磷對鹽堿脅迫下棉花離子平衡及相關調控基因的影響

孫嘉璘，侯振安

（石河子大學農學院農業資源與環境系，新疆石河子 832003）

鹽脅迫是生態環境和人類健康的主要威脅，會降低作物產量并影響農業用地[1-2]。鹽脅迫會使植物產生鹽離子毒害和養分失衡，導致生理代謝紊亂、生長受抑、產量和質量降低，嚴重時甚至致死[3]。堿脅迫比鹽脅迫對植物的影響更為嚴重，這是因為根際的pH過高，直接導致Fe2+、Ca2+、Mg2+和H2PO4-沉淀，離子的吸收受到抑制、平衡受到破壞，干擾植物的各項生理代謝活動，致使鹽分對植物的傷害作用增強[4-6]。鹽脅迫和堿脅迫通常相伴而生，植物可通過各種生理及分子機制來適應鹽堿脅迫環境，包括滲透調節、鹽分外排、離子區隔化、活性氧清除、轉錄調控、信號轉導等[7]。雖然不同作物適應鹽堿環境的方式和機理有所不同，但通過離子吸收和區域化維持植物細胞內的離子平衡(離子穩態)是提高植物耐鹽性的關鍵機制之一[8-9]。植物抗鹽堿生理實質上就是礦質營養問題，應該從礦質營養角度去研究植物對不同離子的吸收、分配和調控機理[10]。因此，促進鹽堿脅迫下植物對營養離子的吸收是提高植物耐鹽堿性的關鍵[11]。

新疆是我國主要的商品棉生產基地，也是全國最大的鹽漬土區，鹽漬化耕地占灌區耕地總面積的37.72%[12]，在鹽堿侵害下，土壤結構受到破壞，腐殖質淋失，通氣、透水不良，嚴重影響作物生長。棉花屬于中等耐鹽作物，其鹽分閾值為7.7 dS/m (土壤飽和電導率)，具有較高的耐鹽性，但其產量仍然會受到鹽分脅迫的不利影響[13]。資料顯示，新疆棉花因受土壤鹽堿脅迫的影響每年減產6.5×106kg，約占棉花總產量的9%[14]。因此，提高棉花耐鹽堿性對于促進新疆棉花產業可持續發展具有重要意義。

磷參與植物許多代謝過程，包括能量轉移、信號傳導、有機物合成、光合作用和呼吸作用[15]。在農業生產中，磷被認為是僅次于氮的最缺乏必需營養元素。研究發現，適量磷素可促進鹽脅迫下植物深層根系生長[16]。提高磷素水平能夠促進鹽脅迫下番茄、黃瓜、小麥、黑麥草等的生長，降低膜傷害，促進礦質元素和水分的吸收，維持鉀離子穩定，減少鈉離子積累，從而提高耐鹽性[17-18]。較高pH的堿土會導致磷素有效性降低[19]，影響作物生長，合理地補充磷素，勢必會緩解脅迫，進而提高作物的耐鹽堿性。磷素介導植物耐鹽堿性的機制較為復雜，目前還不完全清楚，且該領域還缺乏分子和基因水平的機制研究[20]。

因此，揭示磷素介導棉花耐鹽堿機制對于通過合理施肥提高棉花耐鹽堿性，促進新疆棉花產業可持續發展具有重要科學意義。本研究采用盆栽試驗，研究噴施磷素對鹽(NaCl)和堿(NaHCO3+Na2CO3)脅迫下棉花生長和離子組響應特征的影響，以及Na+轉運相關基因表達的變化，探討磷介導棉花耐鹽堿性的機制，為合理施肥提高棉花耐鹽堿性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種‘魯棉研24號’。供試土壤來源于石河子大學農學院試驗站農田，取土深度為0—30 cm。土壤類型為灌耕灰漠土，質地為壤土，有機質、堿解氮、有效磷和速效鉀分別是14.9 g/kg、41.2 mg/kg、10.6 mg/kg和 248 mg/kg。

