青海亞麻籽油甘三酯指紋圖譜構建及摻偽識別的研究

王興瑞，韓玉澤，李應霞，王淑珍，陳昀昀，王進英,2

(1.青海大學 農牧學院，西寧810016； 2.青海大學 三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室，西寧810016)

亞麻，是我國重要的經濟作物，主要分布在我國西北和華北北部干旱、半干旱地區[1]。其中，青海省亞麻種植歷史悠久，其特有的高原地理和氣候特征使得亞麻成為青海省一種具有栽培價值的油料作物。亞麻籽油是以油用亞麻為原料制備的一種干性油[2]，油中α-亞麻酸含量可達50%～60%[3]。α-亞麻酸是維持機體正常生理功能和生長發育的必需脂肪酸[4]，具有提高免疫力、降血壓、降血脂、預防心腦血管疾病等功能[5]。因此，亞麻籽油具有很好的市場前景。

由于亞麻籽油優越的營養價值和經濟價值，其摻偽現象時有發生。目前，對植物油摻偽識別主要是通過測定植物油中的脂肪酸、甾醇、揮發性組分等成分來完成。但是，對于植物油中脂肪酸和甾醇等成分的測定并不能完全區分植物油的類別[6]。甘三酯(TAG)是植物油中的主要成分，且每種類型的植物油都有其特有的TAG特征[7]，所以對植物油TAG的測定可為植物油質量控制和摻偽識別提供參考[8]。

目前對于植物油TAG的檢測方法主要有氣相色譜法和液相色譜法[9]，但氣相色譜法需要在高溫(>350℃)條件下進行，高溫環境可能導致色譜柱劣化和TAG降解[10]，還不容易確定TAG的異構體結構和雙鍵數目[11]，影響檢測效果。液相色譜法則適用于大多數非揮發性成分的測定，根據各脂肪酸鏈長和不飽和度的不同，進而實現對單個TAG分子的分離[9]。對于液相色譜法檢測TAG，折光率檢測器常用于常規和等度分析[12]；紫外檢測器在極低波長(205～210 nm)下顯示出良好的線性響應[13]，但對飽和TAG的檢測靈敏度較低；與高效液相色譜-紫外檢測器相比，蒸發光散射檢測器(ELSD)靈敏度更高，適用性更好[14]。近年來，HPLC-ELSD法被廣泛應用于植物油TAG組分的測定。Marwa等[15]利用HPLC-ELSD法建立了特級初榨橄欖油TAG指紋圖譜，可實現對橄欖油品種和成熟度的鑒別；Zhang等[14]用HPLC-ELSD法測定了杜仲籽油的TAG含量；皇甫志鵬等[16]利用HPLC-ELSD法建立了純芝麻油的TAG指紋圖譜數據庫，可對摻偽大豆油和葵花籽油比例達到3%的芝麻油做出準確的判定。

本研究以青海省亞麻籽油為研究對象，利用HPLC-ELSD法測定分析了青海亞麻籽油中TAG組成分布情況，構建了亞麻籽油TAG指紋圖譜，利用指紋圖譜對亞麻籽油進行摻偽識別，旨在開發一種快速、簡便的亞麻籽油摻偽檢測方法，為青海省亞麻籽油的質量監控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

40種青海亞麻籽樣品信息見表1；大豆油、玉米油、菜籽油、花生油、葵花籽油、芝麻油，購于京東廣生林食品專營店。色譜純異丙醇、色譜純乙腈，美國天地試劑公司。

表1 40種青海亞麻籽樣品信息

1.1.2 儀器與設備

Shimadzu LC-20AD高效液相色譜儀(配備有CMB-20A控制器、LC-20AD二元泵、SIL-20A 自動進樣器和CTO-10AS柱溫箱)，日本Shimadzu公司；2000ES-蒸發光散射檢測器，美國奧泰科技(中國)有限公司；ZORBAX SB-C18分析型色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，美國Agilent公司；XW-80A渦旋混合器；FA2004B電子天平。

