酶法輔助膠體磨同時提取糯米淀粉和蛋白質的工藝研究

何述棟 ，王雍飛 ，潘姝曉 ，李興江 ，王家良 ，繆新亞 ，王振山 ，孫漢巨

（1.合肥工業大學 食品與生物工程學院，合肥 230061；2.蚌埠學院 食品與生物工程學院，安徽蚌埠 233030；3.安徽湘園食品科技有限公司，安徽蚌埠 233400；4.匯福糧油泰州有限公司，江蘇泰州 225327）

0 引言

安徽省懷遠縣地處淮河流域腹地，氣候適宜糯稻種植，是我國最大的糯米生產基地和交易集散地［1］。糯米是糯稻脫殼后的產品，北方俗稱江米［2］，按照形狀、黏度和種植區域分為梗糯和秈糯。糯米營養價值豐富，含有豐富的淀粉和蛋白質，大量的鈣、磷、鐵等金屬元素以及維生素B1、維生素B2和煙酸等微量元素［3］。糯米具有補中益氣、健脾養胃和潤肌養顏的功效。因此，糯米深受我國消費者喜愛，是我國諸多傳統食物，如年糕、八寶粥、粽子、湯圓等的重要原材料，也是釀制黃酒的主要來源［4］。隨著現代營養健康食品的發展，以糯米淀粉和蛋白質為原料開發保健功能性食品成為新的市場關注點，前景巨大。然而，由于農村當地缺乏糯米精深加工能力，無法滿足農業增收、農民增收的新需求。我國相關糧食作物研究多以大米為主，關于糯米的研究和開發報道較少。傳統糯米深加工以水磨法制備糯稻淀粉為主，存在著得率低、能耗高的實際問題［5］，廢水中含有大量的水溶性蛋白，造成了浪費和環境污染，蛋白質和淀粉分子均被植物細胞所束縛。因此，本文嘗試采用酶法輔助破壞糯米結構，有效增加蛋白質和淀粉分子的溶出率，結合膠體磨和離心處理，通過物理特性差異同時制備糯米淀粉和蛋白質。試驗結果可為糯稻綜合加工的全面開展奠定基礎，降低廢水污染，提升產品附加值，具有較好的實際生產指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米原料：安徽湘園食品科技有限公司提供，產自安徽省懷遠縣，收獲年份為2019年。纖維素酶（來源于黑曲霉，10 000 u/g，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；果膠酶（來源于黑曲霉，10 000 u/g，北京百靈威科技有限公司）。所用化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1800型紫外可見光分光光度計（上海元析儀器有限公司）；HH-2型數顯恒溫水浴鍋（國華（常州）儀器制造有限公司）；FW100型小型高速萬能粉碎機（上海楚定分析儀器有限公司）；JMFB-80型膠體磨（上?？苿跈C械設備有限公司）；TGL18M型臺式高速冷凍離心機（鹽城市凱特實驗儀器有限公司）；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；K1160型凱氏定氮裝置（濟南海能儀器股份有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 酶法輔助膠體磨同時提取糯米蛋白質和淀粉的工藝

取一定量的糯米樣品用蒸餾水洗滌2次，粗粉碎后，加入與糯米質量比1：10的蒸餾水，調節pH值，加入酶制劑，在一定溫度下酶解一段時間后，采用膠體磨碾磨成糯米漿，在4 ℃經6 500 rad/min離心作用后，獲得富含蛋白質的上清液和富含淀粉的濾餅。上清液經乙醇逆流交換后，蛋白質析出，42 ℃干燥，得糯米蛋白粉；糯米粉餅經50 ℃干燥后，得糯米淀粉（水分含量小于12.5%）。

1.3.2 蛋白質含量的測定

原料以及烘干蛋白粉的粗蛋白質含量采用凱氏定氮法（GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》第一法）進行測定。

水提上清液中蛋白質含量采用考馬斯亮藍法進行測定，以系列濃度（mg/mL）牛血清白蛋白經考馬斯亮藍G-250染色后在595 nm處的相應吸光度值做標準曲線［6］。

式中 m1——水提上清液中蛋白質含量；

m2——原料中蛋白質含量。

1.3.3 糯米淀粉含量的測定

依據GB 5009.9—2016《食品安全國家標準食品中淀粉的測定》，采用酸水解法（第二法）對原料中糯米粗淀粉含量進行測定。

式中 m3—— 膠體磨離心沉淀的糯米粉餅淀粉質量；

m4——原料中淀粉質量。

1.3.4 糯米水分含量的測定

糯米粗水分含量的測定采用GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》中的直接干燥法（第一法）。

1.4 酶法輔助單因素優化試驗設計

1.4.1 酶種類的選擇

按工藝處理物料，分別加入物料重0.8%的纖維素酶、果膠酶、纖維素酶和果膠酶的復配（活性比1：1），進行后續處理，確定酶種類。

1.4.2 酶添加量的確定

按工藝處理物料，分別加入物料重0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%確定酶的量，進行后續處理，確定最佳酶添加量。

