壞死性凋亡在腦卒中疾病中的研究進展

魯正剛，魏民，李琛，胡政偉，張恒柱

腦卒中是一種急性腦血管疾病,是由于腦部血管突然破裂，或因血管阻塞導致血液不能流入大腦相應區域，而引起腦組織損傷的一組疾病,目前主要分為缺血性卒中和出血性卒中。腦卒中因其發病率高、死亡率高和致殘率高的特點，已成為危害中老年人群健康和生命的主要疾病，是全球第二大死亡原因，僅次于缺血性心臟病[1]?？焖倩謴湍X血流量是缺血性卒中治療的首要目標，也是神經保護治療的前提。重組組織型纖溶酶原激活劑(recombinant tissue plasminogen activator，rtPA)靜脈溶栓是FDA批準的治療急性缺血性腦卒中的唯一藥物。然而，由于rtPA治療窗口狹窄及其引起的再灌注損傷，只有5%的患者從rtPA治療中受益[2]，因此迫切需要新的治療措施來干預。壞死性凋亡是一種獨特的非半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)依賴的程序性死亡，在形態學上具有明顯的壞死特征。近年來，許多研究表明壞死性凋亡涉及腦卒中相關疾病的發生機制，并且通過干預壞死性凋亡信號通路，對包括缺血再灌注損傷、腦出血、蛛網膜下腔出血等腦卒中相關疾病具有一定的保護作用，有望為治療這些疾病的藥物開發提供潛在新靶點。因此，深入闡明壞死性凋亡信號通路與腦卒中之間的關系具有一定的臨床指導意義。

1 壞死性凋亡的信號轉導機制

1.1 壞死性凋亡的誘導 壞死性凋亡可由多種誘因誘導，包括腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族，如TNF、TNF相關的凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)和凋亡相關因子配體(FasL)；活性氧(reactive oxidative species，ROS)[3]：脂多糖和某些病原體和損傷相關分子模式(damage related molecular model，DAMPs)等。其中由TNF-α/腫瘤壞死因子受體1(tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1)[4]誘導的通路是目前研究最為廣泛和深入的導致壞死性凋亡的通路(圖1)，因此將進一步討論該途徑以闡明關鍵的信號成分。

圖1 TNF-α誘導的細胞死亡分子機制

1.2 復合體1的形成 TNFα與TNFR1結合后，TNFR1發生構象改變三聚化，繼而通過募集多種蛋白質來觸發復合體I的快速形成。這些募集的蛋白質包括：TNFR1相關死亡結構域蛋白(TNFR1-associated death domain protein,TRADD)，受體相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1)，TNFR 相關因子2(TNFR associated factor2,TRAF2)，TRAF5和E3泛素連接酶細胞凋亡抑制劑(cIAP1/2)和線性泛素鏈組裝復合體(LUBAC)。TRADD通過其死亡結構域(death domain，DD)和初始信號轉導募集到TNFR1上，緊接著RIPK1與TRAF2/5通過自身DD與TRADD相互作用被招募。然后，TRAF蛋白招募cIAP1/2，后者介導復合體I成員包括RIPK1的K63泛素化。LUBAC通過與復合體I中的K63泛素鏈結合而被招募，并對RIPK1進行線性(M1)泛素化。去泛素化酶CYLD及其SPATA2與A20和LUBAC一起被募集到復合體I中[5]。NEMO(NF-κB必需調節劑)，也稱為IKKγ，與RIPK1的K63多泛素鏈特異性結合，進而導致IkB激酶(IKKs)復合體(IKKα和IKKβ)的后續募集。此外，RIPK1的多聚泛素化對于募集轉化生長因子β活化激酶(transforming growth factor β activated kinase，TAK)復合體[TAK1和TAK1結合蛋白(TAB)1/2]也是必不可少的[6]。

1.3 RIPK1的激活 復合體I中RIPK1的廣泛翻譯后修飾，包括泛素化、去泛素化和磷酸化，影響著RIPK1的激活，進而決定細胞的生存或死亡以及細胞如何死亡。

1.3.1 RIPK1的泛素化和去泛素化修飾 在復合體I中，RIPK1受到多種泛素修飾，包括K63、M1和K48泛素化，這些泛素修飾在調節RIPK1的活化方面具有關鍵作用[7]。 RIPK1的K63泛素化由cIAP1/2催化，繼而介導了LUBAC的招募。LUBAC介導RIPK1的MI泛素化，通過募集多種含有UBAN的泛素結合蛋白，包括NF-B必需調節劑(NEMO)、NF-κB激活的A20結合抑制因子1(ABIN1)和optineurin(OPTN)，這些蛋白可以促進IKKs的激活、招募A20或調控RIPK1的K48泛素化，從而抑制RIPK1的激活[8-9]。Annibaldi等[10]發現CIAP1還介導RIPK1的K48泛素化，抑制其活性，促進其降解。

