抗生素對油菜種子及幼苗生物效應研究

范 碩, 張小娜, 侯艷紅, 霍瑞朋, 王子銘, 殷凱玥, 張雪雪, 趙瑩瑩, 王巨媛

(1.聊城大學農學與農業工程學院, 山東 聊城 252000;2.聊城大學地理與環境學院, 山東 聊城 252000)

抗生素是微生物次級代謝產生的具有殺滅病原微生物作用的化學物質，在感染治療與預防中有顯著效果[1]。自20世紀弗萊明發現青霉素以來，抗生素對人類生命健康和社會發展做出卓越的貢獻。人們過度依賴抗生素防治病蟲害，且缺乏對抗生素合理使用的認識，導致抗生素使用量大大增加[2]。我國每年使用抗生素約16.2萬t，約占世界用量的一半，其中52%為獸用[3]，進入動物體內的抗生素約有一半以上通過排泄物方式，以原藥或初級代謝產物的形式進入到環境中，大量抗生素殘留污染環境影響作物正常生長[4-6]。有報道上海黃浦江上游通過施用糞肥進入到土壤中的磺胺類抗生素濃度達到5.85～33.37 mg/kg[2]。在自然界，抗生素可通過多種途徑(如水、土、動植物等)進行傳遞，直接或間接地對環境造成不利影響[7-9]，且殘留在環境中的抗生素經過循環累積進入食物鏈，對食品安全埋下重大隱患，包括家禽[10]、魚類[11]、牛奶[12]、蝦類[13]食品中均已檢測到殘留。

油菜栽培遍及全國，種植面積占中國油料作物的40%，菜籽油占我國國產食用植物油總產的60%左右[12]。油菜的花粉功能強大，含多種營養元素，具有抑制腫瘤、調節血脂等多種作用。同時油菜也具有很高的觀賞價值，近年來油菜觀光旅行已成為多地區新開發的特色旅游項目。

自然界中人類處于食物鏈頂端，因此，各方面的食品安全問題一直都是關注的焦點。李亞寧等[15]研究磺胺抗生素對油菜幼苗氧化酶的影響，表明ST及SMZ對油菜葉綠素含量及SOD、POD活性均被顯著誘導。但抗生素對油菜花種子的影響未見報道，本文以油菜花種子為試材，開展SM 2、TC、NX 三種抗生素對油菜花種子及幼苗生長影響的研究，分析不同抗生素對油菜花的生態毒性效應，為抗生素環境風險評價及規范使用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試油菜種子購于江蘇省連云港市種子站；SM 2、TC、NX三種抗生素純度為99%，購于上海麥克林公司。

1.2 試驗儀器

根系掃描系統(Win RH 220 STO 1600 Systems)——加拿大

生物熒光倒置顯微鏡(BX 51)——日本奧林巴斯株式會社

1.3 試驗方法

試驗共設6個處理，3種抗生素濃度均為ck(無抗生素添加)、12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L。各處理重復3次。采用培養皿發芽法，挑選飽滿油菜種子，以3%的過氧化氫溶液浸泡消毒20 min，用去離子水反復沖洗數次，以50粒為一組置于恒溫箱內進行催芽，催芽溫度(25±1)℃，記錄發芽率、發芽勢。

發芽率(%)=(發芽種子粒數/供試種子粒數)×100%

發芽勢(%)=(發芽天數為3 d時發芽的粒數/供試種子粒數)×100%

發芽結束后，每處理選出5個具有代表性的油菜種子，使用根系掃描系統測定根總長、根表面積、根分叉數、根體積及油菜根系形態掃描圖。

根長抑制率(%)=[(對照根長-處理根長)/對照根長]×100%

油菜根損傷鑒定方法：分別取各處理的油菜根部組織置于20 μmol/L 二乙酸熒光素(FDA)中，37 ℃條件下浸染20 min后，用0.05 mmol/L PBS(pH=7.0)清洗3～5次后在生物熒光倒置顯微鏡下拍照[10]。

