母乳中1-油?；?2-棕櫚?；?3-亞油?；视腿サ难芯窟M展

余曉雯，劉 茜，劉 妍，趙軍英，胡聚峰，李 瑩，楊軼涵，陳歷俊

(1.東北農業大學 食品學院，哈爾濱150030； 2.北京三元食品股份有限公司 國家母嬰乳品健康工程技術研究中心，北京市乳品工程技術研究中心，母乳研究技術創新中心，北京 100163)

母乳中的成分高達2 000多種，含有大量嬰幼兒生長發育必不可少的營養物質[1]。脂質作為母乳中嬰幼兒最重要的營養物質之一，在母乳中占3%～5%，為0～6個月內的嬰兒提供40%～50%的能量，參與嬰幼兒多個器官快速生長[2]，對嬰幼兒胃腸道功能[3]、身體發育、神經系統發育[4]和免疫系統發育[5]等具有有益影響。

甘油三酯(TAG)是母乳脂質中含量最高的成分，約占全部脂質的98%。母乳脂質中，超過70%的棕櫚酸位于TAG甘油骨架sn-2位[6-7]，其他的不飽和脂肪酸(UFA)，如油酸和亞油酸大部分位于TAG甘油骨架sn-1,3位。棕櫚酸在甘油三酯sn-2 位具有促進嬰幼兒對鈣等礦物質的吸收[8-9]、軟便的形成，緩解嬰幼兒哭鬧[10]等效果。母乳脂質中TAG多以USU形式存在[11-12]，其中1,3-二油?；?2-棕櫚?；视腿?1,3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol, OPO)和1-油?；?2-棕櫚?；?3-亞油?；视腿?1-oleoyl-2-palmitoyl-3-linoleoylglycerol, OPL)為母乳中含量最豐富的兩種TAG。研究表明，不同國家和地區的母乳中OPL與OPO的含量存在差異，主要表現為中國母乳中OPL含量普遍高于OPO含量，而歐美國家恰恰相反。當前市售的嬰幼兒配方奶粉脂質在脂肪酸種類上與母乳脂質沒有明顯差異，但在脂肪酸含量和TAG甘油骨架位置上仍有較大區別，添加到嬰幼兒配方奶粉中的植物油在sn-2位上的棕櫚酸水平較低，相反，其在sn-1,3位上有較高水平[13]，如Sun等[14]通過測定180個市售嬰幼兒配方奶粉脂質，發現配方奶粉脂質TAG結構和含量與成熟期的母乳脂質有顯著差異，且配方奶粉脂質中OOO含量較為豐富；Chen等[15]通過分析市售標有添加OPO嬰兒配方奶粉脂質的TAG組成發現，嬰兒配方奶粉中除了含有OPO，也存在一定比例的PPO。目前，我國嬰幼兒配方奶粉多是通過添加OPO來模擬母乳脂質，這與中國母乳脂質TAG組成不完全相同。為進一步研究OPL對嬰幼兒生長發育的影響，本文對母乳中OPL的功能、不同國家和地區母乳中OPL含量及檢測方法進行闡述，以期為結合中國母乳特征開發更適宜中國嬰幼兒的人乳替代脂提供參考。

1 母乳中OPL的功能

母乳脂質在嬰兒發育方面具有重要意義，其TAG的脂肪酸組成和含量對一些代謝調節有影響[16-17]。OPL化學結構中sn-2位為飽和脂肪酸(SFA)棕櫚酸，sn-1位和sn-3位為UFA。母乳中OPL在胃腸道被脂肪酶水解成sn-2單甘油酯和游離脂肪酸，在嬰幼兒的營養物質吸收、骨骼生長以及腸道菌群的正常發展等方面發揮重要作用[18]。

