IDH野生型膠質母細胞瘤患者預后影響因素分析

許廣智，張佳樂，伊西才，魏禮洲，劉衛平

2016年WHO中樞神經系統腫瘤分類第四版修訂版，對于膠質母細胞瘤(glioblastoma，GBM)的分類方法進行了革新，將GBM分為異檸檬酸脫氫酶1(isocitric dehydrogenase，IDH1)突變型，IDH1野生型及IDH1未檢測型[1]。經過五年的完善，2021年WHO中樞神經系統腫瘤分類第五版中，制訂了新的分類標準，取消了GBM的IDH突變型，將傳統的WHO Ⅳ級成人GBM分類改為成人型彌漫性膠質瘤，并且將其細分為IDH突變型的星形細胞瘤，IDH突變和1p/19q雜合性缺失的少突膠質細胞瘤，以及IDH野生型的GBM[2]。WHO Ⅳ級膠質瘤是中樞系統最常見的原發性惡性腫瘤，具有極高的異質性，生存期短，復發率高，且易侵襲，多浸潤性增長，與周圍正常腦組織分界不清，是膠質瘤中惡性程度最高的腫瘤。其首發臨床癥狀多以占位效應、顱內高壓以及癲癇為主，部分研究表明具有癲癇為首發癥狀的預后較好[3]。目前標準治療方案為最大程度的腫瘤切除術以及術后放化療。接受標準治療的患者，自初次診斷起的平均生存期為13.5個月，5年生存率不足5%[4-5]。年齡，切除程度，是否接受標準化治療都是總生存期(overall survival,OS)的臨床特征保護因素[6]。除了臨床特征以外，部分組織學及基因學標志物表達也與患者的生存期相密切關。本研究通過分子診斷技術，對2017年1月—2019年12月西京醫院神經外科收治的97例WHO Ⅳ級IDH野生型GBM患者進行預后分析。評估臨床特征及O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(O6methylguanine DNA methyltransferase，MGMT)，ATRX，P53,Ki-67蛋白表達及1p/19q雜合性缺失對診斷、預后和治療的影響，并且將IDH野生型的GBM與5例WHO Ⅳ級IDH突變型成人彌漫性膠質瘤進行比較，對在新的WHO中樞神經系統腫瘤分類后的IDH野生型GBM進行預后分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 共納入102例WHO Ⅳ級膠質瘤患者，其中男61例，女41例；年齡20～79歲，平均年齡51.28歲；IDH野生型GBM共97例，IDH突變型星形細胞瘤4例，IDH突變并且1p/19q雜合性缺失少突膠質細胞瘤1例。納入標準：(1)所有患者首次因膠質瘤入院并且未接受其他治療；(2)所選病例由西京醫院病理科專家診斷為WHO Ⅳ級膠質瘤；(3)患者臨床資料及隨訪完整；(4)腫瘤病理標本符合檢測要求，并具有完整的分子標志物數據；(5)術前無嚴重的心肝腎等系統異常；(6)所有患者對分子檢測知情同意，并簽署知情同意書；(7)所有患者均行全麻下腫瘤全切術。

1.2 免疫組化方法及表達的判定方法 術中取出的腫瘤組織置于4 ℃中新鮮凍存并送病理保存，之后用20%緩沖福爾馬林固定包埋在石蠟中，并使用SP法進行免疫組化檢測，使用MGMT單克隆抗體(福州邁新公司，即用型)，P53單克隆抗體(福州邁新公司，即用型)，ATRX單克隆抗體(福州邁新公司，即用型)，IDH突變使用sanger測序法進行檢測。1p/19q雜合性缺失采用Fish法，使用奧林巴斯熒光顯微鏡觀察分析。所有組化結果高表達指標判定方法：每個切片選擇5個高倍(×400)視野，陽性率細胞大于10%判定為陽性，其中Ki-67陽性細胞率大于20%為陽性，P53彌漫陽性視為突變型(圖1)。