試驗采用向供試土壤分別添加中性鹽(NaCl)和堿性鹽(NaHCO3+Na2CO3)，設置鹽脅迫和堿脅迫兩種土壤鹽堿脅迫類型，并以未添加鹽堿的供試土壤(原土)為對照。其中鹽脅迫(NaCl)處理土壤NaCl添加量為0.3% (占干土重)；堿脅迫(NaHCO3+Na2CO3)處理為NaHCO3+Na2CO3(摩爾比1∶1)添加量為0.4% (占干土重)。試驗開始前，將供試土壤自然風干、碾碎后過2 mm篩，按照試驗設計將不同鹽配成溶液噴灑在土壤表面(對照處理噴灑等量去離子水)，邊噴邊攪拌，混合均勻后保濕堆置1個月，確保土壤鹽分達到平衡。處理后的土壤自然風干，碾碎過2 mm篩后備用。不同鹽堿處理土壤的鹽堿類型和鹽堿度見表1。

表1 不同處理土壤鹽堿情況Table 1 Saline and alkaline of soil under different treatments

1.2 試驗設計

試驗于2019—2020年在石河子大學農學院試驗站玻璃溫室進行。試驗使用直徑15 cm、高25 cm的塑料盆，按照1.25 g/cm3土壤容重每盆裝風干土4.0 kg。試驗采用盆栽試驗，設置鹽脅迫和堿脅迫，在2種脅迫下，分別設置3個磷酸二氫鉀噴施濃度，分別為0 (P0)、0.5% (P0.5)、0.75% (P0.75)，同時，設置無鹽堿脅迫且不噴施磷素對照。共計7個處理，每個處理重復6次，共42盆。試驗中，供試磷源為KH2PO4，為避免噴施KH2PO4中K元素的影響，添加K2SO4使各處理K元素相同，P0處理噴施等量清水。棉花于7月23日播種，每盆播種15粒。出苗后，每盆施入尿素(N46%) 3.2 g和51%的硫酸鉀(K2O，51%) 1.6 g。試驗期間定期稱重補水，保持土壤含水量在田間持水量的60%～80%。待幼苗長至“兩葉一心”時定苗，每盆保留長勢均勻一致的棉苗3株。三葉期(8月9日)進行第一次噴施處理，之后每隔7天噴施一次，共噴施5次。棉花出苗60天后(苗期)，進行樣品采集。

1.3 樣品采集與分析

每個處理隨機采集6株棉花最新完全展開葉(約12片)，其中6片分裝3支離心管，其余葉片裝入自封袋，做好標記，置于裝有冰袋的保溫箱中，立即帶回實驗室，前者經液氮速凍后，置于-80℃超低溫冰箱中貯存，用于K/Na轉運相關基因表達量的測定；后者將葉片用錫箔紙包裹，立即放入液氮速凍，用于質膜透性和丙二醛含量的測定。剩余棉花幼苗整株采樣，分成根、莖、葉3部分，蒸餾水洗凈后晾干，用于棉花生物量和各器官離子含量的測定。

土壤電導率及pH采用pH/電導率雙參數測量儀測定(MP522型，上海三信儀表廠)。生物量采用烘干法測定。采用Win RHIZO根系分析系統分析根系長度、根表面積等形態指標。丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法[21]測定。細胞膜透性采用電導法[22]測定。N含量采用凱氏法測定[23]，P、K、Ca、Mg、Na、Fe、Zn、S、Mn、Mo、Si、Cu、B 含量采用 ICP 等離子體發射光譜法測定。K/Na轉運相關基因(GhSOS1、GhAKT1、GhVP1、GhNHX1)相對表達量采用比較CT法[24](△△CT)進行相對定量分析。使用試劑盒提取RNA，Thermo試劑盒反轉錄取得cDNA，以GAPDH作為內參基因，根據棉花各基因的非保守區設計特異性引物(表2)，進行熒光定量PCR擴增，檢測每份樣品目的基因和內參基因的Ct值(循環閾值)，每份樣品3次重復，并且進行3次獨立的試驗。

表2 目的基因定量分析所用引物信息Table 2 Primers used for gene detection and qRT-PCR analysis

1.4 數據處理方法

為便于比較在不同鹽堿脅迫類型下噴施磷素后棉花生長和離子含量的變化差異，棉花生物量(干重)、根長、根表面積和離子含量均采用相對指標表示，即鹽、堿脅迫下的指標與對照之比。具體計算公式如下：

