小鼠第13.5 天胚肝細胞誘導HepG2 細胞分化的作用機制

肖志剛 鄭 麗 王梓瀛 劉 昆 王 瑜齊錦生*栗彥寧

(1.河北醫科大學中西醫結合學院,石家莊 050017；2.河北醫科大學實驗動物學部,石家莊 050017；3.邢臺醫學高等?？茖W校,河北 邢臺 054000)

原發性肝癌是全球第四位的致死性癌癥,我國肝癌發病人數占全球一半以上,其中,肝細胞來源的肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)約占90%,是原發性肝癌中最常見的類型[1]。目前,針對HCC 治療主要以手術切除為主,切除率低及復發率高等,嚴重影響了病人生存率,亟需治療新思路[2-3]?；谂咛ジ杉毎湍[瘤細胞有很多共同特性,例:可塑性、永生化、免疫逃逸等,齊錦生教授提出“同源同步誘導分化”理論,即腫瘤是發育受阻于某個階段而無限增殖的“干細胞”或是“返祖細胞”,而胚胎發育過程包含了所有組織細胞的所有發展階段,用相同組織來源、發育階段匹配的胚胎干細胞可誘導相應腫瘤細胞分化,且根據越原始越相似的理論,這種誘導作用是不受種屬限制的[4-6]。在此理論指導下,本課題組前期研究證實小鼠第13.5 天胚肝細胞可誘導HepG2 細胞株分化,但機制尚未闡明[5-6]。已知,高度保守的Wnt/β-Catenin 信號通路與發育、分化等密切相關,也是促進HCC 分化的重要因素[7-8]。那么,小鼠第13.5 天的胚肝細胞是否通過調控β-Catenin,誘導HepG2 細胞株分化,尚不清楚。本文以小鼠第13.5 天胚肝細胞與HepG2 細胞株體外共培養模型,研究了小鼠第13.5 天胚肝細胞調控β-Catenin,誘導HepG2 細胞株分化機制,為HCC 治療提供新的理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

清潔級健康KM 小鼠,雄鼠30 只,雌鼠90 只,體重25～30 g,6～8 周齡,由河北醫科大學實驗動物中心提供[SCXK(冀)2018-004],飼養條件如下:自由進食和飲水,溫度約25℃,濕度約50%,12 h 光照/12 h 黑暗,在河北醫科大學實驗動物中心飼養動物[SYXK(冀)2018-008],動物實驗經由實驗動物管理委員會批準(2018-0042),實驗過程中嚴格遵循實驗動物使用的3R 原則,給予人道主義關懷。

1.1.2 細胞

人肝癌細胞HepG2,購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫(TCHu 72)。

1.2 主要試劑與儀器

胎牛血清購自北京全式金公司(貨號:FS101)；Gibco 的DMEM 培養基(貨號:C11885500BT)購自Life Technology 公司；Millicell 細胞培養小室(貨號:PICMORG50)購自美國Millipore 公司；β-Catenin 抑制劑XAV-939 購自Selleck(貨號:S1180)；白蛋白(ALB,貨號:sc-271605)、甲胎蛋白(AFP,貨號:sc-8399)、肝細胞核因子4α(HNF-4α,貨號:sc-374229)、β-Catenin 抗體(貨號:sc-7963)、β-actin(貨號:sc-8432)購自美國Santa Cruz 公司；TRITC 標記二抗(貨號:BA1089) 購自博士德公司；DAPI (2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride,貨號:D9542-1MG)購自SIGMA 公司；TRIzol 試劑(貨號:15596-026)購自美國Invitrogen 公司；反轉錄試劑盒(貨號:K1622)購自Thermo Fisher Scientific 公司；qPCR 試劑盒(SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ,貨號:RR820A)購自日本TaKaRa 公司；PCR 引物由上海捷瑞生物工程技術服務有限公司合成；0.45 μm PVDF 膜(貨號IPVH00010)購自美國Merk miliplore公司。二氧化碳培養箱(英國NEW BRUNSWICK 公司,型號:Galaxy 170R)；體視顯微鏡(德國Leica 公司產品,型號:S9)；倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS 公司產品,型號:IX-51)；PCR 儀(美國Thermo 公司產品,型號:PX2)；實時熒光定量PCR儀(中國香港Gene 公司產品,型號:Corbett Rotor-Gene 3000)；Odyssey 雙色紅外熒光成像系統(中國香港Gene 公司產品,型號:9120)。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠第13.5 天胚肝細胞分離純化