A：ATRX陽性； B：Ki-67陽性； C：MGMT陽性； D：P53彌漫陽性

1.3 切除程度評價及隨訪方法 通過手術記錄，術后影像學資料來判定切除程度。通過電話隨訪的方式對患者進行出院后隨訪。術后生存期定義為手術日至患者因GBM死亡或隨訪截止時間。平均隨訪日期為18.2個月。

1.4 統計學方法 使用SPSS 23.0軟件對數據進行分析。通過Kaplan-Meier法以生存時間制作生存曲線進行單因素分析，通過Log-rank檢驗進行組間生存率比較。對單因素分析有意義的因素用COX比例風險回歸模型驗證危險因素及風險比率(hazard ratio，HR)，并且引入檢驗水準為0.05，剔除檢驗水準定為0.1。所有檢測均為雙側檢測并且α為0.05。成人彌漫性膠質瘤中IDH突變及IDH未突變型的比較，首先檢驗數據的正態性，由于不符合正態分布，因此以中位數(25%分位數，75%分位數)描述，比較采用Wilcoxon秩和檢驗。

2 結 果

2.1 臨床特征 本研究中，年齡大于55歲的患者48例(47.0%)；性別比例為男∶女=61∶41；術前卡氏功能狀態評分標準(Karnofsky performance status，KPS)評分>70分的78例(76.4%)；術中完全切除腫瘤的為50例(49%)；術后接受同步放化療的為57例(55.9%)，僅接受化療的為7例(7.0%),僅接受放療的為1例(1.0%)，接受放化療但并未進行同步放化療的為1例(1.0%)，未接受放化療的為36例(35.0%)。截止2021年10月28日因膠質瘤而死亡的89例(87.2%)，平均生存期為19.7(95%CI16.9～22.5)個月，中位生存期為15.5(95%CI13.0～18.0)個月。見表1。

表1 102例WHO Ⅳ級膠質瘤患者臨床特征

2.2 術后單因素分析結果 患者年齡，KPS評分，腫瘤是否全切，是否接受同步放化療治療，以及MGMT蛋白表達對生存期有影響(P<0.05)?；颊叩男詣e，ATRX表達，P53突變型表達，1p/19q雜合性缺失對生存期無統計學影響(P>0.05)。見表2。

表2 97例WHO Ⅳ級IDH野生型GBM患者單因素生存分析

2.3 術后多因素分析結果 用COX比例風險模型進行多因素分析顯示，患者的年齡、術前KPS評分、腫瘤切除程度、是否接受同步放化療治療、MGMT蛋白表達，是生存期的獨立影響因素(P<0.05)。見表3。

表3 97例WHO Ⅳ級IDH野生型GBM患者多因素生存分析結果

2.4 WHO Ⅳ級成人彌漫性膠質瘤生存期差別 本研究的IDH野生型成人彌漫性膠質瘤中位生存時間為14.53(8.36～23.1)個月，而IDH突變型成人彌漫性膠質瘤中位生存時間為33.00(21.85～50.23)個月。兩組都為原發性WHO Ⅳ級成人彌漫性膠質瘤。由于樣本不滿足正態分布，因此使用秩和檢驗可知兩組間差異具有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

2021年第五版WHO中樞神經系統腫瘤分類發布后，對于神經系統的研究進入了一個新的階段。之前國內外對于膠質瘤預后因素分析的研究中，未將WHO Ⅳ級的成人彌漫性膠質瘤中的IDH突變型星形細胞瘤和IDH突變型及1p/19q雜合性缺失少突細胞瘤與IDH野生型GBM區分開。而本研究中，除了通過單因素多因素分析，探討了WHO Ⅳ級IDH野生型GBM相關的預后因素，還研究WHO Ⅳ級成人彌漫性膠質瘤中的IDH野生型GBM與其他兩型的預后區別。本研究通過對97例IDH野生型GBM進行單因素及多因素分析，可知在IDH野生型GBM中，術前KPS評分，患者年齡，腫瘤切除程度，是否接受同步放化療都是獨立的影響因素，這個結果與WHO Ⅳ級膠質瘤的臨床因素中與預后相關的獨立影響因素相似[7]。分子標志物中，MGMT蛋白表達是WHO Ⅳ級IDH野生型GBM的獨立影響因素(P<0.05)。既往研究中，MGMT蛋白的低表達是WHO Ⅳ級膠質瘤預后中的獨立保護因素[6]；本研究進一步發現，MGMT蛋白低表達在WHO Ⅳ級IDH野生型膠質瘤中是獨立的保護因素。