1.4.3 酶解時間的確定

按工藝處理物料，添加已確定的酶和量，分別酶解 30，45，60，75，90 min，進行后續處理，確定最優酶解時間。

1.4.4 酶解pH值的確定

按工藝處理物料，調節pH值至3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，添加已確定的酶和量，按最優酶解時間進行后續處理，確定最佳pH值。

1.4.5 酶解溫度的確定

按工藝處理物料，調節到最佳pH值，添加已確定的酶和量，分別在40，50，60 ℃按最優時間進行酶解，再進行后續處理，確定酶解溫度。

1.5 數據處理

試驗最少進行3次重復，結果以平均值±SD值表示；采用SPSS軟件進行方差分析，P<0.05為差異顯著；采用Origin軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 糯米原料的基本成分

經測定，試驗用糯米原料的基本成分組成：粗水分含量為（11.5±1.2）%，粗蛋白質含量為（6.72±0.30）%，粗淀粉含量為（73.5±2.5）%。

糯米的主要組分是淀粉。糯稻是稻的黏性變種，其支鏈淀粉含量可達95%以上，因此加熱可形成獨特的黏性口感。依據糯稻的種植地域，不同品系的糯米其基本成分組成略有不同［7］。

2.2 酶種類的選擇

傳統的糯米蛋白質或淀粉的提取研究多以酶法為主［8］，常采用蛋白酶或淀粉酶，以水解某一主要成分為主要技術手段，而富集另外一個主要組分，不能同時制備2個完整的大分子?；诩毎票诳紤]，試驗擬采用纖維素酶、果膠酶以及纖維素酶和果膠酶的復配（活力比1：1）分別處理糯米細胞壁，使水溶性蛋白和包裹其中的淀粉盡量釋放出來，試驗結果如圖1所示。

圖1 酶種類對同時提取糯米淀粉和蛋白質的影響Fig.1 Effect of enzyme types on simultaneous extraction of glutinous rice starch and protein

單酶酶解效果好于復合酶的處理，且果膠酶協同膠體磨制備了較高提取率的糯米蛋白質和淀粉（P<0.05），這與鄭典元等［9］對褐藻的酶處理結果相似。植物細胞壁的主要成分為纖維素、半纖維素和果膠，而糯米細胞間質的主要成分是果膠。因此，果膠酶在破開植物細胞壁的胞間層，解離細胞組織方面，會優于纖維素酶，緊接著在膠體磨作用力下，可以釋放出較多的水溶性蛋白和淀粉分子［10］。纖維素酶可以水解細胞中 β -1，4 糖苷鍵鏈接的非淀粉多糖，導致膠體磨沉淀物的相對降低以及上清液組分的一定增多。在表觀試驗結果上，雙酶復合處理呈現出蛋白質提取率與纖維素酶單酶處理差異不顯著（P >0.05），但淀粉得率顯著降低（P<0.05）的現象。根據江婭梅［11］采用纖維素酶和果膠酶對南瓜漿處理的研究報道可知，果膠酶在50 ℃時的酶解活力要好于纖維素酶，這也可能是本試驗現象的一個原因。因此，在后續試驗優選果膠酶進行處理。

2.3 酶添加量的確定

采用果膠酶處理浸泡糯米，酶添加量對膠體磨同時提取糯米淀粉和蛋白質的影響如圖2所示。當果膠酶添加量比重為0.6%時，果膠酶對膠體磨同時提取糯米淀粉和蛋白質的影響顯著提升。當添加量為0.8%時，同時獲得最高的蛋白質提取率40.50%和最高的淀粉得率90.90%。隨著酶添加量的繼續提高，得率并未有顯著提升，反而略有下降。隨著酶添加量的增加，果膠酶水解膠質的反應速率加快，利于糯米顆粒破壁，使蛋白質和淀粉從細胞內和細胞間溶出，但是過量的果膠酶無法獲得更多的酶作用位點，提取率不會繼續顯著提升。因此，試驗優選果膠酶添加比重為0.8%繼續進行單因素優化研究。

