多柔比星致小鼠慢性心臟毒性模型的構建及評估

金翠柳 ,柴 鈺 ,凌 望 ,吳美平 ,金素安

(1.上海中醫藥大學附屬市中醫醫院,上海 200071；2.上海中醫藥大學,上海 201203)

腫瘤心臟病是臨床影響腫瘤患者生存率的一類重要疾病,尤其是放療或化療藥物誘發的心臟毒性最為常見,其中化療藥物誘發心臟毒性在抗癌治療中發病率高,常常影響腫瘤患者的預后,是妨礙腫瘤幸存者生命健康的一大挑戰[1-4]。目前針對化療藥物誘發的心臟毒性尚無明確的治療措施,建立可靠的心臟毒性模型是進行藥物研究的前提。構建心臟毒性模型多采用放療或化療藥物進行干預,化療藥物干預常以多柔比星藥物腹腔注射構建心臟毒性模型較為常見[5-6]。且采用藥物注射操作技術簡便、易于大量重復,是目前探索腫瘤心臟病治療方法的合適動物模型。

構建多柔比星誘導小鼠心臟毒性模型是心血管基礎研究常用的動物模型之一[7-8],也是探索腫瘤心臟病的病理發生、發展以及治療方法的前提,然而通過查閱國內外相關文獻發現,構建心臟毒性模型采用的多柔比星藥物濃度差異較大,給藥策略和評價指標不規范,給藥濃度從3～10 mg/kg 均有涉及,其中有采用多柔比星給藥濃度3 mg/kg,隔天給藥1 次,給藥2 周來構建該模型,以小鼠心超指標:左室射血分數(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)下降為建模成功指標[9]。也有采用4 mg/kg 多柔比星藥物濃度連續注射4 周,以血清中肌鈣蛋白T(cTnT)、乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶-同功酶(CK-MB)等指標上升視為建模成功指標[10]。更甚者提出在第1、3、5 天給予多柔比星10 mg/kg 腹腔注射,1 周后也可檢測到小鼠心功能下降,心肌細胞凋亡[11],綜合上述發現該模型對于造模用藥劑量、時間差異極大,且目前國內外研究對多柔比星構建心臟毒性模型以何種濃度誘導,以及誘導的時間長短均無定論[12-14]。本研究通過參考臨床多柔比星化療方案[15-16],并結合多柔比星藥代動力學特征,多柔比星血漿濃度呈多相衰減,終末相半衰期為50 h[17],探討在同等的造模時長(4 周)、給藥周期(每3 d 1 次)下系統地探討不同濃度多柔比星對小鼠心臟損傷、心臟組織結構變化的影響,以期構建出成模率高且死亡率低的多柔比星慢性心臟損傷模型,為后續開展多柔比星相關實驗的廣大研究者提供造模參考依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級別實驗雄性小鼠C57BL/6J,36 只,20～22 g,6～8 周齡,購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司[SCXK(滬)2017-0005],在上海同濟大學實驗動物中心[SYXK(滬)2018-0034]SPF 屏障環境(室溫20℃～25℃,濕度60%～70%)下飼養。實驗經上海同濟大學生物醫學倫理委員會審批(TJHBLAC-2019-057)。實驗過程遵循3R 原則。

1.2 主要試劑

鹽酸多柔比星(Med Chem Express,美國；批號:HY-15142)；活化后的半胱氨酸蛋白3(Cleavedcaspase-3)(CST,美國；批號:9664S)；促凋亡蛋白(Bax)(CST,美國；批號:ab182734)；抑凋亡蛋白(Bcl2)(CST,美國；批號:ab182858)；抗-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(CST,美國；批號:5174S)；山羊抗兔 IgG (H+L) (Yeasen,中國；批號:33101ES60)；天狼猩紅染色試劑盒(索萊寶科技有限公司,中國；批號:S8060)；麥胚凝集素染色試劑盒(Thermo,美國；批號:L2785)。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模

8 周齡SPF 級別雄性C57BL/6J 小鼠36 只,將其隨機分為NS 組、3 mg/kg 多柔比星劑量組、4 mg/kg 多柔比星劑量組、5 mg/kg 多柔比星劑量組、6 mg/kg 多柔比星劑量組、7 mg/kg 多柔比星劑量組,每組各6 只。實驗小鼠根據分組腹腔注射不同濃度多柔比星和生理鹽水,每3 d 1 次,共10 次。30 d后,處死小鼠,取出心臟,用于后續實驗。