1.4 數據處理與分析

方差分析采用SPSS 19軟件進行，運用ANOVA方法分析處理間差異顯著性，采用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同處理對油菜種子發芽率和發芽勢的影響

種子發芽率反映種子生命力和生活力的強弱[16-17]。植物種子的萌發是植物生長發育過程中的關鍵階段，油菜種子萌發情況會直接影響油菜植株的生長、產量及觀賞價值。由表1所示，SM 2表現為低濃度促進油菜種子發芽，12.5～50 mg/L時種子發芽率與對照相比達到顯著水平，在50 mg/L時發芽率達到最高，濃度在100 mg/L、200 mg/L時發芽率與ck差異不顯著。發芽勢在25 mg/L時最低，在200 mg/L時最高。TC濃度為12.5 mg/L時發芽率達到最高；25～200 mg/L時抑制油菜種子發芽，200 mg/L時抑制作用最強，發芽率最低，除12.5 mg/L處理外其他處理與ck相比均達到顯著水平，發芽勢在12.5 mg/L時最高，200 mg/L時最低。NX各處理對油菜種子發芽均表現抑制作用，除12.5 mg/L處理外，其他處理與ck相比均達顯著水平，發芽勢在200 mg/L時最低。

2.2 不同處理對油菜種子根長、根長抑制率的影響

由圖1～圖3所示抗生素對油菜種子根長的影響均表現為抑制，根長抑制率與抗生素濃度之間存在劑量效應關系。TC的濃度變化對油菜種子根伸長的抑制作用最明顯，濃度為12.5 mg/L的TC處理對根長生長已表現出較強的抑制作用，濃度越高抑制作用越強；SM 2的濃度變化對種子根伸長的抑制作用弱于TC處理；油菜種子根長對NX的濃度變化最不敏感，在最高濃度(200 mg/L)根長抑制作用最強。

2.3 不同處理對油菜根表面積、分叉數及根體積的影響

抗生素對油菜根表面積、分叉數、根體積及幼苗形態的影響見圖4～圖7。SM 2濃度為25 mg/L時根表面積、根體積達到最高值；50 mg/L時分叉數最多。隨著SM 2濃度的增大根系生長受到抑制，根體積減小，側根減少。TC濃度越大對根的抑制作用越強，各濃度根表面積、根分叉數、根體積與ck相比整體均呈下降趨勢。NX對根生長整體表現為抑制作用，根分叉數在50 mg/L時最多，在25 mg/L根體積達最大值，但與ck相比差異不顯著，隨濃度增加根體積變小抑制作用變強。

表1 抗生素對油菜種子發芽的影響Table 1 Effect of antibiotics on seed germination of rapeseed

圖1 SM 2對油菜根長、根長抑制率的影響Fig.1 Effect of SM 2 on root length and inhibition rate of rapeseed

圖2 TC對油菜根長、根長抑制率的影響Fig.2 Effect of TC on root length and inhibition rate of rapeseed

圖3 NX對油菜根長、根長抑制率的影響Fig.3 Effect of NX on root length and inhibition rate of rapeseed

圖4 不同抗生素對根表面的影響Fig.4 Effects of antibiotics on root surface area

抗生素與油菜種子發芽及根生長指標相關性見表2，發芽率、根長、根表面積、根體積與抗生素濃度之間呈負相關，TC不同處理與發芽勢相關性最大(R2=0.784 1)；NX處理與根長、根表面積、根體積相關性均較大(R2依次為0.817 5、0.836 4、0.828 5)。僅NX處理的根分叉數與抗生素濃度之間及SM 2與發芽勢間呈正相關，且R2值較低。

2.4 不同處理對油菜根損傷的影響

利用熒光雙醋酸酯(FDA)燃料染色植物細胞，當FDA進入活細胞后能生產綠色熒光物質，在熒光顯微鏡下觀察熒光強度就能夠判定油菜根系細胞活力的強弱。當植物受到外界脅迫時，FDA染色可以作為評價外源物質誘導植物細胞死亡的重要指標之一[18]。