式中， BT為鹽堿脅迫和施磷處理棉花生物量(g)；B0為對照處理棉花生物量(g)。

式中， RT為鹽堿脅迫和施磷處理棉花根長(cm)或根表面積(cm2)；R0為對照處理棉花根長(cm)或根表面積(cm2)。

式中，離子相對含量為棉花不同器官(根、莖、葉)離子相對含量；CT為鹽堿脅迫和施磷處理棉花各器官離子含量；C0為對照處理棉花各器官離子含量。

數據平均值和標準差計算采用Excel 2016軟件，統計分析使用SPSS 17.0軟件。數據的統計分析采用施磷和鹽堿類型兩因素方差分析(Two-way ANOVA)。當方差分析為P＜0.05為達到顯著性水平，不同施磷處理間的差異性比較采用Duncan法，不同鹽堿類型間的差異采用獨立樣本T檢驗法。聚類分析采用R語言分析軟件。

2 結果與分析

2.1 相對生物量和根冠比

生長狀況是反映棉花受鹽堿傷害的最直觀表現。鹽脅迫下，噴施磷素對棉花相對生物量的影響見表3。P0.5(0.5%)、P0.75(0.75%)處理棉花整株相對生物量顯著高于不施磷處理(P0)。與P0相比，P0.5和P0.75棉花整株相對生物量分別增加23.8%和34.7%。堿脅迫下，與不噴施磷素P0相比，噴施磷素P0.5、P0.75處理棉花整株相對生物量分別增加17.3%和21.1%，棉花根系相對生物量分別增加71.1%和91.7%。鹽脅迫下，棉花根冠比隨著磷施用水平的上升而降低，但堿脅迫下，變化趨勢與鹽脅迫相反。

表3 磷對鹽和堿脅迫下棉花相對生物量和根冠比的影響Table 3 Effects of phosphorus on relative biomass and root-shoot ratio of cotton under salt and alkali stresses

2.2 根系形態

根系是作物吸收養分的主要器官，根長和根表面積在棉花吸收養分方面起著舉足輕重的作用。圖1顯示，鹽脅迫下，噴施磷(P0.5、P0.75)顯著增加棉花根長，P0.5、P0.75處理棉花相對根長較P0處理分別提高55.5%、74.6%。堿脅迫下，噴施磷(P0.5、P0.75)對棉花相對根長無顯著影響。鹽脅迫下，P0.5、P0.75處理相對根表面積較P0處理分別增加33.2%和49.4%，但P0.5和P0.75處理間差異不顯著。堿脅迫下，P0.5、P0.75處理的棉花相對根表面積分別較P0處理顯著增加了26.7%和49.7%，P0.75顯著高于P0.5(P＜0.05)。

圖1 鹽堿脅迫下噴施不同濃度磷素棉花相對根長和相對根表面積Fig. 1 Relative root length and relative root surface area of cotton as affected by P spray concentrations under salt and alkali stresses

2.3 磷對鹽堿脅迫下棉花逆境生理指標的影響

相對質膜透性是觀測細胞膜損傷程度最直觀的指標。圖2顯示，鹽脅迫下，P0.5、P0.75處理均顯著降低了棉花葉片質膜相對透性，但P0.5和P0.75處理之間無顯著差異；堿脅迫下，P0.75處理顯著降低了棉花葉片質膜透性，其質膜透性顯著低于P0和P0.5處理?？傮w來看，鹽脅迫下噴施磷降低棉花葉片質膜相對透性的作用大于堿脅迫。

圖2 鹽堿脅迫下噴施不同濃度磷素棉花葉片的相對質膜透性和丙二醛含量Fig. 2 Relative plasma membrane permeability and malondialdehyde content of cotton leaves as affected by P spray concentrations under salt and alkali stresses

從圖2看出，鹽、堿脅迫下，P0.5、P0.75處理顯著降低棉花葉片丙二醛(MDA)含量，且P0.5和P0.75處理之間沒有顯著差異(P＜0.05)?？傮w來看，噴施磷降低棉花葉片MDA含量的作用在鹽脅迫和堿脅迫下沒有顯著差異。