圖2 酶添加量對同時提取糯米淀粉和蛋白質的影響Fig.2 Effect of enzyme addition on simultaneous extraction of glutinous rice starch and protein

2.4 酶解時間的確定

酶解時間對膠體磨同時提取糯米淀粉和蛋白質的影響如圖3所示。隨著酶解時間的延長，糯米蛋白質提取率和淀粉得率均呈現緩慢增加的變化趨勢。當酶解時間達到60 min時，糯米蛋白質和淀粉得率后續變化差異不顯著（P>0.05），差異幅度較小，表明果膠酶在60 min時已基本與糯米顆粒結合完全，酶解較充分，繼續增加酶解時間無法繼續提高酶反應效率。因此，從經濟成本考慮，試驗確定60 min為最佳酶解時間。

圖3 酶解時間對同時提取糯米淀粉和蛋白質的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on simultaneous extraction of glutinous rice starch and protein

2.5 酶解pH值的確定

依據Osborne分級法，糯米等稻谷蛋白一般由清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白組成［12］。其中，清蛋白溶于水，球蛋白易溶于鹽溶液，2者約占蛋白總含量的4%～15%；谷蛋白約占蛋白總量的80%，多溶于稀酸、稀堿溶液；其余蛋白為醇溶蛋白，約占蛋白總量的1%～5%。前期研究表明，pH值對稻米蛋白的溶解性影響顯著，在pH值4.0～7.0的環境中，稻米谷蛋白的溶解性緩慢增長，當pH值為9.0時，谷蛋白的溶解性顯著提高。因此，為提高稻米蛋白質提取率，前期研究多采用NaOH等堿法提取，該條件下不但容易產生處理成本較高的大量廢水，而且會誘發蛋白質變性，甚至生成一些有毒性化合物，嚴重限制了堿法蛋白提取在食品工業中的應用。為溫和獲得糯米大分子蛋白質，試驗探究以果膠酶破壁為基礎的pH值范圍，對膠體磨同時提取糯米淀粉和蛋白質的影響，結果如圖4所示。

圖4 酶解pH值對同時提取糯米淀粉和蛋白質的影響Fig.4 Effect of enzymatic pH value on simultaneous extraction of glutinous rice starch and protein by colloid mill

隨著pH值的升高，蛋白質提取率和淀粉得率均呈現先升高后緩慢降低的變化趨勢。當pH值為4.5時，蛋白質和淀粉的同時得率最高。已有研究表明，果膠酶的最適酶作用pH值在4.0～5.0范圍內［13］，此時浸泡破壁效率較高，在膠體磨處理過程中可以釋放出較多的蛋白質和淀粉。當pH>5.0時，雖然谷蛋白的溶解性緩慢提高，但是果膠酶的酶活性降低，細胞間膠質的完好性限制了蛋白質的提取率，同時也導致淀粉得率降低。因此選取4.5作為最佳的酶作用pH值。

2.6 酶解溫度的確定

考慮工業化生產操作適宜性，試驗基于以上最優條件，選擇40，50，60 ℃研究酶解溫度對膠體磨同時提取糯米淀粉和蛋白質的影響，試驗結果如圖5所示。

圖5 酶解溫度對同時提取糯米淀粉和蛋白質的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on simultaneous extraction of glutinous rice starch and protein

隨著溫度從40 ℃升溫至50 ℃，蛋白質提取率和淀粉得率均呈現顯著升高的變化趨勢。當溫度升至60 ℃時，蛋白質提取率和淀粉得率均最低。已有研究表明，果膠酶的最適作用溫度為50 ℃，溫度過高或過低均會抑制酶活性［14］，造成蛋白質和淀粉溶出效果的降低。糯米開始糊化的溫度在60～75 ℃，溫度過高時，支鏈淀粉溶脹，黏度增加，進一步阻礙蛋白質和淀粉的溶出。過高的溫度不利于提取，因此最佳的酶解溫度為50 ℃。

3 結語

本文提出酶法輔助膠體磨偶聯離心處理同時制備糯米淀粉和蛋白質的新工藝，基于果膠酶破壁和水提工藝，最大限度保留產品的營養性質。進行單因素優化試驗可知，選用果膠酶對糯米（料液比1：10）進行浸泡處理，酶添加量為0.8%，酶解時間60 min，酶解pH值為4.5，酶解溫度為50 ℃時，蛋白質提取率可達43.8%，淀粉得率可達93.2%，達到預期目標，可為后續產業化生產提供數據支撐和依據。