1.2 試驗方法

1.2.1 亞麻籽油的制備

亞麻籽清理、分揀、粉碎后得到亞麻籽粉，利用索氏抽提法(提取溶劑為石油醚，料液比0.06∶1，提取溫度70℃，提取時間8 h)提取亞麻籽油，低溫旋蒸除去石油醚后備用。40種亞麻籽QH-1～QH-40制備的亞麻籽油對應編號為S1～S40。

1.2.2 HPLC-ELSD法分析亞麻籽油中TAG組成

1.2.2.1 樣品制備

精確稱取(50.0±0.1)mg亞麻籽油，用異丙醇充分渦旋混勻溶解后，定容于10 mL容量瓶中。樣品經0.45 μm濾膜過濾后，進樣分析。

1.2.2.2 HPLC-ELSD法測定條件

參照王進英等[17]測定油茶籽油甘三酯組成的方法，并對梯度洗脫程序進行優化，最終色譜條件為：ZORBAX SB-C18分析型色譜柱(4.6 mm ×250 mm, 5 μm)；柱溫25℃；流動相A為乙腈，流動相B為異丙醇，流動相梯度洗脫程序見表2；流速0.8 mL/min，進樣量10 μL；漂移管溫度80℃；空氣流速2.8 L/min；增益1。

表2 流動相梯度洗脫程序

1.2.3 方法學考察

1.2.3.1 精密度試驗

取同一種亞麻籽油(S1)，按照1.2.2.1的方法進行處理，連續進樣分析6次，計算亞麻籽油中各TAG組分峰面積的相對標準偏差(RSD)和保留時間的RSD。

1.2.3.2 重復性試驗

取同一種亞麻籽油(S1)，按照1.2.2.1的方法制備6份樣品進樣分析，計算亞麻籽油中各TAG組分峰面積的RSD。

1.2.3.3 穩定性試驗

取同一種亞麻籽油(S1)，按照1.2.2.1的方法進行處理后，在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后進樣分析，計算亞麻籽油中各TAG組分峰面積的RSD。

1.2.4 青海亞麻籽油TAG指紋圖譜的構建

將40種亞麻籽油樣品按1.2.2方法進行分析，得到S1～S40共40個原始圖譜。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004 A)，設立參照圖譜，經多點校正、自動匹配，得到亞麻籽油TAG標準指紋圖譜。

1.2.5 摻偽模型建立

按大豆油、玉米油、菜籽油、花生油、葵花籽油和芝麻油，質量分數分別為5%、10%、20%、30%、40%、50%，將其與亞麻籽油混合，按照1.2.2.1的方法制備樣品，建立摻偽模型。

1.2.6 數據處理及統計

所有數據平行測定3次，結果取平均值，采用Microsoft Excel 2010和SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析，Origin 2018作圖。

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化

亞麻籽油TAG在不同梯度洗脫條件下的液相色譜圖見圖1。由圖1可以看出，優化前亞麻籽油中TAG組分出峰時間主要集中在5～20 min，優化后的洗脫程序可以對色譜峰實現更好的分離，分析時間縮短至50 min，同時大大節省了試劑用量。