2.4 磷對鹽和堿脅迫下棉花離子含量的影響

鹽和堿脅迫下，棉花離子組(14種)變化的層次聚類分析見圖3。根據葉片中14個元素離子含量的變化聚成兩類：第一類包括Mg、N、Ca、Na、Fe，總體上表現為鹽脅迫棉花葉片含量顯著高于堿脅迫；第二類包括B、K、S、Mo、Mn、P、Cu、Zn、Si，鹽脅迫下的葉片含量顯著低于堿脅迫，且噴施磷后，綜合來看，鹽和堿脅迫下，噴施磷均能顯著降低棉花葉片中Na 含量，增加P、Cu、Zn、Si 含量，且鹽脅迫下Na含量降低幅度及Cu、Si 含量增加幅度大于堿脅迫。莖稈中，第一類元素中的Ca、Mo含量隨磷噴施濃度的提高，鹽脅迫下總體呈增加趨勢，但堿脅迫下變化不顯著；第二類中的P、K、Mg、Cu、S、Mn、Na、B、N、Zn、Fe、Si含量，鹽脅迫下隨磷噴施濃度的增加顯著降低，而堿脅迫下則明顯增加(圖3b)。根系中，鹽脅迫下噴施磷Si含量顯著降低，而堿脅迫下Si含量下降不顯著；鹽脅迫下N、Mn、Na、S含量顯著增加，而堿脅迫下其含量顯著降低；Ca、Zn、K、P、Fe含量在鹽和堿脅迫下均顯著增加，而Mg、Cu、B、Mo無顯著變化。

圖3 鹽和堿脅迫下不同施磷處理棉花葉、莖、根離子組變化層次聚類分析Fig. 3 Hierarchical cluster analysis of changes in ion groups of cotton leaves, stem and root as affected by different phosphorus application concentrations under salt and alkali stresses

由圖4可知，鹽和堿脅迫下，施磷顯著降低了棉花各器官中Na的含量，且顯著促進K、Ca、Mg在各器官中的積累。鹽和堿脅迫下，P0.75處理的葉、莖、根中K/Na值顯著高于P0.5處理，P0.5處理又顯著高于P0處理；葉、莖、根中的Ca/Na值葉以P0.75處理最高，其次是P0.5處理，但是鹽脅迫和堿脅迫下處理間的差異顯著性不同，在鹽脅迫下噴施磷提高Ca/Na值的效果大于堿脅迫。

圖4 鹽堿脅迫下噴施不同濃度磷素對棉花各器官K/Na、Ca/Na、Mg/Na的影響Fig. 4 Effects of spraying different P concentrations on K/Na, Ca/Na, and Mg/Na of cotton organs under salt and alkali stresses

鹽、堿脅迫下，噴施磷均顯著提高了葉片、莖和根中的Mg/Na值，但P0.5和P0.75處理的效果在不同器官中互有高低，鹽脅迫下全株Mg/Na值的平均值顯著高于堿脅迫。

2.5 噴施磷素對鹽和堿脅迫下棉花基因表達的影響

圖5a顯示，噴施磷素顯著提高棉花葉片中GhSOS1基因(質膜Na+/H+逆向轉運蛋白基因)的表達量，但鹽脅迫下P0.75處理顯著高于P0.5處理，而堿脅迫下P0.75與P0.5處理之間無顯著差異，在鹽脅迫下噴施磷上調該基因表達量的平均效果顯著高于堿脅迫。鹽、堿脅迫下，噴施磷素均顯著提高棉花葉片中GhNHX1基因(Na+區隔化基因)的相對表達量，且P0.75處理顯著高于P0.5處理；但是噴施磷在鹽脅迫和堿脅迫條件下上調該基因表達的效果無顯著差異。

圖5 磷對鹽和堿脅迫下棉花GhSOS1、GhNHX1、GhAKT1、GhVP1基因表達量的影響Fig. 5 Effects of phosphorus on expression of GhSOS1, GhNHX1, GhAKT1, and GhVP1 genes in cotton under salt and alkali stresses

