與微管產生較強的作用力。Eg5蛋白協助紡錘體組裝和中心體分離，從而調控染色體排列和分離。

從G2期到M期，Eg5同源四聚體通過螺旋卷曲結構域交聯反向平行微管。同時，Eg5蛋白拮抗平衡驅動蛋白KIFC1和動力蛋白(dynein)在微管上的作用力，共同調控雙極紡錘體的形成。在G2晚期，Eg5蛋白通過影響紡錘體的方向和長度，維持中心體在細胞核附近的定位。在有絲分裂前期，Eg5蛋白聚集于極間微管，產生作用于反向平行微管的向外作用力，最終促進極體分離。Eg5蛋白缺失導致復制后的中心體分離異常，形成單極紡錘體，誘導有絲分裂停滯[2]。此外，Eg5蛋白促進紡錘體微管的延伸、胞質流動和細胞遷移[3]。Eg5蛋白亦可協助驅動蛋白KIF15向赤道板運動，調控動粒微管組裝和染色體排列。

在細胞分裂過程中，Src家族激酶通過磷酸化Eg5蛋白馬達結構域的Tyr-125、Tyr-211和Tyr-231 位點，調控紡錘體兩極分離。在有絲分裂后期，Eg5蛋白的Cdk1磷酸化位點發生磷酸化，促進Eg5蛋白從紡錘體兩極遷移至紡錘體或中間體[4]。此外，Eg5蛋白通過磷酸化改變動粒微管伸展方向，限制細胞分裂后期微管的過度延伸，從而調控紡錘體微管結構[5]。

2 Eg5蛋白的抑制劑及其靶向Eg5蛋白的作用機制

研究表明，Eg5蛋白在肝細胞癌、膀胱癌和神經膠質瘤等實體瘤中高表達，且與腫瘤細胞的遷移能力和腫瘤預后密切相關[6-8]。Eg5蛋白可通過調控紡錘體長度參與結腸癌的病灶轉移[9]。在細胞間期，胞質內Eg5蛋白的分布與激素單純性前列腺癌的發生相關，而細胞核內Eg5蛋白上調導致腫瘤加速轉變為轉移性前列腺癌[10]。近年來，有關Eg5抑制劑在腫瘤治療的研究進展較多，具有臨床應用價值。

根據作用靶點的不同，Eg5蛋白的特異性抑制劑分為兩類：(1)一類是以早先發現的Monastrol及其喹唑啉酮同源物S-三苯-甲基-L-半胱氨酸(S-trityl-L-cysteine，STLC)和Ispinesib為代表。此類藥物通過結合并誘導Eg5蛋白的helix(螺旋)α2/loop L5(插入環可變區5)和helix α3的構象變化，使微管誘導的ATP酶活性降低。(2)另一類是ATP競爭性結合抑制劑，可特異性作用于Eg5蛋白的helix α4/α6位點，通過影響Eg5蛋白運動過程的構象轉換，使ATP無法結合和水解。這兩類變構競爭性抑制劑主要是限制Eg5蛋白沿著微管的運動功能。

2.1 helix α2/loop L5和helix α3靶向抑制劑

2.1.1 Monastrol 通過表型篩查發現的小分子抑制劑Monastrol，可特異性結合至Eg5蛋白的馬達結構域并誘導其發生變構，從而抑制Eg5蛋白與微管結合所引起的ADP釋放[11]。同時，Monastrol誘導的Eg5蛋白構象變化，使得Eg5蛋白與微管緊密結合，抑制了Eg5蛋白沿微管的正向運動[12]。此外，特定催化狀態下形成的Eg5-ADP-Monastrol復合體，以極弱的分子摩擦阻力沿著反向平行微管緩慢滑行，破壞了Eg5蛋白與驅動蛋白14的平衡，導致反向平行微管分離異常[13]。

