內蒙古自治區馬鈴薯常見品種差異性分析

孫宇燕，李樹生，郝文勝，梁東超，劉 羽，昊 翔，徐 暢，張龍梅，侯佳秀，馬麗榮

(內蒙古自治區農牧業技術推廣中心，內蒙古 呼和浩特 010000)

馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)原產于南美洲，因高產、適應性廣、營養成分全和產業鏈長而受到全世界的高度重視[1-2]。中國是世界第一大馬鈴薯生產國,總栽培面積約600 萬hm2, 年產量在9000 萬t,在我國是僅次于水稻、玉米、小麥的重要糧食作物[3]。目前，我國主栽馬鈴薯品種為四倍體植株，在馬鈴薯育種上,大多數采用大田雜交的方法,選育出了一批優良性狀的品種[4-5]。但由于馬鈴薯的材料比較單一, 性狀優良的親本匱乏，以及雜交技術的影響，長久以來大大降低了育種工作效率[6-7]。

隨著我國生物技術的發展，分子標記輔助育種逐步成為了我國農作物育種的一個重要方向[8-9]。

簡單序列重復(Simple Sequence Repeat,SSR)是近年來廣受學者歡迎的新型分子標記技術[10]。 相比其他常用的標記技術,SSR 標記具有穩定性好、 準確性高等優點, 被廣泛運用于農作物品種鑒定及指紋圖譜構建中[11]。 其余是以目的基因片段為模板，進行PCR 擴增。 這種方法已在玉米、小麥、甘薯等多種農作物體內研究應用[12-14]。

陳其福等[15]以14 個菜豆品種為材料,采用SSR分子標記技術,對其進行遺傳多樣性研究,并建立了特異性指紋圖譜。 溫賀等[16]采用已報道的66 對SSR 引物對不同來源的42 份紫蘇材料進行擴增，對紫蘇遺傳多樣性及種群劃分進行研究,充分證明了SSR 分子標記在作物輔助育種，以及親緣關系鑒定等方面的重要作用。

本文利用SSR 分子標記技術對內蒙古常見的36個馬鈴薯品種進行基因組掃描,對遺傳差異性進行分析，旨在為馬鈴薯分子輔助育種、圖譜構建、品種鑒定等方面提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以布爾班克等共計36 份品種為試驗材料（見表1）。

表1 36 份試驗材料

1.2 試驗方法

1.2.1 馬鈴薯基因組DNA 提取及檢測。選取馬鈴薯新鮮嫩葉，采用TIANGEN 新型植物基因組DNA 提取試劑盒提取材料的基因組DNA 并用1%瓊脂糖凝膠電泳對DNA 質量進行檢測，挑選條帶清晰完整、亮度好的DNA 于-20℃保存備用。

1.2.2 SSR-PCR 反應。STM1053、STM0030、STM1049、STM1104、STM1106、STM2022、STM2013、STM0037、STM0019、STM3012、STM3023、STM1053、STM1053 共13 對SSR 引物序列來自Ghislain M （Chislain M et al,2014）等，由華大基因公司合成。

PCR 反應體系采用于卓等[17]的體系略有改動，具體為2×Taq PCR Master Mix 5 μL，50 ng/μL 上、下游 引 物 各1 μL，100 ng/μL 模 板DNA 1 μL，ddH2O 12 μL，共計20 μL。

PCR 運行程序設置為：

1.2.3 電泳檢測。（1）電泳過程：將凝固好的變性膠固定到電泳儀上，上下兩極倒入1.0×TBE 緩沖液（沒過膠面），利用洗耳球吹除拔梳子所留殘膠，PCR 擴增產物加入PAGE 變性劑5 μL, 在PCR 儀中95 ℃變性5 min 后，向點樣孔中點入6 μL，70 W 恒功率電泳1～1.5 h。 （2）顯影步驟：

1.2.4 SSR 數據統計分析。根據電泳結果中條帶的有無，采用“0/1”系統對擴增后清晰易讀的條帶進行記錄，在相同的遷移位置上有帶記為“1”，無帶記為“0”，按基因片段由大到小的順序記錄，構建“0，1”矩陣。利用qtree 1.6.1 分析軟件。利用MEGA X 軟件，按照距離法對36 個品種建立進化樹。