GhAKT1基因是K+通道基因。鹽和堿脅迫下，噴施磷均能顯著提高棉花的GhAKT1基因相對表達量，P0.5、 P0.75處理間差異均不顯著。噴施磷在鹽脅迫下上調GhAKT1表達量的效果顯著低于堿脅迫(圖5c)。

GhVP1基因是液泡膜質子轉運焦磷酸酶基因。噴施磷可顯著提高棉花葉片中GhVP1基因的相對表達量，鹽脅迫下，P0.75處理效果顯著高于P0.5處理，堿脅迫下，P0.75和P0.5處理之間無顯著差異。噴施磷提高該基因表達量的平均效果鹽脅迫下顯著高于堿脅迫 (圖5d)。

3 討論

鹽脅迫會在植物中引起生理缺水、離子毒害、氧化傷害等脅迫傷害，從而影響植物生長[25]。磷(P)不僅是植物生長所必需的礦質元素，而且也具有提高作物耐鹽性的作用[26]。然而目前關于磷對鹽脅迫、堿脅迫下植物耐鹽機制差異的影響研究較少。本研究結果表明，鹽脅迫下，噴施磷素可提高棉花各器官相對生物量，其中0.75% (P0.75)處理的促進作用最為顯著。堿脅迫下，噴施磷素能顯著增加棉花各器官生物量，但噴施不同濃度磷肥對棉花影響不顯著。噴施磷對堿脅迫下棉花相對生物量的影響顯著大于鹽脅迫。分析施磷對鹽脅迫下棉花根系形態變化的影響發現，施磷能顯著增加棉花相對根長和相對根表面積，且高磷濃度(P0.75)各指標均顯著高于低磷濃度(P0.5)。張少民等[27]也發現鹽脅迫下，噴施磷素能顯著促進棉花根系生長。根系相對生物量的增加，可能是根系中的高親和鉀轉運蛋白(HKT)可以最大限度的截留蒸騰流中的Na+并隔離在根系中，促進K+釋放，從而降低地上部分的Na+含量和增加K+含量[28]，最終提高抗鹽性。堿脅迫下，噴施不同濃度磷肥棉花相對根長與對照無顯著差異，進一步說明施磷對棉花根系的影響較弱。同時鹽脅迫下，噴施不同濃度磷肥對棉花相對根表面積的影響不顯著；但堿脅迫下，高磷濃度對棉花相對根表面積的影響比低磷濃度更明顯。本研究發現，鹽脅迫下，噴施磷可以顯著降低棉花相對質膜透性，但其濃度對棉花相對質膜透性影響不顯著。堿脅迫下，高濃度磷處理(P0.75)降低棉花相對質膜透性效果顯著，表明噴施高濃度磷對棉花堿脅迫的緩解效果顯著優于低濃度磷。2種脅迫下，施磷均能顯著降低棉花丙二醛含量，但不同噴施濃度對棉花的影響不顯著。

高鹽環境可打破植物細胞中已形成的各種離子平衡狀態[29]。孫景波等[30]研究表明，Na+的積累不僅抑制作物對大量元素(N、P、K、Ca、Mg 和 S)的攝取，而且還限制作物對微量元素(Fe、Cu、Zn、Mn、B 等)的吸收，限制了這些離子的生理功能。本試驗對兩種不同脅迫下棉花體內離子組的變化進行研究，共篩選出14個相關離子。研究發現，噴施磷素能顯著降低鹽、堿脅迫下棉花植株體內Na含量，增加棉花K含量，其中鹽脅迫下Na含量的降幅高于堿脅迫。張永亮等[31]研究也表明，施磷能夠降低植株體內Na含量。堿脅迫下，施磷顯著降低棉花葉片Mn、Na、N含量，其他元素含量均呈增加趨勢。說明施磷能促進棉花對元素的吸收，各器官中磷含量隨著施磷量增加呈顯著增加趨勢。有研究表明，磷素有促進鹽脅迫下溝葉結縷草(Zoysia matrella)Na+分泌，限制Na+往地上運輸，降低葉片中Na+含量的作用，并隨磷素水平的增加，葉片和根系中K+含量均呈上升趨勢，葉片K/Na隨著磷素濃度的增加而增加[32]。但也有研究認為，鹽脅迫下增加磷素使大豆(Glycine max)體內Na+的含量增加，致使耐鹽性下降[33]。本研究表明，隨著磷濃度增加，各器官中K/Na、Ca/Na、Mg/Na值增加，說明不同鹽堿脅迫下，適量噴施磷可以促進K+、Ca2+和Mg2+的選擇運輸，從而改善各器官的離子平衡。這一方面是磷能促進根系的形成和生長，提高植物適應外界環境條件的能力。很可能施磷是增強棉花耐鹽性的主要原因之一。