2.1.2 STLC 大蒜中提取的STLC是一種與Eg5蛋白緊密結合的選擇性變構抑制劑。STLC通過降低Eg5-ADP與磷酸基團結合的緊密程度，抑制中心體分離，誘導單極紡錘體形成，導致有絲分裂停滯和細胞凋亡。此外，STLC誘導loop L5向下擺動，關閉抑制物結合袋的入口，穩定Eg5蛋白與STLC的結合[14]。STLC的作用機制與Monastrol類似，但前者與Eg5蛋白的結合更緊密。同時，STLC通過抑制loop L5的結構變化，使Eg5蛋白無法以運動狀態結合至微管，達到更強抑制效果。另外，STLC對Eg5蛋白微管扭轉力的抑制擾亂了紡錘體微管的順時螺旋結構，破壞了紡錘體的手性結構[15]。

2.1.3 藤黃雙黃酮(Morelloflavone) 植物中提取的Morelloflavone通過緊密結合Eg5蛋白抑制Eg5蛋白的紡錘體組裝功能。與STLC不同，Morelloflavone使Eg5蛋白與ADP形成更為穩定的構象，抑制了Eg5-ADP和Eg5-ATP的構象轉化，降低了Eg5蛋白與ATP和微管的親和力。同時，Morelloflavone抑制了ATP酶活性，影響Eg5蛋白沿微管運動的功能[16]。

2.1.4 伊斯平斯(Ispinesib) 作為第一個進入臨床化療的小分子Eg5抑制劑，Ispinesib與STLC類似，通過誘導Eg5蛋白構象變化而降低Eg5-ADP與磷酸基團結合的緊密程度。Ispinesib不受限于Eg5蛋白的催化位點狀態及與微管的結合狀態，可結合到loop L5，并提前誘導連接結構域(neck linker)的結合[17]，通過阻止ADP的釋放而抑制Eg5蛋白的微管運動。

2.1.5 非蘭尼塞(Filanesib，Arry-520) Filanesib是目前處于臨床開發階段、高選擇性的小分子Eg5抑制劑。Filanesib通過結合到Eg5蛋白的馬達結構域達到抑制效果。同時，在Eg5高表達的血液瘤細胞中，survivin的表達使Filanesib的抑制活性增強[18]。免疫缺陷小鼠模型及血液瘤患者的實驗結果也表明，機體對Filanesib的合理用藥較Ispinesib具備更良好的耐受性[19-20]。

2.1.6 K858 K858是基于表型篩查的小分子Eg5抑制劑，抑制Eg5蛋白的作用，使得細胞形成四倍體。K858是在癌癥治療中較常用的Eg5抑制劑，能夠降低胃腺癌細胞的侵襲性。與其他抑制劑一致，K858不抑制微管聚合，因此并不具備明顯的細胞神經毒性[21]。

2.1.7 Dimethylenastron 相較于二氫嘧啶同源物，Dimethylenastron具備與Eg5蛋白變構位點更高的親和力，使Eg5-ADP構象更為穩定，可有效抑制Eg5蛋白的作用活性，并上調熱休克蛋白70的表達。作為化療藥物，Dimethylenastron的副作用相對較小，且不影響Eg5蛋白與微管的相互作用[22]。

2.1.8 AZD4877 AZD4877作為化學合成的Eg5選擇性抑制劑，可作用于變構位點，抑制Eg5蛋白的微管運動。因其具有良好的藥代動力學特性和活性，在腫瘤疾病治療中具有潛在價值[23]。

2.1.9 YL001 YL001是計算機輔助藥物設計出的STLC類似物，其結構異于其他Eg5抑制劑。YL001不僅抑制Eg5蛋白的ATP酶活性，而且可使Eg5蛋白過度磷酸化，從而抑制Eg5蛋白沿微管運動。YL001在黑色素瘤細胞及耐藥株中抑制活性明顯[24]。

2.2 helix α4/α6靶向抑制劑

2.2.1 GSK-1和GSK-2 雙芳基化合物GSK-1和GSK-2靶向定位于helix α4/α6位點之間，抑制了Eg5蛋白沿微管運動時連接結構域的構象變化，從而影響ATP的水解及循環。因此，可誘導單極紡錘體的形成和細胞周期停滯，并可對Ispinesib耐藥細胞株產生抑制效用[25]。