RIPK1上M1/K63泛素化與去泛素化復合體CYLD/SPATA2的比例對于調節其激活是至關重要[5,9]。缺乏LUBAC，例如在HOIP缺陷的細胞中，細胞對RIPK1激酶的激活和對TNFα誘導的死亡高度敏感。另一方面，CYLD主要通過去除RIPK1上的M1泛素鏈和K63泛素鏈來促進RIPK1的活化，CYLD和SPATA2缺乏部分程度上保護了細胞免受TNFα誘導的凋亡和壞死性凋亡的影響[5]。SPATA2的丟失損害了CYLD到復合體I的招募，并保留了RIPK1的M1泛素鏈，RIPK1的激活受到了阻礙[11]。LUBAC和去泛素化復合體的同時募集表明，復合體I中的成員，如TNFR1和RIPK1，既受泛素化又受去泛素化的調節。

1.3.2 RIPK1的磷酸化修飾 RIPK1激活也受TAK1介導的磷酸化調節。有證據表明TAK1可通過磷酸化直接抑制RIPK1的激活，也可通過激活下游激酶，包括MAPK激活的蛋白激酶2(MK2)和IKKs[12-13]間接抑制RIPK1的激活。此外，IKKα/β，也可以介導抑制性磷酸化。IKKα/β在Ser25處RIPK1的磷酸化會直接抑制RIPK1激酶活性，并阻止復合體II的組裝[14]。因此，TAK1和IKKα/β通過促進NF-κB介導的基因轉錄和抑制RIPK1活化介導重要的促生存反應。

1.3.3 一種獨特的RIPK1激活模式 Geng等[12]報道了一種獨特的RIPK1激活模式，它由一種不溶于洗滌劑、高度泛素化、活化的RIPK1物種(iuRIPK1)介導；在RIPK1依賴的凋亡(RDA)中，iuRIPK1在復合體Ⅰ和復合體Ⅱ的組裝之間起著關鍵的中介作用。此外，DD不僅在TNFR1信號的啟動中起關鍵作用，而且在復合體Ⅰ向復合體Ⅱ的轉變過程中介導RIPK1的二聚化，這對RIPK1的激活也是不可或缺的。

1.4 RDA和壞死性凋亡 RIPK1的激活代表TNFR1途徑中的一個關鍵信號事件，并指示下游細胞死亡或存活。在正常條件下，RIPK1由于受到多種泛素化或磷酸化修飾抑制其激活，繼而誘導TAK和IKK復合體的形成，二者協同觸發NF-κB、p38MAPK及其下游效應激酶MK2的激活，從而促進多種促炎性和促存活基因轉錄和翻譯[6]。當受到如HOIP缺陷、缺乏LUBAC等各種因素干擾時，RIPK1被激活，RIPK1的激活可通過驅動RIPK1-TRADD-Fas相關DD蛋白(FADD)-caspase-8復合體(復合體Ⅱa)的形成觸發caspase激活并導致RIPK1依賴的凋亡(RDA)[12]。相反，當細胞在激活凋亡介質caspase-8方面有缺陷時，RIPK1激活通過形成RIPK1-RIPK3-混合系激酶結構域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)復合體(復合體Ⅱb)導致壞死性凋亡。像RIPK1一樣，RIPK3具有N端激酶結構域，其后是包含RIP同型相互作用基序(RIP homotypic interaction motif，RHIM)的中間結構域；RIPK3通過RHIM被招募到RIPK1上被磷酸化激活。MLKL隨后被磷酸化的RIPK3招募并與RIPK1和RIPK3形成一個壞死體，在壞死體中RIPK3介導MLKL的磷酸化激活。在結構上，MLKL由一個N-末端四螺旋束結構域(N-terminal four-helical bundle domain，NTD)、一個帶有兩個α-螺旋的支撐區(brace region，BR)和一個含有螺旋激活環和ATP結合口袋的C-末端激酶樣結構域(kinase like domain，KLD)組成。MLKL的磷酸化導致BR的釋放，形成四聚體和隨后的八聚體而激發NTD與質膜的結合[15]。即當MLKL八聚體從壞死體上解離后，移位到質膜上，破壞了膜的完整性，導致細胞壞死性凋亡。

2 壞死性凋亡在腦卒中的研究進展

2.1 缺血性腦卒中 缺血是由于組織的血流受阻引起的，繼而因氧氣和營養供應不足導致細胞死亡；血流恢復后的再灌注可能導致ROS的爆發，ROS可介導RIPK1自磷酸化，繼而促進RIPK3依賴的壞死性凋亡[3]。

