四物合劑對縮宮素所致原發性痛經模型小鼠的影響研究

劉子馨 賈飛凡 孟紅旭韓 笑李玲美尤 越王奧奧王紫艷楊 斌李 磊*付建華*劉建勛

(1.中國中醫科學院西苑醫院基礎醫學研究所,北京 100091；2.國家中醫心血管病臨床醫學中心,北京 100091；3.中藥藥理北京市重點實驗室,北京 100091；4.解放軍總醫院第六醫學中心,北京 100048；5.中國中醫科學院西苑醫院病理科,北京 100091)

原發性痛經(primary dysmenorrheal,PD)是指伴隨月經周期出現以下腹部疼痛為主要癥狀且無其他生殖器官器質性病變的疾病,是最常見的婦科疼痛性疾病,占痛經的90%以上[1],在不同年齡、國籍的女性人群中發病率占45%～97%不等,可以占到學校與工作缺勤原因的1%～3%[2]。原發性痛經屬于中醫“經行腹痛”的范圍。清代陳蓮舫所著《女科秘訣大全》中將經行腹痛稱為“痛經”,后世醫者沿用此名。針對原發性痛經的治療,西醫臨床常使用非甾體抗炎藥和避孕藥[3],此類藥物主要作用靶點為前列腺素,通過抑制前列腺素緩解疼痛[4]。然而長期使用非甾體抗炎藥和口服避孕藥對肝、腎、胃腸功能甚至心臟系統都有許多副作用[5]。中醫臨床常使用四物湯及其類方或佐以針灸、穴位貼敷、耳穴、熏蒸、灌腸等方法,療效顯著且副作用少[6-8]。四物合劑始載于2000 年版《中國藥典》一部[9],源于中醫經典方劑“四物湯”其組成成分為:當歸、熟地黃、白芍、川芎。四物湯最早記載于唐代藺道人所著的《仙授理傷續斷秘方》,后世應用較為廣泛的藥方則取自宋代《太平惠民和劑局方》中,具有調經止痛、補血活血的功效,主治沖任虛損、月水不調……經行腹痛等婦人諸疾[10]。方中當歸補血養肝,和血調經,熟地黃補血滋陰,佐以白芍和營柔肝,川芎活血行滯,通暢氣血,被稱為“婦科第一方”是治療婦科疾患的基礎方。通過網絡藥理學研究分析得出四物湯治療PD 的關鍵作用機制為舒張子宮、調節激素、抗炎鎮痛等[3]?；诖?本研究旨在探究四物合劑治療原發性痛經的作用及其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

KM 雌性小鼠60 只,SPF 級,體重18～22 g,由維通利華實驗動物技術有限公司提供[SCXK(京)2021-0006]。動物飼養、實驗操作均在中國中醫科學院西苑醫院實驗動物中心[SYXK(京)2018-0018]進行。實驗動物處置嚴格遵循“減少、替代、優化”的3R 原則,給予人道主義關懷。本研究獲得中國中醫科學院西苑醫院動物倫理委員會批準(2022XLC001)。

1.2 主要試劑與儀器

四物合劑,神威藥業(四川)有限公司提供,每瓶10 mL,批號2001141,有效期至2022 年1 月,根據2020 年版《中國藥典》一部計算,每1 mL 四物合劑相當于1 g 生藥；縮宮素注射液,上海禾豐制藥有限公司,1 mL:10 單位,批號:09201009,有效期至2022 年10 月；苯甲酸雌二醇注射液,寧波第二激素廠,2 mL:4 mg,批號:2011051,有效期至:2022 年10月；痛經寶顆粒,仲景宛西制藥股份有限公司,每袋10 g,批號:200704。

丙二醛(SOD)測定試劑盒:南京建成生物工程有限公司,貨號:A001-3-2；超氧化歧化酶(MDA)測定試劑盒:南京建成生物工程有限公司,貨號:A003-1-2；前列腺素F2α(PGF2α)ELISA 試劑盒:上海江萊生物科技有限公司,貨號:JL13273；白介素6(IL-6)ELISA 檢測試劑盒:上海酶聯生物科技有限公司,貨號:ml002293-C；腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒:上海酶聯生物科技有限公司,貨號:ml002095-C；環氧合酶-2 抗體(COX-2):proteintech,貨號:66351-1-lg。多功能酶標儀:BioTek 公司(美國)SYNERGY44型；低溫冷凍離心機:Thermo Fisher Scientific 公司(美國)MP-150 型。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