1.3.2 檢測指標及方法

(1)HE 染色

參照文獻[18],常規脫蠟至水后,按說明書使用伊紅-蘇木素染料進行染色,心臟組織常規脫水透明后進行封片處理,在顯微鏡下觀察組織顯色效果并采集圖像。

(2)天狼猩紅染色

參照文獻[19],常規脫蠟至水后,準備濕盒,用免疫組化筆在組織周圍畫圈,按說明書使用天狼猩紅染料進行染色,心臟組織常規脫水透明后進行封片處理,在顯微鏡下觀察組織顯色效果并采集圖像。

(3)麥胚凝集素染色

參照文獻[20],烤片,脫蠟至水,使用微波爐將組織用檸檬酸鈉修復液進行抗原熱修復,甘氨酸室溫孵育20 min,用PBS 洗1 次。準備濕盒,用免疫組化筆在組織周圍畫圈,按說明書要求進行麥胚凝集素染色,染色完成后使用熒光顯微鏡觀察組織顯色效果并采集圖像,后續使用Image J 軟件統計心肌細胞橫截面積。

(4)蛋白免疫印跡(Western blot)

稱取并研磨相同重量的心臟組織,裂解并提取蛋白,測定蛋白濃度。蛋白樣品進行電泳、轉膜、封閉,后續加入一抗GAPDH、Bax、Bcl2、Cleavedcaspase3 和相應二抗孵育,Bio-Rad 凝膠成像分析儀曝光,Image J 統計各組灰度值。

1.4 統計學方法

采用Graph Pad Prism 6.0 統計軟件進行統計學分析,實驗數據以平均數±標準差()表示,對各項指標數據進行正態性檢驗,其中多組間比較用One-Way ANOVA 分析法,多組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗,兩組間均值差異采用兩獨立樣本t檢驗,以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度多柔比星對小鼠一般情況及生存率的影響

與NS 組相比,6 mg/kg 多柔比星模型組小鼠存活5 只,7 mg/kg 多柔比星模型組小鼠存活1 只,其余濃度模型組小鼠均存活,提示小鼠生存率隨著多柔比星的濃度增加而同步下降,見圖1A。取材后對各組小鼠心臟拍照觀察,發現隨著多柔比星濃度的上升,小鼠心臟呈劑量依賴性的縮小,見圖1B。同時對小鼠心臟中段橫截面進行HE 染色,從圖1C 可見,與生理鹽水組相比,多柔比星組小鼠心臟整體縮小,心室內徑擴大,與肉眼觀察相符。后期對小鼠的體重、心臟重量、心重比及其心脛比進行統計,發現與NS 組相比,多柔比星組小鼠的體重、心臟重量、心脛比均下降,且隨著多柔比星濃度的增加而同步下降(P＜0.05),但在小鼠心重比參數上無統計學差異(P＞0.05),可能與多柔比星注射后體重同步下降有關,見圖1D～1G。

圖1 不同濃度多柔比星對小鼠一般情況及生存率的影響(n=6)Note.A,Mouse survival curve.B,Pictures of representative hearts of mice in each group.C,Schematic diagram of HE staining of mice in each group.D,Body weight statistics of mice in each group.E,Heart weight statistics of mice in each group.F,Statistics of the ratio of heart to body weight in each group.G,Statistics of the tibia heart weight ratio of mice in each group.Compared with normal saline group,***P＜0.001,**P＜0.01,*P＜0.05,nsP ＞0.05.Figure 1 Effects of different concentrations of doxorubicin on general condition and survival rate of mice

2.2 不同濃度多柔比星對心肌細胞凋亡的影響

心肌細胞凋亡是多柔比星誘導心肌細胞死亡的方式之一,同時也是多柔比星誘導慢性心臟損傷的病理表現之一[21]。實驗結果顯示,與NS 組相比,多柔比星藥物濃度為3 mg/kg 時心臟組織中凋亡蛋白Cleaved-caspase3 的表達量未見明顯增高,Bax/Bcl2 比值也無明顯上升(P＞0.05)。而當藥物濃度達到4 mg/kg 后,與NS 組相比,Bax/Bcl2 比值明顯增加,有統計學差異,Cleaved-caspase3 的表達量增加,但無統計學意義(P＞0.05)。當給藥濃度為5～6 mg/kg 時,Bax/Bcl2 比值與Cleaved-caspase3 表達均明顯增加,見圖2A～2F。