采用本實驗室方法,用6～8 周齡KM 小鼠,雌鼠:雄鼠=3 ∶1 合籠,次日出現陰栓日期為妊娠0.5 d,取13.5 d 孕鼠,消毒,在體視顯微鏡下取出胚肝,分離成小塊,采用Ⅳ型膠原酶消化。過濾網后,采用差速貼壁法純化胚肝細胞,常規培養,備用于鑒定及共培養實驗[5-6]。

1.3.2 小鼠第13.5 天胚肝細胞與HepG2 細胞株的共培養

將HepG2 細胞株置于37℃、5% CO2細胞培養箱中培養。培養液為高糖培養基,含1%的非必需氨基酸,10%的新生牛血清。利用“Transwell”小室建立小鼠第13.5 天胚肝細胞與HepG2 細胞株的非接觸式共培養模型,1 mL 胚肝細胞(每毫升1×106個)培養于六孔板中“Transwell”小室上層膜上,2 mL HepG2(每毫升5×104個)培養于六孔板中,于37℃、5% CO2細胞培養箱中培養。分為對照組、共培養組,培養24、48 h 后檢測相關指標。

1.3.3 β-Catenin 抑制劑處理及分組

建立小鼠第13.5 天胚肝細胞與HepG2 細胞株的共培養模型后,給予β-Catenin 抑制劑XAV-939處理,分為對照組、XAV-939 組(1 μmol/L)、共培養+XAV-939 組(1 μmol/L)、共培養組,作用48 h 后,相差顯微鏡觀察HepG2 細胞株形態,同時檢測AFP、β-Catenin 的蛋白含量。

1.3.4 免疫熒光法檢測ALB 的分布

取原代胚肝細胞,4%多聚甲醛固定后,1%的TritonX-100 室溫下處理30 min,10%山羊血清37℃封閉1 h。棄除封閉液,加入AFP 抗體(1:50),4℃孵育過夜,加入FITC 標記二抗(1 ∶50),避光37℃孵育1 h,加入細胞核染色液DAPI,避光室溫作用15 min,滴加適量的抗熒光衰減封片液(50%甘油),蓋玻片封片后熒光倒置顯微鏡下觀察、拍照。ALB 的染色為綠色,細胞核的染色為藍色。采用Image Pro Plus 6.0 版軟件計數3 個隨機視野中免疫熒光陽性細胞。

1.3.5 qRT-PCR 檢測mRNA 水平

收集共培養24 h、48 h 的HepG2 細胞株,采用TRIzol 法提取RNA,并測定RNA 濃度。按照試劑盒進行反轉錄和PCR 反應。PCR 反應條件:95℃30 s,95℃5 s,60℃20 s,72℃20 s,第2 步至第3 步進行40 個循環。以β-actin為內參,采用2-ΔΔCt計算相關基因的mRNA 的相對表達量。引物見表1。

表1 Real-time PCR 引物序列Table 1 Primers for Real-time PCR

1.3.6 Western blot 檢測蛋白含量

共培養及β-Catenin 抑制劑處理48 h 后,收集HepG2 細胞株,用RIPA 裂解液進行裂解,取上清至預冷的EP 管中,即為細胞總蛋白提取物。蛋白精準定量后,取蛋白樣品每孔150 μg 經SDS-PAGE 電泳分離后將蛋白轉至PVDF 膜上,5%脫脂牛奶封閉后,一抗封閉(5%牛奶1 ∶200 稀釋),4℃過夜,二抗(5%牛奶1 ∶2000 稀釋)室溫孵育2 h,采用Odyssey雙色紅外熒光成像系統讀取圖像。將所得圖片用美國UVP 公司LabWorks 4.5 軟件對條帶進行定量分析,計算目的條帶的灰度值。

1.3.7 免疫熒光法檢測β-Catenin 的分布

方法同1.3.2,共培養48 h 的HepG2 細胞株,使用β-Catenin 抗體(1:50)和TRITC 標記的二抗,檢測β-Catenin 蛋白的分布。β-Catenin 的染色為紅色,細胞核的染色為藍色。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件進行統計學分析,所得結果采用平均數±標準差()。兩組之間采用獨立樣本t檢驗分析,多組之間分析先進行方差齊性檢驗,組間比較采用One-Way-ANOVA 法,進一步兩兩比較,采用LSD-t檢驗,P＜0.05 為有統計學差異。

2 結果

2.1 小鼠13.5 天胚肝細胞的鑒定

原代胚肝細胞分離培養后,用免疫熒光法檢測肝細胞標記分子ALB 蛋白的分布。結果顯示,91.84%的ALB 熒光染色陽性,見圖1。

圖1 小鼠第13.5 天胚肝細胞鑒定Note.a,Bright field.b,ALB fluorescence.c,DAPI fluorescence.d,ALB and DAPI fluorescence merge.Figure 1 Identification of 13.5 day mouse embryo hepatocytes