正常雌性小鼠60 只,隨機均分成4 組,即空白組、模型組、陽性藥痛經寶顆粒組(4 g/kg)、四物合劑組(8 mL/kg),按照藥品說明書給藥方式設置給藥劑量,適應性飼養3 d 后各組給予相應藥物灌胃給藥。

1.3.2 造模與給藥

小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇(2 mg/kg),每日1次,連續10 d。第4 天開始,空白組與模型組給予等劑量蒸餾水,痛經寶組按4 g/kg 給藥,四物合劑組每日按8 mL/kg 給藥,每日給藥1 次,連續給藥7 d。

1.3.3 扭體次數、潛伏期測定

末次注射苯甲酸雌二醇后1 h,按10 U/kg 腹腔注射縮宮素,制備小鼠原發性痛經模型。小鼠腹腔注射10 U/kg 縮宮素后,即刻放入透明的觀察箱中,觀察記錄小鼠首次出現扭體時的潛伏期以及小鼠30 min 內所有扭體次數,計算出藥物扭體反應抑制率。觀察標準:小鼠腹腔出現內凹,以及軀干與后肢伸展,臀部與一側肢體內旋。抑制率(%)=(模型組扭體反應均數-給藥組扭體反應均數)/模型組扭體反應均數×100%。

1.3.4 血清MDA、SOD 檢測

觀察出現扭體反應30 min 后,進行小鼠麻醉。小鼠眼底靜脈叢取血放至不含抗凝劑試管中,室溫下靜置1 h 后,3500 r/min 離心,離心10 min 后取上清。用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)檢測血清SOD 活性,硫代巴比妥酸(TBA)法測定血清MDA 含量。

1.3.5 ELISA 法檢測子宮組織PGF2α、IL-6、TNF-α

小鼠眼底靜脈叢取血后,冰上迅速摘取小鼠新鮮的子宮組織,預冷的PBS 沖洗子宮組織,去除殘留血液,稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS 按1 ∶9 加入勻漿器中,充分研磨,將勻漿液于7300 r/min,離心10 min,取上清檢測。ELISA 檢測子宮組織PGF2α、IL-6、TNF-α 的含量。以上均嚴格按照說明書要求操作。

1.3.6 子宮HE 染色與免疫組化

取出子宮組織后用4%多聚甲醛固定24 h 后,石蠟包埋,制備子宮組織切片,HE 染色后顯微鏡下觀察子宮組織。石蠟切片常規脫蠟至水,0.3%H2O2氧化15 min,PBS 洗3 遍,每遍5 min,滴加一抗COX-2(1 ∶200 稀釋)4℃過夜,PBS 洗3 遍,每遍5 min,滴加EnVision II 抗,室溫60 min,PBS 洗3遍,每遍5 min。每張切片加100 μL 新鮮配制的DAB 溶液,顯微鏡下觀察3 min,陽性顯色為棕色。蒸餾水洗終止染色,蘇木素復染,0.1%鹽酸分化,自來水沖洗,PBS 沖洗返藍,梯度乙醇脫水,透明,封片。采用Image J 統計數據進行分析。

1.4 統計學方法

應用SPSS 25.0 軟件進行數據統計分析,計量資料結果用平均數±標準差()示,將測定數據進行正態性、方差齊性檢驗,組間比較采用t檢驗,多樣本均數比較采用單因素方差分析,P＜0.05 差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠扭體反應及潛伏期檢測

與正常組相比較,模型組30 min 內小鼠扭體反應次數顯著增多(P＜0.01),潛伏期顯著縮短(P＜0.01)。與模型組比較,陽性藥組30 min 扭體次數增加(P＜0.05)四物合劑組30 min 內扭體次數顯著減少,潛伏期明顯增加(P＜0.01,P＜0.05),見表1。

表1 各組原發性痛經小鼠模型潛伏期、扭體次數(,n=15)Table 1 Comparison of latency and body twisting times of primary dysmenorrhea model mice in each group

表1 各組原發性痛經小鼠模型潛伏期、扭體次數(,n=15)Table 1 Comparison of latency and body twisting times of primary dysmenorrhea model mice in each group

注:與正常組比較,##P＜0.01；與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。Note.Compared with the normal group,##P＜0.01.Compared with the model group,*P＜0.05,**P＜0.01.