圖2 不同濃度多柔比星對心肌細胞凋亡的影響(n=6)Note.A～D,Representative Western blot of Cleaved-caspase3、Bax、Bcl2 and GAPDH protein expression.E,A statistical chart of Cleaved-caspase3 relative expression levels.F,Statistical diagram of the ratio of Bax protein relative level expression to Bcl2 protein relative level expression.Compared with normal saline group,***P＜0.001,*P＜0.05,nsP＞0.05.Figure 2 Effects of different concentrations of doxorubicin on myocardial apoptosis

2.3 不同濃度多柔比星對小鼠心肌纖維化的影響

通過對心臟組織進行天狼猩紅染色,結果顯示:3 mg/kg 多柔比星組與NS 組相比,膠原纖維沉積較少,心肌纖維化程度不明顯,無統計學差異(P＞0.05),見圖3A、3B。當多柔比星劑量達到4 mg/kg以上時,與NS 組相比,心臟組織中可見明顯的膠原纖維沉積,心肌纖維化程度加重,有統計學差異(P＜0.05),圖3A、3B。橫向比較不同濃度多柔比星給藥組組間差異發現,小鼠心臟心肌纖維化程度并未隨著多柔比星給藥濃度的增加而上升,可能是小鼠心臟纖維化程度不具備明顯的劑量依賴性特征,或者是給藥后觀察時長不夠導致。

圖3 不同濃度多柔比星對小鼠心肌纖維化的影響(n=6)Note.A,Mice cardiomyocytes Sirius scarlet dye.B,Statistical map of the proportion of cardiac fibrosis in mice.Compared with normal saline group,*P＜0.05,nsP＞0.05.Figure 3 Effects of different concentrations of doxorubicin on myocardial fibrosis in mice

2.4 不同濃度多柔比星對小鼠心肌細胞萎縮的影響

前期通過對小鼠的一般情況進行統計,發現多柔比星呈劑量依賴性降低小鼠的心臟重量,說明多柔比星可能導致心臟萎縮。通過對小鼠心臟組織進行WGA 染色發現,3 mg/kg 濃度造模組與NS 組相比,小鼠單個心肌細胞大小未見明顯縮小,無統計學差異(P＞0.05)。而當多柔比星濃度達到4 mg/kg 以上時,小鼠單個心肌細胞可見明顯縮小,差異具有統計學意義(P＜0.05),見圖4。

圖4 不同濃度多柔比星對小鼠心肌細胞萎縮的影響(n=6)Note.A,Mice cardiomyocytes wheat germ lectin staining.B,Statistical diagram of the effect of doxorubicin at different concentrations on the crosssectional area of myocardial cells in mice.Compared with normal saline group,*P＜0.05,nsP＞0.05.Figure 4 Effects of different concentrations of doxorubicin on myocardial cell atrophy in mice

3 討論

多柔比星為臨床上治療實體腫瘤的經典藥物,臨床研究發現長期使用多柔比星會增加腫瘤病人患心血管疾病的風險,以心律失常、左室功能障礙、充血性心力衰竭等為主,其原因多數認為是多柔比星隨劑量及時間累積對心肌細胞損傷導致的凋亡、萎縮以及對心肌纖維化的促進作用共同導致的心室重構[3],在基礎病理生理學以及藥理學研究中,小鼠腹腔注射多柔比星是常用的體內模型[5],可以很好地模擬臨床患者化療后誘發的心臟毒性。