2.2.2 噠嗪類藥物(Pyridazine analogs) 高通量虛擬篩選出的Pyridazine類藥物，對Eg5蛋白具有良好的親和力，與ATP競爭性結合Eg5蛋白的helix α4/α6 位點，從而有效抑制Eg5蛋白[26]。同時，機體對Pyridazine類藥物具有良好的吸收、代謝和排泄能力[26]。

3 Eg5抑制劑的抗腫瘤活性與機制

基于Eg5抑制劑的作用機制，以及Eg5蛋白在腫瘤細胞中的異常表達，關于Eg5抑制劑的亞臨床研究有一定進展。在膠質母細胞瘤中，K858通過抑制紡錘體微管組裝和激活紡錘體組裝檢驗點，長期給藥誘導有絲分裂細胞死亡、多倍體形成和細胞衰老，實現抗腫瘤作用[21]。體外研究發現，AZD4877具備良好的藥代動力學特性，且對胃腸道、膀胱及血液等組織器官的腫瘤細胞系的增殖有抑制效果。在黑色素瘤異種移植的小鼠模型中，YL001的腫瘤抑制效果使小鼠生存率提高至60%[24]。以上研究表明了Eg5抑制劑的抗腫瘤活性，相關作用機制值得進一步探討。

3.1 抗腫瘤細胞增殖活性 Eg5蛋白通過調控細胞分裂紡錘體組裝在細胞周期中發揮重要作用。Eg5抑制劑AZD4877能有效誘導晚期人結腸癌等實體瘤細胞單極紡錘體的形成[23,27]，激活紡錘體組裝檢驗點，從而活化泛素連接酶APC/C，使細胞停滯在G2/M期。另外，Eg5抑制劑可誘導腫瘤細胞躲避有絲分裂的阻滯作用，沉默紡錘體組裝檢驗點，發生有絲分裂逃逸，使細胞停止在G1期或形成多倍體[21-22]，從而達到廣泛的抗腫瘤增殖活性。在此基礎上，Eg5抑制劑對腫瘤細胞的凋亡誘導進一步實現了其抗腫瘤活性。

3.2 誘導腫瘤細胞凋亡活性 Eg5抑制劑誘導的細胞凋亡主要通過激活細胞內源性凋亡通路完成，并依賴紡錘體組裝檢驗點抑制異常的細胞增殖并引發凋亡。細胞周期檢查點激酶1(cell cycle checkpoint kinase，CHK1)和Eg5蛋白的靶向抑制可影響ER+/PR+/HER2-乳腺癌腫瘤細胞的存活[27]。在檢驗點蛋白BubR1/Mad2缺失的情況下，Monastrol并沒有達到抑制腫瘤生長的作用[28]。在紡錘體組裝檢驗點完全缺失的情況下，Eg5抑制劑誘導的非整倍體細胞的形成反而促進腫瘤發生。同時，抑制劑YL001及K858可激活凋亡相關蛋白半胱氨酸蛋白酶(Caspase 3/9)，從而促進腫瘤細胞凋亡[21,24]，而STLC的衍生物則通過使聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)裂解而誘發細胞凋亡[29]。此外，Eg5抑制劑更易誘導血液惡性腫瘤細胞發生凋亡[18]。

腫瘤細胞的凋亡與腫瘤的發生進程息息相關，并與腫瘤細胞的異質性有關。凋亡依賴抑癌基因p63在浸潤性膀胱癌而非早期膀胱癌中高表達。AZD4877可誘導浸潤性膀胱癌細胞的p63基因及其下游靶點c-myc基因的表達[30]。通過c-myc、周期蛋白等S期促進因子上調Eg5蛋白的表達水平，提高腫瘤細胞對Eg5抑制劑的敏感性。另外，乳腺癌細胞中蛋白酶B(AKT)的抑制顯著下調了凋亡抑制基因survivin，使K858達到更強的誘導細胞凋亡效果[21]。綜上所述，Eg5抑制劑的腫瘤殺傷作用與PI3K/AKT信號通路密切相關。此外，Monastrol作為實體瘤中高表達的NAD(P)H脫氫酶1的結合底物，可激活氧化應激反應，從而誘發腫瘤細胞凋亡[7-8]?；诓糠諩g5抑制劑的抗氧化性，探究其在含大量自由基的腫瘤細胞中的應用具有較好的研究前景。因此，深入探究腫瘤細胞的凋亡機制及其與Eg5抑制劑的聯系，對腫瘤的臨床治療具有指導意義。