IDH是三羧酸循環的重要組成部分，其在WHO Ⅳ級膠質瘤中突變率為12%，在繼發性WHO Ⅳ級膠質瘤中突變率為73%，在原發性WHO Ⅳ級膠質瘤中，其突變率僅為3.7%[8-9]。但繼發性WHO Ⅳ膠質瘤中的高IDH發生率也表明，具有IDH突變的低級別膠質瘤常發生惡性轉化為高級別膠質瘤。具有IDH1/2突變的WHO Ⅳ級膠質瘤患者預后明顯好于IDH野生型的GBM患者，既往文獻表明，具有IDH1/2突變的WHO Ⅳ級膠質瘤患者中位OS為31個月，而IDH野生型GBM患者，其中位生存期為15個月[10]。2021年新修訂的WHO中樞神經系統腫瘤分類第五版，進一步將2016版WHO中樞神經系統腫瘤分類中的WHO Ⅳ級成人GBM(舊版)分類進行細分，將IDH突變型GBM刪除，保留IDH野生型GBM，但將IDH突變型的成人WHO Ⅳ級膠質瘤分類為IDH突變型星形細胞瘤，將IDH突變并伴有1p/19q雜合性缺失的成人WHO Ⅳ級膠質瘤分類為IDH及1p/19q雜合性缺失的少突膠質瘤，可見IDH突變不僅是膠質瘤預后標志物，也是WHO Ⅳ級膠質瘤的分類標志物。本研究中通過對比WHO Ⅳ級IDH野生型GBM及IDH突變型WHO Ⅳ級成人彌漫性膠質瘤，發現IDH野生型GBM患者生存期更短[2]，因此術后常規進行IDH基因檢測，除了可以更好地對WHO Ⅳ級膠質瘤進行分類，還可以更好地預測患者的預后。

MGMT基因是膠質瘤最重要的甲基化標志物。MGMT編碼的DNA修復蛋白可以將鳥嘌呤O6位置的烷基基團清除，但當DNA修復消耗的MGMT蛋白不足時，會導致未修復的DNA受到損傷。MGMT啟動子甲基化可使MGMT蛋白表達受到抑制，可能加強DNA對烷基化試劑(替莫唑胺)的敏感性。并且膠質瘤一些位點的基因啟動子甲基化，會導致某些抑癌基因的表達水平改變[11]。同時，對于具有IDH1突變和MGMT啟動子甲基化的WHO Ⅳ級膠質瘤，替莫唑胺的療效更好[12]。雖然有多項研究證實MGMT啟動子甲基化與MGMT蛋白的表達呈負相關，但MGMT啟動子甲基化與MGMT蛋白表達并不完全一致[13]。MGMT蛋白在舊的分類的WHO Ⅳ級GBM中，作為一種單獨預后標志的作用已被證實，并被廣泛運用于膠質瘤的分子標志物檢查中[6]。本研究中，MGMT啟動子甲基化在WHOⅣ級IDH野生型GBM中的單因素及多因素分析中有統計學意義(P<0.05)，且MGMT蛋白的低表達為保護因素，因此應當積極地對進行了腫瘤全切術的IDH野生型GBM患者進行術后常規MGMT啟動子甲基化或者蛋白表達量檢測，可以更好地對患者術后生存時間進行預測。