Bar-Yoseph等[19]在一項雙盲實驗中發現sn-2位棕櫚酸對嬰幼兒糞便中脂肪和鈣的含量存在影響，喂養含有sn-2位棕櫚酸配方奶粉的嬰幼兒相較于普通嬰幼兒配方奶粉組，糞便中脂肪含量明顯較低，減少了鈣皂化脂肪的排泄。Béghin等[20]實驗證明，棕櫚酸在sn-2位能改善嬰幼兒糞便的黏稠度以及提高骨骼礦物質含量，這是由于處在sn-2位的棕櫚酸不易與鈣離子結合形成不溶性鈣皂，進而改善便秘和促進鈣的吸收。Litmanovitz等[21]也進一步證明sn-2位為棕櫚酸的結構脂能改善嬰兒糞便硬度，減少便秘，并且能降低嬰兒啼哭頻率。Wang等[22]研究發現喂養sn-2位棕櫚酸結構脂小鼠對鈣的吸收率約48.45%，高于喂養混合植物油組(代表傳統嬰幼兒配方奶粉)的小鼠(38.43%)，還發現這類結構脂可以誘導小鼠腸道內的雙歧桿菌和乳酸桿菌的增殖，減少致病菌的數量，這與Yaron 等[23]的研究結果一致：以母乳和sn-2位棕櫚酸甘油酯組喂養的嬰兒腸道菌群中乳酸桿菌和雙歧桿菌增加。

油酸和亞油酸作為母乳中主要的脂肪酸，為乳脂肪球的形成、運輸和代謝提供了流動性[24]。早期對以油酸和亞油酸為主的飲食研究顯示，與油酸相比，嬰兒飲食以亞油酸為主的多不飽和脂肪酸(PUFA)似乎更能降低膽固醇水平[25]。但其他研究中提到，亞油酸的過量攝入與非典型神經發育有關[26]。Oosting等[27]研究發現，嬰兒攝入母乳或奶粉中的亞油酸和α-亞麻酸會影響大腦中n-3和n-6 PUFA的合成，這兩者之間存在競爭關系，亞油酸攝入過高可能會抑制內源性n-3 PUFA的合成和循環，會對嬰幼兒大腦產生一定的影響。在近年來的規范中，許多國家都有調整嬰幼兒配方奶粉中亞油酸的比例，但也強調這還需要更多臨床上的證據來支持[28]。

也有通過體外對比研究，分析OPL的功能，如Zhang等[29]采用OPL、OPO和1，3-二亞油?；?2-棕櫚油基甘油三酯(LPL)來體外模擬嬰兒胃腸道對脂質的代謝，發現OPL和LPL的消化率均低于OPO，推測原因：一是OPO的粒徑比OPL和LPL小，與酶接觸面積大且油酸與胰酶結合能力強，更易從油滴表面脫落；二是雙鍵阻礙了與酶結合。另外，實驗還采用Caco-2細胞模擬TAG在小腸上皮細胞的合成和分泌，結果顯示在Caco-2細胞中OPL、LPL的合成和運輸高于OPO，這與OPL組中FABP1、PPARα和MTT蛋白的表達顯著高于OPO組有關，表明OPL更利于吸收和運輸。此外，該團隊[30]進一步考察了在體外肝細胞(LO2細胞)中OPL、LPL和OPO對脂質代謝的影響，結果表明，盡管OPL、LPL和OPO均能改變參與脂質代謝關鍵蛋白的表達，進而引起脂質在肝細胞代謝的變化，但是OPL相對于LPL和OPO更容易引起LO2細胞內脂質的堆積，但這是否有利于嬰幼兒的生長和發育還需進一步驗證。

目前臨床研究缺少直接對嬰幼兒喂養OPL含量高的母乳或嬰幼兒配方奶粉的數據，并且OPL在制備上也存在著諸多困難，因此如何解決OPL制備過程中的?；w移和操作復雜等問題還需要不斷研究[31-32]。而目前只從脂肪酸對比和體外研究來分析OPL對嬰幼兒生長發育的影響，還需要考慮其他因素的干預或影響。