3.3 腫瘤細胞耐藥性 獲得性耐藥常見于轉運體活性改變或藥物靶點突變的腫瘤細胞。最早發現的Eg5天然抑制劑Terpendole E及其生物制劑僅影響Eg5蛋白與微管的連接[31]。而以Monastrol為代表的藥物則靶向作用于Eg5蛋白馬達結構域的helix α2/loop L5和helix α3區域。因為Eg5蛋白的N端結構域是抑制劑的作用靶點，其突變將導致細胞耐藥。loop L5調控Eg5蛋白與Monastrol/STLC等抑制劑的變構結合，抑制劑易誘導Eg5蛋白loop L5(D130A/A133D)位點突變，使腫瘤細胞產生耐藥且不喪失酶活性，而helix α3(L214A)位點的突變卻使腫瘤細胞對Ispinesib更為敏感[32-33]。另一靶點helix α4/α6的突變可抵抗Pyridazine類藥物或GSK-1對Eg5蛋白的抑制作用[25-26]。不同靶點藥物的聯用可較好抑制Eg5蛋白的紡錘體組裝功能。同時，變構競爭性抑制劑與活性中心競爭性酶抑制劑的組合可有效避免靶點突變導致的細胞耐藥性。進一步探究核苷酸位點結合抑制劑(如噻唑類藥物)，對Eg5抑制劑的臨床應用也有一定意義。

有趣的是，Eg5蛋白的C端結構域截斷突變能夠使腫瘤細胞對STLC耐藥，并通過促進自身磷酸化維持極間微管的交聯和KIF15的正確定位[34]。此外，K858導致的survivin表達上調[21]，以及Dimethylenastron導致的熱休克蛋白70表達上調[22]，使得腫瘤細胞對化療敏感性下降。而在Monastrol耐藥細胞中表達升高的circRNAs-MTO1，通過抑制Eg5蛋白的翻譯殺傷乳腺癌細胞，同時改善了腫瘤細胞對Monastrol的耐藥性[35]。一般來說，除了微管蛋白的突變和微管動力學改變，紫杉醇(Taxol)耐藥細胞的形成還與P-糖蛋白的表達呈正相關。然而，小分子Eg5抑制劑對細胞的作用并不依賴P-糖蛋白。因此，探究腫瘤細胞對Eg5抑制劑的耐藥性形成機制可為臨床化療方案提供參考。

4 Eg5抑制劑的臨床應用及其進展

4.1 單藥的臨床應用進展 在Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗中，AZD4877雖然對晚期實體瘤和難治性血液瘤表現出較好的Eg5蛋白抑制效果，但療效欠佳[36]。同時，Ispinesib在復發或轉移性黑色素瘤和頭頸部鱗狀細胞癌無明顯療效[37-38]。然而，腫瘤細胞內Eg5蛋白的高表達仍是治療靶點的有利支持?；贓g5抑制劑良好的體外抗腫瘤活性，以及Ispinesib和AZD4877等良好的機體耐受性，研究人員進一步探究了Eg5抑制劑對腫瘤患者的療效。超過閾值劑量的Filanesib與地塞米松及蛋白酶體抑制劑聯用，對難治性惡性血液腫瘤具有效用[19-20]。因此，進一步研究Eg5抑制劑與其他藥物的聯用以及用藥劑量和用藥時效等具有一定臨床價值。

