罌粟籽滅活效果測定方法的建立

尤 佳， 文朝慧， 強曉婷， 朱建寧

(1.蘭州海關技術中心， 蘭州 730010；2.甘肅省藥品監督管理局藥品和醫療器械不良反應監測中心， 蘭州 730070;3.甘肅省藥品監督管理局審評認證中心， 蘭州 730070)

我國對罌粟種植實行嚴格管制，除藥用科研外，一律禁植。國家衛計生函[2013]113號文件[1]規定，罌粟種子不可作為香料和調味品使用。然而在西方很多國家，罌粟籽是傳統調味品，歐美主要用于各種糕點，在印度，罌粟籽制成粉加入飲料中。甘肅農墾集團有限公司是我國藥用罌粟的唯一種植、加工、調撥單位，該公司把滅活罌粟籽的消費群體對準國際市場，近十年來將大批次滅活罌粟籽出口印度、美國、加拿大、英國、德國、荷蘭、羅馬尼亞等國家，2018年達到出口巔峰，出口滅活罌粟籽6 614 t，共148批次，貨值1 360.8萬美元。2002年，海關總署辦公廳聯合質檢總局發布《海關總署辦公廳、國家質量監督檢驗檢疫總局辦公廳關于大麻籽、罌粟籽進出口應證問題的通知》[2]中強調對以貿易方式申報進出口的大麻籽(商品編碼：12079999)和罌粟籽(商品編碼：12079100)，海關應憑檢驗檢疫機構注明的“已經檢驗檢疫機構滅活處理”或“經檢驗鑒定發芽率為0%”的《入/出境貨物通關單》辦理進出口驗放手續。檢驗檢疫機構直接滅活處理的，注明“已經檢驗檢疫機構滅活處理”，檢驗檢疫機構做發芽試驗的，注明“經檢驗鑒定發芽率為**%”(**按實際檢驗結果填寫)。然而現有涉及發芽方法的標準只針對普通常規作物種子，發芽計數方法對罌粟籽等涉毒種子不適用，而且國內外暫無涉毒種子滅活效果鑒定方法的研究?；诖?，本實驗研究罌粟籽滅活效果測定及評價方法，為制定相關行業標準提供技術支撐。

圖1 20 ℃培養第5天Fig.1 The 5th day of culture at 20 ℃

1 材料與方法

1.1 材 料

未滅活罌粟籽(PapaversomniferumL.)、滅活罌粟籽均由甘肅農墾集團有限公司提供，其中未滅活罌粟籽材料已在蘭州新區公安局報備。

1.2 最適發芽條件篩選

選取均勻、飽滿、一致的種子，每個處理4次重復， 每個重復100粒種子。用紙上發芽方法，選取TP發芽床，置于培養箱中且保持濾紙潮濕。設置3個恒溫(A1：20 ℃、A2：25 ℃、A3：30 ℃)和2個變溫(B1：15 ℃ 16 h/25 ℃ 8 h，20 ℃ 16 h/30 ℃ 8 h)處理。每天光照8 h，黑暗16 h。種子移入培養箱后第3天開始記錄，每24 h記錄一次，變溫處理下每天高溫條件下光照8 h，低溫條件下黑暗16 h。在發芽期間每日對發芽的種子進行觀察，記錄發芽數量。待發芽試驗結束后，觀察記錄正常種苗、不正常種苗、新鮮未發芽、死種子的數量。并參照農作物種子檢驗規程(GB/T 3543—1995)[3]、草種子檢驗規程(GB/T 2930.7—2017)[4]計算種子發芽率，根據種子在最適發芽條件下的發芽時間確定計數時間，以種子發芽率超過50%的天數為初次計數時間，以種子達到最大發芽率的天數為末次計數時間。發芽率(%)=( 發芽終期全部正常種苗數/供試種子數)×100%。

1.3 數據處理

采用SPSS 22.0軟件對發芽率進行差異顯著性統計分析，分析采用Duncan法，p<0.05，Excel軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 罌粟籽最適發芽溫度

發芽測定結果(表1)顯示，罌粟籽在20 ℃條件下發芽率最高(圖1)，達94%，隨著溫度升高，發芽率逐漸降低(圖2)，到30 ℃時發芽率為0%(圖3)，B1變溫發芽率為86%(圖4)，B2變溫發芽率為10%(圖5)，均低于20 ℃恒溫條件下。因此，判定罌粟籽最適發芽溫度為20 ℃。

表1 不同溫度處理對罌粟籽發芽的影響Table 1 Effects of different temperature treatments on seed germination percentage of poppy seeds

2.2 罌粟籽發芽計數時間

根據罌粟籽發芽率計數規律，初次計數時間確定為第5天，末次計數時間確定為第7天。

2.3 罌粟籽滅活效果測定方法

根據罌粟籽的最適發芽溫度(20 ℃)及初次和末次計數時間，建立了罌粟籽滅活效果測定方法：

1) 送驗樣品充分混合均勻，隨機數取250粒種子，以感量為0.000 1 g的分析天平稱重并記錄數據，從樣品袋中隨機選取不同點，以剛稱重數據10倍的重量稱取4個重復?；蛘呤褂脭盗x，隨機數10 000粒種子，以2 500粒為一個重復。

圖2 25 ℃培養第5天Fig.2 The 5th day of culture at 25°C

圖3 30 ℃培養第5天Fig.3 The 5th day of culture at 30 ℃

2) 將一層或多層發芽紙平鋪在透明的發芽盒內，倒入適量無菌蒸餾水濕潤發芽紙，發芽期間發芽床應始終保持濕潤。將種子均勻撒在濕潤的發芽床上，每粒種子間應保持適當的距離，以盡量減少相鄰種子間的影響，蓋上盒蓋，貼上標簽。