2.1.1 壞死性凋亡與缺血性腦卒中 Degterev等[16]首次發現壞死性凋亡參與導致小鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)腦損傷，其機制不同于細胞凋亡。此外，該研究還發現了一種特異性強的壞死性凋亡小分子抑制劑NEC-1，后來被證明可抑制壞死性凋亡的關鍵步驟RIPK1的激活。此后，一系列研究表明壞死性凋亡與缺血性腦卒中的發病機制密切相關，針對壞死性凋亡相關蛋白的藥物抑制或基因敲除能改善缺血性腦卒中后的腦損傷和神經功能。

在模擬缺血性腦卒中條件的缺氧-葡萄糖剝奪(oxygen-glu-cose deprivation，OGD)和MCAO模型中，Yang等[17]發現壞死性凋亡的相關蛋白RIPK1、RIPK3、MLKL以及缺氧條件下重要的轉錄因子缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor 1-Alpha，HIF-1α)表達上調。RIPK3抑制劑GSK‘872、凋亡抑制劑zVAD-fmk與GSK‘872的聯合處理和RIPK3 siRNA可抑制這些蛋白的表達，減輕細胞死亡、局灶性腦缺血和神經功能缺損，而單獨使用zVAD-fmk卻做不到。此外，研究還發現zVAD-fmk與GSK‘872的聯合處理比單一抑制劑處理效果更好。在Qu等[18]用OGD/zVAD-fmk處理的神經元中，RIPK1和RIPK3表達上調，并且RIPK1、RIPK3與MLKL的相互作用增加，而siRNA介導的MLKL抑制減輕了神經元死亡。在小鼠缺氧/缺血(hypoxic/ischemic,H/I)腦損傷模型中，Nec-1s治療可以減少高血糖小鼠梗死面積，表明在高血糖條件下，壞死性凋亡是導致腦損傷加劇的原因[19]，而且Xuan等[20]也發現預防壞死性凋亡可以減輕H/I介導的2型糖尿病小鼠腦損傷。在小鼠腦缺血/再灌注(Ischemia/ Reperfusion，I/R)模型中，Zhou等[21]發現在12 h后MLKL表達明顯增加，48 h達高峰，腹腔注射MLKL抑制劑Necrosulfonamide(NSA)后，腦梗死體積明顯縮小，神經功能缺損程度明顯緩解。進一步研究發現NSA通過泛素化蛋白酶體途徑而不是抑制RNA轉錄途徑降低MLKL水平。據報道，女貞苷(Ligustroflavone) 可以保護大鼠大腦免受缺血性損傷，其益處與通過抑制RIPK3與RIPK1或MLKL的相互作用有關[22]。

以上這些發現表明，壞死性凋亡與OGD、MCAO、H/I和I/R所致缺血性腦損傷有關，并且RIPK1、RIPK3和MLKL是治療壞死性凋亡的潛在靶點，促進它們的降解可能是減少缺血性腦損傷的有效途徑。

2.1.2 酸中毒通過介導壞死性凋亡促進缺血性腦卒中的發生 酸中毒在缺血性腦卒中等神經疾病中很常見。傳統上，鈣離子通過酸敏感離子通道1a(acid-sensing ion channel 1a，ASIC1a)內流被認為是缺血性酸中毒的主要原因。Wang等[23]發現一種新形式的神經元壞死性凋亡，ASIC1a通過將RIPK1招募到其C端(CT)促使其磷酸化激活來介導壞死性凋亡，而不依賴于其離子傳導功能。在MCAO模型小鼠腦區發現ASIC1a-RIPK1相互作用和RIPK1磷酸化，ASIC1a缺乏顯著阻止了RIPK1磷酸化和腦損傷，這表明ASIC1a介導的RIPK1激活參與了缺血性神經元損傷。最近，Wang等[24]證明了ASIC1a的N端(NT)與其CT相互作用，形成一種自動抑制，在靜止條件下阻止RIPK1的招募和激活。具體來說，酸中毒破壞NT末端的谷氨酸殘基，進而影響了ASIC1a的NT-CT的相互作用，顯示出這種自抑制作用的破壞是ASIC1a構象信號轉導誘導神經元壞死的基礎。此外，代表遠端20個ASIC1a-NT殘基的膜穿透合成肽NT1-20在體外酸中毒模型和在小鼠缺血性卒中模型中都減少了神經元損傷，顯示了針對ASIC1a自身抑制的治療潛力，對抗酸中毒來起到神經保護作用。

2.2 出血性卒中 出血性腦卒中，包括腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)和蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)，是一個重要的公共衛生問題，在全球范圍內發病率和死亡率都很高[25-26]。腦出血后的原發性損傷通常是由于血腫對周圍腦組織的機械性損傷所致。繼原發性損傷之后的繼發性損傷，包括炎癥和細胞死亡，廣泛地參與了出血后的病理過程[27]。