2.2 qRT-PCR 檢測相關基因的mRNA 表達水平

與對照組相比,共培養HepG2 細胞株中AFP相對mRNA 表達量在24 h 和48 h 均顯著降低(P＜0.05,P＜0.01),HNF-4α相對mRNA 表達量在24 h和48 h 均顯著升高(P＜0.05,P＜0.01),CYP1B1 mRNA 的相對表達量在24 h 無明顯差異,48 h 顯著升高(P＜0.01),ADH1CmRNA 的相對表達量在24 h 無明顯差異,48 h 顯著升高(P＜0.01),見圖2。

圖2 共培養后相關基因mRNA 表達水平Note.Compared with the control group,*P＜0.05,**P＜0.01.Figure 2 mRNA expression levels of related genes after co-culture

2.3 顯微鏡下觀察細胞形態變化

對照組HepG2 細胞株生長旺盛、密度大,形態呈多角形或梭形,胞漿透亮,細胞核多且形狀不規則。與小鼠第13.5 天胚肝細胞共培養48 h 后,HepG2 細胞株生長受到明顯抑制,形態多為六邊形,接近正常成熟肝細胞,胞漿透亮度下降,細胞核多為單核,見圖3。

圖3 對照組和共培養組HepG2 細胞株的形態Note.a,Control group.b,Co-culture group.Figure 3 Morphology of HepG2 cells in the control group and co-culture group

2.4 Western blot 法檢測 AFP、HNF-4α、β-Catenin 的蛋白含量

與小鼠第13.5 天胚肝細胞共培養48 h 后,提取總蛋白,Western blot 法檢測HepG2 細胞株中,AFP、HNF-4α、β-Catenin 的蛋白含量。計算Western blot 條帶灰度值并統計,發現與對照組相比,AFP 蛋白含量在共培養組(P＜0.05)顯著降低,HNF-4α 蛋白含量在共培養組顯著升高(P＜0.05)。同時,與對照組相比,β-Catenin 蛋白含量在共培養組顯著下降(P＜0.05),見圖4。

圖4 共培養HepG2 細胞株中AFP、HNF-4α 和β-Catenin 的蛋白表達Note.Compared with the control group,*P＜0.05.Figure 4 Protein expression levels of AFP、HNF-4 and β-Catenin in co-culture group

2.5 免疫熒光檢測β-Catenin 的分布

與小鼠第13.5 天胚肝細胞共培養48 h 后,免疫熒光法檢測HepG2 細胞株中β-Catenin 的分布。結果可見,對照組HepG2 細胞株增殖旺盛,β-Catenin 的熒光染色明顯,提示其高含量；相比于對照組,共培養組HepG2 細胞株數量明顯減少,β-Catenin 的熒光強度顯著減弱。結果驗證了,與小鼠第13.5 天胚肝共培養后,HepG2 細胞株中β-Catenin 的含量減少,見圖5。

圖5 HepG2 細胞株中β-Catenin 的分布Note.a,Bright field in the control group.b,β-Catenin fluorescence in the control group.c,DAPI fluorescence in the control group.d,β-Catenin and DAPI fluorescence merge in the control group.e,Bright field in the co-culture group.f,β-Catenin fluorescence in the co-culture group.g,DAPI fluorescence in the co-culture group.h,β-Catenin and DAPI fluorescence merge in the co-culture group.Figure 5 Distribution of β-Catenin in HepG2 cells

2.6 抑制β-Catenin 引起HepG2 細胞株形態變化

與對照組HepG2 細胞株相比,β-Catenin 抑制劑XAV-939 處理后,細胞生長受到抑制,胞漿透亮度下降,細胞形態不規則,趨于死亡。而相對于共培養組,β-Catenin 抑制劑XAV-939 處理后,細胞形態變化的基礎上,接近崩解,見圖6。

圖6 抑制β-Catenin 引起HepG2 細胞株的形態變化Note.a,Control group.b,XAV-939 group.c,Co-culture group.d,Co-culture+XAV-939 group.Figure 6 Morphology of HepG2 cells induced by inhibition β-Catenin

2.7 抑制β-Catenin 減少AFP 的蛋白含量

對照及共培養HepG2 細胞株,β-Catenin 抑制劑XAV-939 處理48 h 后,Western blot 法檢測AFP 和β-Catenin 的蛋白含量。與對照組相比,AFP 蛋白含量和β-Catenin 蛋白含量在XAV-939 組顯著降低(P＜0.01)；同時,與共培養組相比,AFP 蛋白含量和β-Catenin 蛋白含量在共培養+XAV-939 組顯著降低(P＜0.01),見圖7。