有研究表明鹽脅迫下，棉花GhSOS1基因過量表達能顯著促進Na+外排，提高棉花耐鹽性[34]。本研究對不同鹽堿脅迫下施磷對棉花體內離子變化的原因進行進一步探討。研究發現，鹽脅迫下棉花GhSOS1基因表達量隨磷濃度增加顯著提高，雖然堿脅迫下施磷也能促進GhSOS1基因表達，但不同噴施濃度處理間的差異并不顯著。說明噴施磷能顯著提高鹽堿脅迫下棉花的GhSOS1基因表達量，但對鹽脅迫下的影響大于堿脅迫。在液泡中，Na+的區隔化主要是能量的驅動下由液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白NHX來完成的[35-36]。有研究表明， NHX過量表達可以提高棉花的耐鹽性[37-38]。本研究發現，鹽、堿脅迫下，GhNHX1基因表達量均隨磷濃度增加顯著提高。說明在適量的磷素噴施濃度范圍內，施磷能顯著提高棉花的GhNHX1基因表達量。鹽、堿脅迫下植物維持體內 Na/K 穩態是抵御脅迫的主要方式之一，AKT1基因是 K 離子通過根系向地上部運輸的主要通道基因[39]。在本研究中，施磷能顯著提高鹽、堿脅迫下GhAKT1的基因表達量，但P0.5和P0.75處理間差異均不顯著。這表明鹽脅迫和堿脅迫下，噴施磷均會促進棉花體內K+轉運，但噴施磷濃度間差異不顯著。VP是液泡膜上的一種重要質子泵，在調控細胞膨脹、H+電化學梯度、無機離子、有機酸和糖類等次級主動運輸過程中發揮著重要作用[40]。有研究表明液泡膜跨膜電化學勢增強，液泡中無機離子Na+和K+濃度增加耐鹽性提高[41]。本研究發現，噴施磷能提高鹽、堿脅迫下GhVP1的基因表達量。但對鹽脅迫下的影響大于堿脅迫。通過對Na+轉運機制進行研究發現，鹽、堿脅迫下棉花耐鹽的方式均包含Na+區隔化與Na+外排，但磷素對不同鹽堿脅迫棉花體內相關基因表達量影響不同，說明磷素對鹽脅迫和堿脅迫下棉花的耐鹽機制的影響并不一致，需要進一步開展研究。本研究中，噴施磷素對鹽和堿脅迫下棉花離子含量和基因表達的影響見圖6，其結果可能有助于闡明磷對棉花耐鹽性的影響機制。

4 結論

鹽、堿脅迫下，葉面噴施磷能促進P、Cu、Si在棉花體內的積累，顯著降低Na、N含量。鹽、堿脅迫下噴施磷素棉花葉片的離子變化趨勢相似，但噴施磷素對鹽脅迫下棉花根系發育的促進作用大于堿脅迫。噴施磷素均能提高鹽和堿脅迫下棉花GhSOS1、GhNHX1、GhAKT1、GhVP1基因表達量，并且鹽脅迫下GhSOS1和GhVP1上調幅度較大，調控K的吸收和Na的轉運能力較強，因而降低棉花葉片質膜相對透性和丙二醛含量，減少鹽脅迫和堿脅迫對葉片細胞膜結構的破壞，進而促進棉花的生長。噴施磷素促進了鹽堿脅迫下棉花對K的吸收，降低了Na的積累，從而維持了體內K/Na的離子穩態，提高了耐鹽堿性。