多柔比星除了急性大劑量心臟損傷外,小劑量隨時間和劑量蓄積是目前模型使用非常多的造模方式,但因為國內外文獻中對多柔比星誘導心臟模型的給藥濃度與給藥時長不同,且未有統一定論[13,22],前期課題組研究發現多柔比星損傷劑量與致死量窗口非常窄,導致模型難以重復,本研究觀察不同劑量多柔比星在一定時間(4 周)內蓄積后體重,心臟重量,生存率及病理學指標如凋亡、萎縮、纖維化等指標,尋找比較合適的造模劑量。從實驗結果可以看出,隨著多柔比星藥物濃度增加,小鼠體重和心臟重量下降,生存率下降,但給藥濃度低于4 mg/kg 則指標惡化不明顯,高于6 mg/kg 后小鼠大量死亡,提示4～6 mg/kg 的給藥濃度是較合適的造模方法。

多柔比星導致心室重構的主流觀點是引起心臟萎縮[23-24],在本研究中,我們使用了不同劑量的多柔比星對小鼠心肌質量的影響進行評估。研究發現當多柔比星給藥濃度達4 mg/kg,且體內藥物累積劑量達40 mg/kg 時,小鼠的心臟指數顯著下降,與目前的臨床給藥方案范圍接近,且與臨床實驗中發現的當人體內多柔比星的累積劑量接近為30 mg/m2,會發生亞急性心肌萎縮的結論一致[25]。對心肌細胞橫截面積統計,進一步發現當多柔比星藥物濃度達4 mg/kg 是心肌細胞萎縮的開始,顯微鏡下可見心臟中段橫截面積與心肌細胞橫截面積明顯縮小。既往有觀點認為心肌細胞凋亡亦可能導致了心臟萎縮[26-27],本次課題組對心肌組織的凋亡標志蛋白Cleaved-caspase3、Bax、Bcl2 的觀察佐證了此觀點:3 mg/kg 濃度的多柔比星組凋亡蛋白Cleaved-caspase3 表達及Bax/Bcl2 比值相較NS 組未見明顯上升,而當多柔比星濃度達到4 mg/kg 后,心臟中凋亡蛋白Cleaved-caspase3 的表達及Bax/Bcl2 的比值均明顯上升。在4～6 mg/kg 給藥濃度范圍內可見凋亡蛋白Cleaved-caspase3 的表達及Bax/Bcl2 的比值呈劑量依賴性上升,課題組不同劑量多柔比星對乳鼠心肌細胞凋亡的體外研究(數據未發布)亦佐證了體內的趨勢。

除了心肌細胞萎縮、凋亡外,心肌纖維化也是導致心室重構的另一中病理表現[28]。為了探討不同濃度多柔比星對小鼠心臟纖維化程度的影響,課題組對不同劑量多柔比星處理后小鼠的心臟石蠟切片采用天狼猩紅染色,結果顯示3 mg/kg 多柔比星組小鼠相較NS 組心肌纖維化比例未見明顯增加,當多柔比星濃度達到4 mg/kg 時,可見明顯的膠原沉積在心臟間質中,心肌纖維化加重,4～6 mg/kg模型組小鼠心肌纖維化程度明顯比3 mg/kg 模型組嚴重,但3 組模型組組間兩兩比較發現,小鼠心肌纖維化程度大約一致,并未隨著多柔比星濃度與劑量的進一步增多而加重,可能是由于多柔比星劑量累積到一定程度后,小鼠心臟纖維化程度不具備明顯的劑量依賴性特征,或者是給藥后觀察時長不夠導致。

本研究尚存一些不足之處,未對小鼠心功能、血流動力學等指標進行檢測,但是本研究通過心臟重量、心脛比、心重比、心臟組織HE 染色、WGA 染色、天狼猩紅染色及凋亡蛋白檢測等指標從側面反映了多柔比星可誘導小鼠心室重構,相較心超更具說服力。本研究也未從藥物時間依賴性角度對多柔比星誘導小鼠心臟損傷進行研究,有待后續更進一步深入探討。

綜上所述,當多柔比星給藥濃度達到4 mg/kg時,小鼠心臟結構發生改變,可見心臟縮小,心肌細胞萎縮,心肌細胞凋亡及心肌纖維化等,當給藥濃度達到7 mg/kg 時,小鼠多數死亡,反應出多柔比星造模小鼠心臟損傷窗口比較窄,4～6 mg/kg 可作為多柔比星誘導小鼠慢性心臟損傷模型的參考濃度。本實驗從整體上對不同濃度給藥劑量的多柔比星模型組的誘導的心臟損傷加以全面地評價、分析并提供安全、可靠的給藥劑量。