2.2 小鼠血清SOD、MDA 含量測定

與正常組相比,模型組、陽性藥組、四物合劑組小鼠血清中SOD 無顯著性差異；與正常組相比,模型組血清MDA 顯著增加(P＜0.01)；與模型組相比,陽性藥組、四物合劑組血清MDA 顯著降低(P＜0.01),見表2。

表2 各組原發性痛經模型小鼠血清SOD、MDA(,n=15)Table 2 Serum SOD and MDA of primary dysmenorrhea model mice in each group

表2 各組原發性痛經模型小鼠血清SOD、MDA(,n=15)Table 2 Serum SOD and MDA of primary dysmenorrhea model mice in each group

注:與正常組比較,##P＜0.01；與模型組比較,**P＜0.01。Note.Compared with the normal group,##P＜0.01.Compared with the model group,**P＜0.01.

2.3 小鼠子宮勻漿PGF2α、IL-6、TNF-α 測定

與正常組相比,模型組子宮組織中PGF2α顯著增高(P＜0.01)；與模型組相比,陽性藥組PGF2α顯著降 低(P＜0.01),四物合劑組PGF2α降低(P＜0.05)；與正常組相比,模型組子宮組織IL-6、TNFα 增加(P＜0.05),與模型組相比,陽性藥組、四物合劑組子宮組織IL-6、TNF-α 降低(P＜0.05),見表3。

表3 各組原發性痛經模型小鼠子宮組織PGF2α、IL-6、TNF-α(,n=15)Table 3 Uterine tissue of primary dysmenorrhea model mice in each group PGF2α,IL-6,TNF-α

表3 各組原發性痛經模型小鼠子宮組織PGF2α、IL-6、TNF-α(,n=15)Table 3 Uterine tissue of primary dysmenorrhea model mice in each group PGF2α,IL-6,TNF-α

注:與正常組比較,#P＜0.05,##P＜0.01；與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。Note.Compared with the normal group,#P＜0.05,##P＜0.01.Compared with the model group,*P＜0.05,**P＜0.01.

2.4 小鼠子宮組織病理觀察

小鼠子宮組織病理分析見圖1。正常組小鼠子宮腺體多,腔大飽滿,間質疏密均勻,血管豐富,內膜上皮固有層結構緊密,間質細胞豐富,未見明顯異常。

圖1 原發性痛經模型小鼠HE 染色切片Note.A,Normal group.B,Model group.C,Positive drug group.D,Siwu mixture group.Figure 1 HE staining sections of primary dysmenorrhea model mice

模型組子宮內膜腺體擴張,呈乳頭狀增生,間質水腫血管擴張,炎性細胞浸潤,說明模型制備成功。與模型組相比,陽性藥組小鼠子宮水腫和炎性細胞浸潤明顯減輕,四物合劑組小鼠子宮腺腔見少量炎癥細胞浸潤。

2.5 小鼠子宮組織COX-2 表達

與正常組相比,模型組子宮組織COX-2 表達增加(P＜0.05)；與模型組相比,陽性藥組、四物合劑組子宮組織COX-2 表達降低(P＜0.05),見圖2、圖3。

圖2 原發性痛經模型小鼠COX-2 免疫組化切片Note.A,Normal group.B,Model group.C,Positive drug group.D,Siwu mixture group.Figure 2 COX-2 immunohistochemical section of primary dysmenorrhea model mice