圖7 抑制β-Catenin 減少AFP 的蛋白含量Note.Compared with the control group and the co-culture group,**P＜0.01.Figure 7 Reduced AFP protein content induced by inhibition β-Catenin

3 討論

目前,針對殺死腫瘤細胞的治療策略,不能達到完全治愈腫瘤的目的,反而會產生嚴重的毒副作用。因此,我們必須改變思路。胚胎微環境是誘導腫瘤細胞分化的天然而有效的治療良方[4,9],然而,并不是所有的胚胎誘導腫瘤細胞分化的實驗都能取得成功[10],因此有必要探尋其內在的誘導機制。

根據腫瘤細胞和胚胎干細胞之間的相似性[11-12],齊錦生教授提出“同源同步誘導分化”理論[5-6]。有證據表明,HCC 細胞表達胚胎抗原、具有無限增殖等胚肝細胞的特性[12-13]。在“同源同步誘導分化”理論的指導下,我們前期的實驗證實,特定發育階段的雞胚或小鼠胚肝細胞可誘導HepG2 細胞株分化[6]。

鑒于小鼠胚肝細胞是在胚胎發育第12～15 天分化成熟[14],我們用小鼠第13.5～14.5 天胚肝細胞與HepG2 細胞株共培養,能抑制HepG2 細胞株增殖,促進其分化成熟[5-6]。HNF-4α 在肝發育和肝細胞功能形成中,發揮著不可或缺的關鍵作用,也是控制肝細胞分化的關鍵因子[15-16]。

本實驗用免疫熒光法檢測小鼠第13.5 天胚肝細胞中肝細胞標記分子ALB 蛋白表達,結果顯示絕大部分細胞的ALB 熒光染色陽性,說明小鼠第13.5天胚肝細胞成功分離培養。HepG2 細胞株與小鼠第13.5 天胚肝細胞共培養后,肝癌標記分子AFP相對mRNA 表達量降低,而肝細胞分化調控因子HNF-4α,成熟肝細胞標記分子CYP1B1、ADH1C基因相對mRNA 表達量升高。并且與小鼠13.5 天胚肝細胞共培養可誘導HepG2 細胞株的形態趨于正常肝細胞樣。Western blot 結果顯示HepG2 細胞株中AFP、HNF-4α 蛋白在共培養后表達變化與相對mRNA 表達變化相一致。這表明,小鼠第13.5 天胚肝細胞共培養可抑制HepG2 細胞株中AFP 表達,上調HNF-4α 表達,誘導HepG2 細胞株分化。而HNF-4α 還調控很多成熟肝細胞特異酶的表達,如CYP1B1和ADH1C等。本實驗也證實,與小鼠第13.5 天胚肝細胞共培養,可上調HepG2 細胞株中CYP1B1和ADH1C的表達。然而,小鼠第13.5 天胚肝細胞是通過什么信號通路,誘導HepG2 細胞株分化成熟呢?

已知Wnt/β-Catenin 信號通路是一個高度保守的,調控胚胎發育、細胞增殖和分化的重要信號通路[17]。肝細胞分化過程中,Wnt/β-Catenin 信號通路起關鍵調控作用,而其紊亂或過度激活,則導致HCC 的發生發展[7-8]。Western blot 和免疫熒光結果均顯示與小鼠13.5 天胚肝共培養后,HepG2 細胞株中β-Catenin 蛋白含量下降。這說明與小鼠第13.5 天胚肝細胞共培養可顯著抑制HepG2 細胞株中β-Catenin 的含量和分布。加入β-Catenin 抑制劑后,HepG2 細胞株出現明顯的形態變化,細胞趨于死亡,采用Western blot 方法檢測蛋白表達,發現抑制β-Catenin 可減少HepG2 細胞株以及共培養的HepG2 細胞株中AFP 蛋白含量。這說明抑制β-Catenin 可引起對照組及共培養組HepG2 細胞株明顯的形態變化,減少AFP 蛋白含量。但是,抑制β-Catenin 并不能完全模擬小鼠第13.5 天胚肝細胞共培養的效果?？傊?這說明,小鼠第13.5 天胚肝細胞共培養很可能是主要通過抑制Wnt/β-Catenin 信號通路,促使HepG2 細胞株分化成熟的。

然而,小鼠第13.5 天胚肝細胞還通過哪些信號通路,及怎樣抑制β-Catenin,誘導HepG2 細胞株分化成熟,還需進一步的深入探討。此外,胚胎發育和免疫形成之間亦是存在緊密的聯系[10]。因此,胚胎誘導分化與免疫治療之間內在的聯系和機制,也需不斷探討揭示[18]。

總之,本研究揭示,小鼠第13.5 天胚肝細胞共培養可能主要通過抑制β-Catenin,誘導HepG2 細胞株分化成熟。