圖1 亞麻籽油TAG在不同梯度洗脫條件下的液相色譜圖

2.2 7種植物油TAG的定性、定量分析

2.2.1 定性分析

在相同色譜條件下，分析大豆油、玉米油、菜籽油、花生油、葵花籽油、芝麻油6種植物油的TAG組成?；赥AG按照ECN數(ECN=CN(碳原子數)-2DN(雙鍵數目))由小到大分離的規律[17]，7種植物油TAG的液相色譜圖如圖2所示。由圖2可知：菜籽油中峰7峰面積最大，根據安廣杰[18]、Yasushi[19]等對菜籽油中TAG組分的研究，OOO(ECN=48,O為油酸)是菜籽油中含量最高的TAG組分(分別占比34.99%和28.7%)，故將保留時間為19.45 min的峰7定性為ECN48分區；大豆油、玉米油和葵花籽油中峰5a峰面積最大，根據Salghi等[20]對大豆油、Zhang等[21]對玉米油和Sara等[22]對葵花籽油中TAG組分的研究，LLO(ECN=44，L為亞油酸)是其最主要的TAG組分，故將14.61 min出現的峰5a定性為ECN44分區；芝麻油在16.83 min出現的峰6a峰面積最大，根據皇甫志鵬[16]、Sara[22]等的研究，OOL(ECN=46)是其最主要的TAG組分(分別占比31.43%、17.43%)，故將此峰定性為ECN46分區;結合文獻[23-25,7]的研究，將12.76 min出現的峰4a定性為LLL(ECN42分區)；再結合文獻[26，27-30]對亞麻籽油中TAG含量分布的研究，可以推斷亞麻籽油中峰1為LnLnLn(ECN36，Ln為亞麻酸)，峰2為LLnLn(ECN38)，峰3為OLnLn(ECN40)，峰4b為OLLn(ECN42)，峰5b為OLnO(ECN44)，峰6b為SOLn(ECN46，S為硬脂酸)，峰7為OOO(ECN48)，峰8為POO(ECN48，P為棕櫚酸)。

圖2 7種植物油TAG的液相色譜圖

2.2.2 定量分析

采用峰面積歸一化法對青海不同產地亞麻籽油TAG組分進行定量分析，結果見表3。

表3 青海不同產地亞麻籽油TAG含量分布情況

由表3可知，青海省四個產區亞麻籽油中各TAG含量差異不顯著(P>0.05)，但相同產區亞麻籽油中各TAG組分有顯著差異(P<0.05)。不同ECN分區中ECN40分區的相對含量最高，平均為 29.40%(P<0.05)；其次是ECN36，平均為23.71%(P<0.05)；在ECN38、ECN42、ECN44分區中，其TAG含量相近。TAG含量大小順序為OLnLn(29.40%)>LnLnLn(23.71%)>OLnO(15.10%)>OLLn(13.43%)>LLnLn(13.32%)>SOLn(2.84%)>OOO(1.56%)>POO(0.18%)。由此可得，青海亞麻籽油TAG組分主要是以亞麻酸(Ln)、油酸(O)、亞油酸(L)為主的長碳鏈型不飽和脂肪酸甘三酯，這與楊青坪[26]對亞麻籽油TAG組分研究的結論一致。另外，對比本實驗室對青海亞麻籽油脂肪酸含量的測定結果(亞麻酸(Ln)42.14～60.39 g/100 g，油酸(O)12.45～26.14 g/100 g，亞油酸(L)10.30～15.04 g/100 g，棕櫚酸(P)4.13～5.54 g/100 g，硬脂酸(S)2.62～5.09 g/100 g)，發現各TAG含量與脂肪酸含量基本吻合，脂肪酸含量影響TAG含量。

亞麻籽油與6種用于構建摻偽模型的植物油之間的TAG含量分布情況見表4。由表4可知，亞麻籽油的TAG組成與6種摻偽植物油的TAG組成有較大差異，6種植物油TAG主要集中在ECN42～48(LLL、LLO、OOL、OOO)分區，而亞麻籽油中TAG主要為ECN40和ECN36。亞麻籽油中LnLnLn、LLnLn、OLnLn、OLLn含量與其他6種植物油的差異顯著(P<0.05)，亞麻籽油獨特的TAG組成也為亞麻籽油摻偽識別提供了可能性。

表4 7種植物油的TAG含量分布情況

2.3.1 精密度試驗

試驗表明，LnLnLn、LLnLn、OLnLn、OLLn、OLnO、SOLn、OOO、POO的峰面積RSD分別為0.16%、0.23%、0.09%、0.11%、0.21%、0.30%、0.11%、0.21%，保留時間RSD分別為0.04%、0.04%、0.05%、0.07%、0.09%、0.12%、0.15%、0.21%，說明精密度良好。

2.3.2 重復性試驗

試驗表明，LnLnLn、LLnLn、OLnLn、OLLn、OLnO、SOLn、OOO、POO的峰面積RSD分別為1.15%、1.21%、1.30%、1.67%、0.93%、1.37%、1.67%、1.41%，說明該方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗

試驗表明，LnLnLn、LLnLn、OLnLn、OLLn、OLnO、SOLn、OOO、POO的24 h內峰面積RSD分別為0.31%、0.61%、0.20%、0.09%、0.13%、0.79%、0.18%、0.20%，說明樣品制備后24 h內穩定性良好。

2.4 青海亞麻籽油TAG指紋圖譜的構建

按照1.2.4的方法，得到亞麻籽油S1～S40的原始液相色譜圖和亞麻籽油TAG的標準指紋圖譜，分別如圖3、圖4所示。

指紋圖譜的相似度表明指紋圖譜的整體相關性，計算各油樣的相似度可以對油樣進行更系統的評定[31]。將亞麻籽油標準指紋圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004 A)，對比40種亞麻籽油TAG液相色譜圖，其相似度均大于0.98，表明構建的標準指紋圖譜符合指紋圖譜研究的技術要求[32]，可以在一定程度上代表青海亞麻籽油樣品的整體性。

注：圖中由下至上為亞麻籽油S1～S40。

注：1.LnLnLn；2.LLnLn；3.OLnLn；4.OLLn；5.OLnO；6.SOLn； 7.OOO； 8.POO。

2.5 TAG指紋圖譜在青海亞麻籽油摻偽識別中的應用

比較1.2.5中建立的6種植物油摻偽模型液相色譜圖與亞麻籽油TAG標準指紋圖譜的相似度，對摻偽比例和相似度進行二項式擬合，結果見表5。

表5 各摻偽模型與指紋圖譜相似度的二項式擬合方程

由表5可知，6種植物油摻偽模型二項式擬合方程R2均大于0.98，呈現良好的相關性，理論上可以應用于5%～50%摻偽量的摻偽識別。根據各摻偽模型與指紋圖譜的相似度，利用各二項式擬合模型計算摻偽量，對比真實摻偽量，求得相對誤差，摻偽模型與指紋圖譜相似度及相對誤差見表6。

表6 摻偽模型與指紋圖譜的相似度及相對誤差 %

由表6可知：本指紋圖譜對摻入5%～50%大豆油、玉米油、菜籽油(摻偽量10%～50%)、花生油、葵花籽油和芝麻油的亞麻籽油鑒別平均相對誤差分別為0.37%、1.21%、0.29%、2.25%、1.05%、1.46%，均處于較低水平。大豆油摻偽量為5%～50%時識別度均處于較高水平(Re≤0.70%)；芝麻油和葵花籽油次之(Re≤2.75%、Re≤2.90%)；花生油摻偽量為10%時相對誤差較高(Re=9.15%)；菜籽油摻偽量為5%時超出了擬合方程的計算范圍，未能實現鑒別。

綜上，本試驗構建的亞麻籽油甘三酯指紋圖譜在摻偽量5%～50%時，最適合價格相對最低的摻偽大豆油的鑒別，能達到精準鑒別；對摻偽葵花籽油和芝麻油的鑒別也處于較高水平；但本指紋圖譜不適合摻偽量5%菜籽油的鑒別；對摻偽量為10%花生油的鑒別也可能存在較大誤差。

3 結 論

本研究利用HPLC-ELSD法測定了青海亞麻籽油中TAG組成及含量，運用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統構建了TAG標準指紋圖譜，并運用該指紋圖譜識別了6種摻偽量為5%～50%的摻偽模型。結果表明：該指紋圖譜可對摻入5%～50%大豆油、玉米油、葵花籽油、芝麻油的亞麻籽油進行識別，其中：對價格相對最為低廉的大豆油鑒別效果最好；對花生油摻偽量10%的摻偽模型鑒別誤差較大，相對誤差為9.15%；對于摻偽量5%的菜籽油摻偽模型未能識別，但可準確識別摻偽量10%～50%摻偽模型。研究結果可為青海省亞麻籽油品質控制和摻偽識別提供理論依據。