圖3 COX-2 在小鼠子宮組織中的表達Note.A,Normal group.B,Model group.C,Positive drug group.D,Siwu mixture group.Compared with the normal group,##P＜0.01.Compared with the model group,**P＜0.01Figure 3 Expression of COX-2 in mice uterus

3 討論

原發性痛經病位在子宮,變化在氣血主要病機為“不榮則痛、不通則痛”[4]。清代《傅青主女科》的“舒則通暢,郁則不揚,經欲行而肝不應,則抑拂其氣而疼生”進一步闡明原發性痛經形成原因為體虛、寒、氣郁、血結等。四物合劑組成成分為:當歸、熟地黃、白芍、川芎,具有益氣活血、補血養血功效,為臨床治療原發性痛經常用藥物。

縮宮素誘發的小鼠原發性痛經模型是被廣泛認可的痛經藥效學實驗模型,常應用于原發性痛經的研究[11]。原發性痛經的主要臨床癥狀是劇烈的急性腹痛,因此采用扭體反應為主要指標用來評價實驗藥物的療效[12-13]。本研究發現,與正常組相比,模型組小鼠30 min 內扭體次數顯著增加,潛伏期縮短,陽性藥組、四物合劑組有效降低了PD 模型小鼠30 min 內扭體反應次數,延長疼痛潛伏期,說明四物合劑可拮抗縮宮素誘發的小鼠急性腹痛。

現代研究發現,原發性痛經與子宮內膜平滑肌陣發性收縮所導致的肌間血管受壓而引起的子宮肌層及內膜暫時性缺血,產生過多自由基有關[14]。MDA 是脂質過氧化代謝的重要產物,可引起細胞損傷,其含量可間接反映子宮細胞受自由基損傷的嚴重程度[15]。研究發現,與正常組相比,模型組小鼠血清MDA 水平顯著增加,陽性藥組、四物合劑組血清MDA 水平較模型組降低說明四物合劑組小鼠子宮組織內脂質過氧化程度低,提示四物合劑在一定程度上減少子宮氧化應激水平。

子宮內膜是合成前列腺素的重要部位,研究表明,PD 的病因是子宮前列腺素(PGs)的過多分泌使子宮過度收縮[5],前列腺素的生物合成在疼痛模型的疼痛機制中有重要作用[16]。特別是PGF2α刺激子宮收縮、缺血,導致月經痛[5]。與正常組相比,模型組小鼠子宮組織中的PGF2α水平顯著增高,陽性藥組、四物合劑組小鼠子宮組織PGF2α水平較模型組降低。炎癥與痛經息息相關,研究發現原發性痛經的主要機制與前列腺素、白細胞介素的增高密切相關[17]。TNF-α 具有調控免疫應答、促進細胞生長分化等多種生物學功能,參與了多種炎癥反應和神經相關慢性疼痛[17]。白介素6 是一種多效性細胞因子,在免疫調節、再生過程、骨穩態調節、心血管系統保護等方面發揮多種生物學作用[18]。研究表明子宮內膜異位癥患者血清TNF-α、IL-6 水平顯著升高且嚴重痛經患者較無痛經患者血清TNF-α、IL-6 顯著升高[19]。本研究中,模型組子宮組織TNF-α、IL-6 含量增高,陽性藥組、四物合劑組子宮組織TNF-α、IL-6 含量降低,表明四物合劑可能通過降低TNF-α、IL-6 減輕痛經癥狀。

環氧化酶(COX)是參與PGs 的生物合成限速酶,臨床常用非甾體類抗炎藥治療原發性痛經,其機制主要是通過抑制COX 減少PGs 的生成,COX-2高表達使PGF2α升高加重痛經[20]。本研究表明,四物合劑可降低COX-2 表達,其治療痛經機制可能與降低COX-2 表達從而抑制PGF2α治療小鼠原發性痛經有關。

綜上所述,四物合劑能顯著減少原發性痛經小鼠30 min 扭體次數,延長扭體潛伏期,其作用機制可能與降低血清MDA 含量、子宮組織中PGF2α、IL-6、TNF-α 水平以及COX-2 表達,改善組織病理學變化有關,其機制值得進一步深入研究。