2.2.1 壞死性凋亡與ICH 有研究通過使用NEC-1減少細胞死亡和改善神經功能來抑制壞死性凋亡，從而間接證明在出血性腦卒中后的病理機制中存在壞死性凋亡[28]。在膠原酶誘導的ICH小鼠模型中，Zhu等[29]通過電子顯微鏡發現RIPK3缺陷的ICH小鼠壞死細胞較少。在自體血誘導的大鼠腦出血模型中，Shen等[30]采用小干擾RNA(Small interfering RNA，SiRNA)干擾敲除和重組腺病毒轉染RIP1過表達的方法治療大鼠腦出血模型，結果發現RIP1基因敲除使腦出血后碘化丙錠陽性細胞減少，而RIP1過表達使腦出血后腦組織碘化丙錠陽性細胞增加，免疫組化結果還表明，RIP1和RIP3、RIP1和MLKL、RIP1和caspase-8的相互作用被RIP1敲除顯著抑制，但被RIP1過表達增強；在類似模型中，Zhang等[31]發現模型大鼠的血腫周圍區域，E3泛素連接酶CHIP的表達增加，并且AAV/BBB-CHIP治療可改善腦出血后大鼠的腦損傷。Seo等[32]也報道，CHIP可介導RIPK1和RIPK3的泛素化并導致它們降解，具有CHIP缺陷的細胞模型顯示RIPK1和RIPK3的表達水平升高。此外，RIPK3基因敲除可以減輕因CHIP缺陷引起的炎癥和早期死亡。Cai等[33]在ICH模型大鼠腦內檢測到壞死性標志物p-MLKL，并發現交叉電針(cross electro-nape acupuncture，CENA)可通過阻斷RIPK1和RIPK3之間的相互作用，進而抑制RIPK1介導的壞死性凋亡。另外體內實驗結果顯示，CENA可降低ICH模型大鼠炎癥細胞因子TNF-α、IL-6和IL-8的表達。

2.2.2 壞死性凋亡與SAH RIPK1/RIPK3介導的壞死性凋亡通路也參與了SAH后的病理生理改變。Yuan等[34]采用自體輸血模型，發現在SAH所致大鼠腦損傷中RIP3表達增強，24 h達高峰?；蚧蛩幬镆种芌IP3或TNF-α可減輕SAH所致的腦損傷，而過表達RIP3則加重腦損傷。此外Chen等[35]發現RIPK3選擇性抑制劑GSK‘872降低RIPK3和MLKL的蛋白水平，減少了RIPK3介導的細胞壞死性凋亡和隨后的促炎蛋白HMGB1的胞漿轉位和表達，改善了腦水腫和神經功能缺損。綜上，壞死性凋亡參與了ICH和SAH所致的腦損傷，并且干擾RIPK1、RIPK3和MLKL及其相互作用是減少出血性腦損傷的有效途徑。

2.3 褪黑素通過上調A20的表達抑制壞死性凋亡 褪黑素被報道在腦卒中后具有神經保護作用，無論是缺血性的[36]還是出血性的[37]。Lu等[36]發現褪黑素通過上調腦出血后去泛素化酶A20的表達，特別是小膠質細胞中A20的表達來抑制RIP3介導的壞死性凋亡。這些發現暗示A20可能成為治療腦出血的新的潛在靶點。

3 結論與展望

壞死性凋亡，又稱程序性壞死，是除凋亡之外的一種重要的細胞程序性死亡類型。自壞死性凋亡首次被報道以來，只有不到20年時間，但對其信號分子機制及其與腦卒中疾病相關性的認識有了很大的提高。壞死性凋亡參與了腦卒中所致的腦損傷，RIPK1和RIPK3以及MLKL是壞死性凋亡的重要調節因子，針對壞死性凋亡相關蛋白的抑制治療已被證實在不同動物模型和不同細胞類型中具有神經保護作用。然而目前除rtPA外，很少有藥理藥物在臨床上被證明是有效的，正如許多藥物所顯示的那樣，臨床前研究取得良好的效果，但在臨床實踐中觀察到的效果較差。因此，未來需要更多類似于壞死性凋亡抑制劑或基因修飾等研究來探討壞死性凋亡在腦卒中臨床上的作用。此外，腦卒中疾病病理過程中多種死亡機制同時發生[38-39]，并且與炎癥機制[30]有著密不可分的聯系，一些研究者通過聯合使用針對不同損傷機制的抑制劑也取得了比單一抑制劑更好的治療效果[30,40]，因此未來尋找這些信號通路的共同效應因子顯得十分必要。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。