ATRX蛋白表達、P53突變型表達、Ki-67表達在其他類型的腫瘤中有發現與預后相關[14-17]，但既往文獻中沒有報道這三種分子的蛋白表達對于WHO Ⅳ級IDH野生型GBM的預后是否相關，因此本研究將這三種分子標志物納入分析因素中，并證實這三種分子標志物與IDH野生型GBM預后不相關。 其中ATRX基因是地中海貧血/精神發育遲滯綜合征的致病基因，位于X染色體，其基因突變導致的ATRX蛋白缺失，與端粒替代延長機制(alternative lengthening of telomeres,ALT)密切相關[14]。約80%的原發性和7%的繼發性WHO Ⅳ級膠質瘤會具有ATRX突變，并且通常伴隨有IDH突變[7]。在WHO Ⅲ級膠質瘤中，具有ATRX缺失的間變性膠質瘤預后明顯好于沒有ATRX缺失的間變性膠質瘤[14]，在WHO Ⅳ級IDH野生型GBM中，ATRX突變僅占很少的部分(3%)，但有研究表明雖然在IDH突變型WHO Ⅳ級成人彌漫性膠質瘤中ATRX與預后不相關，但在WHO Ⅳ級IDH野生型成人彌漫性膠質瘤中，ATRX突變型與ATRX野生型相比，其生存率增加[18]。P53基因包括突變型和野生型，其中野生型為抑癌基因。突變型在免疫組化上呈高表達并且與腫瘤惡性程度呈正相關[19]。P53主要通過改變參與細胞周期、凋亡和細胞衰老的眾多基因的表達來發揮作用[20]。雖然在其他類型腫瘤中已經發現P53突變與預后相關[15]，但P53突變與WHO Ⅳ級膠質瘤預后的相關性仍存在爭議[21]。Ki-67是一種非組蛋白，在增殖細胞的整個細胞周期中表達，但在靜止細胞(G0)中不表達，被用于區分生長細胞和非生長細胞[22]。有薈萃分析報道，Ki-67的高表達與低生存期相關[16]。1p/19q雜合性缺失，即染色體1短臂和染色體19長臂的共同缺失，導致染色體臂著絲粒移位。其中，1p/19q雜合性缺失及IDH突變共同出現的膠質瘤定義為少突膠質瘤[1]。1p/19q雜合性缺失在低級別膠質瘤中常見，但1p/19q雜合性缺失在WHO Ⅳ級膠質瘤中很少見。1p/19q雜合性缺失是否和WHO Ⅳ級膠質瘤患者的預后相關仍有爭議[17,23]，由于1p/19q雜合性缺失有假陽性的可能，主要用于膠質瘤的分類中[24]。本研究中, Ki-67蛋白表達量以及1p/19q雜合性缺失與預后不相關(P>0.05)，可能與樣本量不足或判讀方式的誤差有關，如Fish檢測的假陽性。ATRX蛋白表達，P53突變型表達也與膠質瘤預后不相關(P>0.05)，雖然它們的基因突變被證明與WHO Ⅳ級成人彌漫性膠質瘤預后相關，但其蛋白表達與預后不相關可能與其基因表達與蛋白質表達并不一致有關。

綜上所述，本研究探討了在2021年WHO中樞神經系統新分類下的WHO Ⅳ級IDH野生型GBM中，臨床因素以及分子標志物蛋白表達與預后的關系。在WHO Ⅳ級IDH野生型GBM中，除了年齡、腫瘤的切除程度、術前KPS評分以及患者術后是否接受同步放化療為評估患者預后的獨立的臨床因素(P<0.05)， MGMT蛋白的低表達作為分子標志物也是獨立的保護因素。并且ATRX,P53, Ki-67蛋白表達以及1p/19q雜合性缺失與WHO Ⅳ級IDH野生型GBM預后不相關(P>0.05)。因此，術后可以對患者進行分子標志物的檢測，除了可以更好地對患者進行臨床分型，也可以對患者預后及治療進行指導。本研究為單中心研究，樣本量仍有一定局限，后續會進行臨床多中心研究，以進一步探索WHO Ⅳ級IDH野生型GBM患者的預后因素以期望更好的指導臨床。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。