4.2 Eg5抑制劑與抗微管活性藥物的聯用 抗微管活性藥物影響間期囊泡運輸而產生神經毒性，所以機體耐受性相對較差。與常規抗微管活性藥物相比，Eg5抑制劑Monastrol對腫瘤具有更好的特異性[39]，并且STLC對紫杉醇或吉西他濱耐藥腫瘤細胞依舊有效[40]。長春堿協同Monastrol或Ispinesib在ER-/PR-/HER2-乳腺癌細胞系表現出更高效的選擇性[41]。因此，Eg5抑制劑能夠補充抗微管活性藥物的抗腫瘤活性。

另外，Ispinesib與多烯紫杉醇聯用對晚期實體瘤患者產生可耐受的細胞毒性和非積累性的中性粒細胞減少[42]，表明二者聯用存在一定可行性。然而，紫杉醇反而降低Eg5抑制劑對卵巢癌及乳腺癌的效用[43]。沙戈匹隆(Sagopilone)對廣泛的異質性乳腺癌具備較紫杉醇更好的效果，但其與Eg5抑制劑并無抗腫瘤的協同效應[44]。此外，藥物使用導致survivin表達的上調和凋亡信號的分子改變等亦影響二者的聯用效果[21]。進一步探究Eg5抑制劑與抗微管活性藥物的組合，可為Eg5抑制劑的臨床用藥提供更多元化的方案。

4.3 Eg5抑制劑與免疫抑制劑的聯用 通過聯用免疫抑制劑，機體對藥物表現出良好的耐受性。臨床試驗中也發現了Ispinesib增強曲妥珠單抗、拉帕替尼的抗腫瘤活性[45]。臨床Ⅰ/Ⅱ期實驗中，Filanesib與地塞米松及泊馬度胺、卡非佐米(Carfilzomib)等蛋白酶體抑制劑聯用表現出對難治性多發性骨髓瘤更好的效用[19-20]。通過延長超過閾值濃度Ispinesib及Filanesib等藥物的暴露時間，使更多的細胞進入藥物敏感期，可優化抑制劑的療效[38]。此外，低劑量的紫杉醇與免疫抑制劑的聯合應用足以支持抗腫瘤的免疫檢測[46]。未來的研究重點不僅是調整Eg5抑制劑與免疫抑制劑的化療方案，更重要的是通過免疫檢測判斷藥物效用和機體免疫應答能力。

4.4 Eg5抑制劑對不同種類腫瘤的療效差異 雌激素受體陽性的乳腺癌細胞對STLC和Monastrol的腫瘤抑制效果更為敏感[47]，但雌激素并不會強化其他腫瘤細胞對Eg5抑制劑的敏感性。相反，MTO1的上調會抑制癌癥細胞中Eg5蛋白的表達水平[35]。這說明不同種類的腫瘤細胞可通過不同因素調節Eg5蛋白水平。因此，臨床療效欠佳理應考慮到協作Eg5蛋白功能的因子，以及機體長期用藥而導致此類因子的表達異常而導致耐藥。這不僅可解釋臨床上Eg5抑制劑對不同分化及不同種系的腫瘤細胞的差異性效用，還為Eg5蛋白作為癌癥臨床治療靶點提供新的研究思路。

5 展 望

驅動蛋白Eg5在有絲分裂中的重要性使其成為腫瘤化療藥物的研究熱點。Eg5抑制劑通過誘導Eg5蛋白運動域構象變化，從而表現出更強的抑制效果。Eg5抑制劑通過激活紡錘體組裝檢驗點和氧化應激反應，從而誘導細胞凋亡，在體外表現出高效的抗腫瘤活性。但是，Eg5抑制劑在臨床現有的試驗數據中并未表現出良好的腫瘤療效，有待進一步研究。

細胞耐藥性形成與Eg5蛋白結構突變或其他相關蛋白異常表達有關。進一步探究Eg5抑制劑與其他抗腫瘤藥物的聯系，或研究相關分子對腫瘤細胞Eg5蛋白功能的影響，對優化藥物抗癌效用有積極的臨床意義。同時，抑制劑誘導變構的兩個不同結合位點，對臨床聯合用藥提高Eg5抑制劑的抗腫瘤的有效性和患者生存率提供了新的可能。以上思路可以為未來優化Eg5抑制劑在腫瘤治療中提供借鑒和參考。