圖7 不同抗生素對油菜幼苗的影響Fig.7 The effect of antibiotics on Brassica campestris seedings

表2 抗生素與油菜種子發芽及根生長的相關性Table 2 Correlation between antibiotics and seed germination and root length of rapeseed

圖5 不同抗生素對根分叉數的影響 Fig.5 Effects of antibiotics on root bifurcation number

圖6 不同抗生素對根體積的影響Fig.6 Effects of antibiotics on root volume

SM 2對油菜幼苗根系損傷情況見圖8(A)，與ck相比，12.5 mg/L處理細胞著色良好亮度高，細胞活力強，故濃度為12.5 mg/L處理對油菜根系細胞活力影響較小，隨著SM 2濃度的增大，油菜根系熒光區域逐漸減少，亮度也隨之減弱，表明油菜根系細胞活力逐漸減弱。TC對油菜幼苗根系損傷的影響見圖8(B)，與ck相比，各處理下的油菜根系細胞均有一定程度的受損，在本試驗中隨著TC濃度增大油菜根系熒光亮度逐漸減弱，油菜根系細胞活力呈減弱趨勢。NX對油菜幼苗根系損傷的影響見圖8(C)，與ck相比，12.5 mg/L、25 mg/L處理下的油菜根系受到的損傷不明顯，隨濃度增大到50 mg/L后即表現出較為明顯的損傷，隨著NX濃度增大，油菜根系熒光亮度相應減弱，細胞活力呈減弱趨勢。

3 討 論

種子萌發期和幼苗期是植物對外界環境因子的敏感期，直接影響植物的生長發育。魏瑞成等[16]研究不同濃度梯度的金霉素對油菜種子發芽的影響，結果表明，不同濃度處理對其發芽率及發芽勢無顯著差異，但株高和根長受到明顯抑制，根長對金霉素生態毒性更為敏感[19]。張樹清等[20]研究表明，隨處理金霉素濃度的提高，大白菜的主根長、單株鮮重均呈先增加后降低的趨勢。鄧世杰等[21]研究金霉素對黃瓜、西葫、冬瓜種子萌發，表明金霉素對黃瓜種子的發芽表現為低濃度促進，高濃度抑制。均與本研究結論大方向一致。

圖8 不同SM 2、TC、NX濃度對油菜根損傷的影響Fig.8 Effects of different SM 2、TC、NX concentrations on root injury in rape

植物根系是吸收環境中水分和養分的主要器官，地下部根系的形態和生長狀況直接影響整株植物的生長發育[22-23]。廖德潤等[24]的研究結果反映出，低濃度抗生素對植株生長具有誘導刺激效應，而高濃度條件下則表現出抑制毒害效應，植株中可溶性蛋白含量以及抗氧化酶活性均受到抑制。本研究結果表明，3種抗生素對油菜根生長有不同影響，低濃度的SM 2對油菜種子發芽及根系發育均有促進作用，隨抗生素濃度的提高對種子萌發的抑制作用不斷增強，TC、NX對油菜根系生長均表現為抑制作用，NX濃度高于25 mg/L時對油菜發芽抑制作用與ck相比達到顯著水平，NX處理下，油菜根系的根長、根表面積隨抗生素濃度的增大逐漸降低，側根數減少。FDA染色法能夠反映細胞活力。在高濃度抗生素脅迫下，油菜根系活力明顯減弱，說明抗生素一旦超過濃度限制范圍就會抑制油菜根系活力，影響根系對養分的吸收，根系固持能力也會不斷減弱。表明當抗生素濃度達到一定閾值，抗生素的毒害作用會不斷表現出來。本研究中，3種抗生素對油菜抑制作用由強到弱排列依次為TC、SM 2、NX?？股貙τ筒说墓夂?、熒光等生理指標的影響還有待進一步探究。

綜上所述，要注意科學合理的使用抗生素，在園林、園藝、大田作物、畜牧業等生產加工中應嚴控抗生素的施用量，并采用合理方法有效去除環境中殘留的抗生素及抗生素代謝物，促進生態環境健康發展。