2 結果與分析

2.1 DNA 檢測結果

對提取的群體DNA 進行1%瓊脂糖電泳檢測（圖1），由圖可見，提取的DNA 樣品條帶清晰完整，無降解拖尾現象，未見RNA 和蛋白質污染，DNA 純度高，符合后續試驗要求，將DNA 稀釋到100 ng/μL，于-20 ℃保存。

2.2 SSR 多態性引物篩選結果

經篩選得到可用于下一步分析的引物11 對，具體見表2。

2.3 SSR 擴增結果分析

試驗采用11 對SSR 標記引物（表2）對36 份馬鈴薯材料進行PCR 擴增，結果如表3 所示。

表2 SSR 引物序列

由表3 可知，11 對引物組合共檢測到70 個等位位點，其中66 個為多態性位點，多態性百分率94.2%；DNA 擴增產物片段的大小多在300～500 bp之間，表明供試材料的SSR 多態性豐富。 每對引物擴增出的等位位點數為4～9 個，平均每對引物擴增出的等位位點數為6.4 個。 其中（圖2），引物STM2013 和STM3023 多態性條帶最多，為9 條；引物STM1053 多態性條帶最少，僅有2 條。

表3 36 份材料部分SSR 引物擴增結果

表4 構建的馬鈴薯基因指紋圖譜

2．4 聚類分析結果

2.4.1 聚類分析。根據SSR 引物擴增結果，擴增產物以0、1統計建立數據庫，利用qtree 1.6.1 分析軟件，按照最大似然法進行聚類分析，計算不同馬鈴薯品種（系）間的遺傳距離。

聚類分析結果(圖3)表明，在相似系數18 附近，36 份馬鈴薯品種可分為4 類。

Ⅰ：1（布爾班克）；

Ⅱ：27（V7）；

Ⅲ：14、9、23、34、26、22、21、17、10、11；

Ⅳ：20、35、15、8、19、16、13、24、25、3、4、6、28、18、29、12、2、33、31、30、36、7、32、5。

在以上的分類中，5 號（希森3 號）和32 號（X）聚為一類，4 號（E44 夏坡地）和6 號（夏坡地456）聚為一類，證明用SSR 分子標記能夠正確地按照相似性將馬鈴薯進行分類，為馬鈴薯雜交育種中親本的選擇和雜種優勢的利用提供理論依據。

2.4.2 NJ 進化樹。根據SSR 引物擴增結果，擴增產物以0、1 統計建立數據庫，利用MEGA－X 軟件，按照距離法對36 個品種建立NJ 進化樹。

由NJ 進化樹（圖4）可以看出，8、35 的親緣性較近，9、23 的親本親緣性較近，同時與20、14、9、23 的親緣相近，36 份馬鈴薯按照親本的遠緣性分為4 類。

Ⅰ：23、9、14、20、35、8；

Ⅱ：17、10、11、15、22、34；

Ⅲ：21、1、27、30、36、32、5、7；

Ⅳ：26、28、29、18、19、16、13、24、12、2、31、33、25、3、4、6。

3 討論

中國不是馬鈴薯原產地，馬鈴薯資源從世界不同地區引進，經過人工選育后形成現有的品種及品系，因此，在國內不同地方收集的資源不能按地域性聚集在一起。

由于遺傳資源狹窄，供試36 份材料聚類分析結果相似性較高，然而11 對SSR 引物的擴增產物所展示出的多態性與決定某個表型的基因是否有關聯還有待研究，通過ML 分析聚成一類的品種，其表型關聯還需深入研究，NL 分析所產生的進化樹，其進化機制也需完善。

4 結論

試驗通過11 對引物，擴增內蒙古自治區36 個品種，結果表明，內蒙古主栽品種間存在遺傳差異性，但是通過遺傳距離進行聚類分析，36 個品種聚合成4類，品種間遺傳距離較近；NJ 進化樹分析也表明，品種的同源性較大，品種分離進化較小。

本試驗僅選取內蒙古部分主栽品種，有局限性，后續會選取其他地域馬鈴薯資源進行驗證，以期為選擇遺傳差異大的材料，拓寬馬鈴薯后代遺傳背景，提高后代雜種優勢，培育優良的新品種發揮重要作用，為馬鈴薯的育種親本和雜種優勢提供理論依據。