3) 發芽盒置于20 ℃恒溫光照培養箱進行培養，每天給予8 h光照。期間要經常檢查溫度、水分和通氣狀況。如有感染的種子應取出沖洗，嚴重感染的應更換發芽床。

4) 培養第5天進行第一次鑒定計數，第7天進行末次鑒定計數。

5) 每粒種子或幼苗的鑒定都必須按照GB/T 3543.4附錄A規定的標準進行。在計數過程中，發育良好幼苗應從發芽床中揀出，對可疑、損傷、畸形或不均衡的幼苗，觀察至末次鑒定計數。嚴重腐爛的幼苗或種子應從發芽床中除去，并隨時增加計數。

2.4 罌粟籽滅活效果評價

4個重復中沒有種子正常發芽，所有種子為死種子，判定發芽率=0%，滅活效果合格；

4個重復中，≥1粒種子正常發芽，即判定發芽率≠0%，滅活效果不合格。

3 討 論

3.1 滅活效果測定及評價標準

罌粟籽因其特殊性，國內外鮮見其檢驗方法的報道，現有相關種子品質檢驗方面的國家標準有農作物種子檢驗規程(GB/T 3543-1995)、草種子檢驗規程(GB/T 2930.7-2017)、林木種子檢驗規程(GB/T 2772-1999)[5]，但這三個國家標準僅涉及常規普通植物種子，適用范圍不包括罌粟種子。尤其重要的一點，這三個國家標準對發芽率結果計算和表示中寫道：“正常幼苗、不正常幼苗和未發芽種子百分率的總和必須為100%，平均百分率修約到最近似的整數，修約0.5進入最大值中?！边@意味著當遇見小于0.5%的發芽率，結果會近似為0，這對于常規需要正常發芽的植物種子來說是合適的，但并不適合判定罌粟籽的滅活效果。原因有二：第一，罌粟籽種子非常小，長約1 mm，寬0.8 mm，千粒重僅為0.362 g，每批出口量至少為50 t。滅活罌粟籽和普通種子相反，發芽率為0，死種子為100%才算結果合格，按原有標準一個發芽試驗需4次重復，每個重復以100粒計，每批罌粟籽樣品只需要檢測400粒樣品即可，但是400粒罌粟種子樣本極少，大約0.142 g，只用這400粒種子的發芽情況判斷該批次罌粟籽滅活效率是否達標非常不準確。第二,在實驗結果計算中遇到發芽率大于0.5%的數值,可按原標準近似為1%,但是實驗中經常出現值大于0%小于0.5%的計數。例如發芽率為0.25%時，10 000粒種子(重量只有3.62 g)中就會有25粒正常發芽長成健康植株，當有10 t貨物時，即使是0.25%的發芽率，能長成健康植株的種子大約為69 060 773粒。然而國內現有所有種子品質標準中因為未將滅活罌粟籽列入考慮，計算都會將0.25%近似為0%。因此涉毒類種子的滅活效果測定方法和評價標準不應該參照普通作物種子發芽方法，對于涉毒類種子測定滅活效果時，試驗樣品量要足夠，當≥1粒種子正常發芽，即可判定發芽率≠0%，滅活效果不合格。

圖4 15 ℃ 16 h，25 ℃ 8 h培養第5天Fig.4 The 5th day of culture at 15 ℃ for 16 hours and 25 ℃ for 8 hours

圖5 20 ℃ 16 h，30 ℃ 8 h培養第5天Fig.5 The 5th day of culture at 20 ℃ for 16 hours and 30 ℃ for 8 hours

3.2 滅活方法

常見種子滅活方法有：高溫蒸煮、化學試劑處理、60Co輻照、高能電子加速器輻照。滅活處理后的罌粟籽出口用于食品加工，需要考慮食用安全性，因此輻照處理是常用手段。但是輻照處理需反復操作才能保證滅活效果達標，人力財力消耗大，高溫蒸煮后再烘干可以保證滅活效果達標，步驟稍微繁瑣，但是成本低廉效果好。

3.3 種子生活力測定與發芽率測定比較

在一般情況下，種子活力測定和發芽率測定的結果差異不大，而且活力測定時間短，但是針對罌粟籽的滅活效果，本研究未采用生活力測定來判斷罌粟籽的滅活效果是否達標，原因有二：第一，種子生活力是指種子發芽的潛在能力或胚具有的生命力，它反映的是種子發芽率和休眠種子百分率的總和。所以種子生活力測定能提供給種子使用者和生產者重要的質量信息，是種子發芽和出苗率、幼苗生長的潛勢、植株抗逆能力和生產潛力的總和，是種子品質的重要指標。

一般情況下，高活力的種子在適宜的條件下一定能發芽，而且發芽快，出苗整齊，也一定有高的生活力，能發芽的種子都是具有生活力的種子。但有生活力的種子不一定能發芽。正常罌粟種子經高能電子加速器等機器輻照后，生活力并未完全喪失，但是做發芽實驗時，輻照后的種子只冒出一點點胚芽就停止生長，最后按不正常幼苗來算結果。第二，種子生活力測定方法有氯化三苯四氮唑法(TTC法)[6]、溴麝香草酚藍法(BTB法)[7]、紅墨水染色法[8]、紙上熒光法[9-10]，這些方法通過種子染色情況來判斷種子是否具有活力，但是罌粟籽非常小，染色后肉眼觀察非常困難，需要借助體式顯微鏡下逐一判斷，耗時長且易誤判。因此，用發芽率來判斷種子滅活效果是否達標是最直觀和準確的。

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