2 不同國家和地區母乳中OPL含量

不同的生活環境、飲食習慣等，導致不同地區母親分泌的乳汁有所差異[33]。表1列舉了不同國家和地區的母乳脂質中OPL和OPO的含量。

表1 不同國家和地區母乳脂質中OPL和OPO的含量

Morera[34]、Pons[35]等利用HPLC-ELSD分析了西班牙47個不同哺乳時期的母乳脂質中TAG組成，共分離出30種TAG，得出OPL含量低于OPO(OPO含量為17.56%～42.44%，OPL含量為9.24%～38.15%)。Ten-Doménech等[36]收集了西班牙巴倫西亞地區不同階段的母乳，采用HPLC-ELSD對母乳中脂質TAG組成進行分析，得出OPO含量約為20%，OPL含量約為10%。Kallio等[37]對芬蘭和中國母乳樣本進行分析，通過HPLC-MS在電噴霧(ESI)離子源檢測下，得到數百個TAG的同分異構體，發現芬蘭母乳脂質中含量較高的TAG是OPO(9.4%)，其次是OPL(5.4%)，而中國母乳脂質含量較高的TAG是OPL(10.3%)，OPO(7.1%)次之，該研究還指出油酸通常在TAG的sn-1,3位，但當存在亞油酸則油酸不一定在sn-1, 3位。

Wu等[38]采用HPLC/串聯四級桿-飛行時間質譜(Q-TOF-MS)并使用ESI離子源測定52份北京地區母乳脂質脂肪酸和TAG的組成和含量，結果發現，北京地區母乳脂質中油酸與亞油酸的含量與母親飲食中的豆類、海鮮及堅果等有關，OPL含量在10.31%～14.17%之間，而OPO含量為7.29%～11.91%。Zhang等[39]使用超高效合相色譜UPC2/Q-TOF-MS測定無錫地區母乳樣品，結果發現，母乳脂質中OPL含量為12.60%～19.35%，占總TAG的10.82%，OPO含量為7.98%～17.06%，占總TAG的8.80%。Zhao等[40]研究北京地區的母乳脂質TAG含量，采用UPLC/Q-TOF-MS在ESI正負離子檢測模式下分析得出OPL、OPO含量分別為14.09%和12.80%，且研究表明棕櫚酸主要分布在母乳TAG的sn-2位。

Tu等[41]利用超臨界流體色譜(SFC)結合Q-TOF-MS分析，檢測了湖北、四川和北京3個地區54份母乳脂質TAG的組成和含量，結果表明：湖北、北京和四川3個地區過渡乳與成熟乳TAG種類存在差異；但是無論過渡乳還是成熟乳，OPL含量皆高于OPO含量，且過渡乳中OPL含量高于成熟乳的OPL含量。Yuan等[42]利用HPLC-MS配備大氣壓化學電離(APCI)離子源研究分析無錫地區103位母親初乳到成熟乳TAG組成的變化，結果發現3個時期母乳脂質的脂肪酸譜存在顯著差異；OPO在初乳、過渡乳和成熟乳的脂質中含量分別為19.50%、14.09%和13.91%，始終低于OPL含量(分別為28.08%、23.24%和24.98%)。

通過比較不同國家、不同地區以及不同泌乳期母乳中OPO和OPL的含量(不區分異構體)發現，中國母乳中OPL含量高于OPO[43]，這與歐美國家恰好相反，而且中國母乳中油酸與亞油酸的比例也低于歐美國家[44-45]。從飲食方面分析認為，歐美多數國家日常攝入奶酪、黃油及橄欖油等低碳水、高脂肪的食物[46]，是母乳脂質中油酸含量高于中國的因素之一。而中國人群大多數食用的植物油(如大豆油、葵花籽油等)亞油酸[45-48]含量高，且豆制品的攝入也可以提高母乳脂質中亞油酸的含量[49]。因此，飲食習慣可能是中國母乳脂質中OPL含量高于OPO的重要原因之一。另外，3個泌乳期中，成熟乳中OPL含量相對較低。

3 母乳中OPL的檢測方法

根據脂肪酸在甘油骨架sn-2位和sn-1, 3位酯化位置不同而產生位置異構體或稱為區域異構體(TAG碳鏈上脂肪酸位置不同，而非脂肪酸鏈上雙鍵位置差異)。此外，不同的脂肪酸酯化在甘油骨架sn-1位和sn-3位會具有旋光活性，導致對映異構體[50]。OPL和OPO作為母乳中含量最高的兩種TAG，其主要的對映異構體被證明為rac-OPL(指外消旋后OPL中包含OPL和LPO兩種結構脂)和rac-OPO[37]?，F有的檢測方法普遍是對乳中總TAG的檢測，得出乳中OPL的含量，一般不區分脂肪酸在甘油骨架上的位置。目前有研究結合生物法即添加脂肪酶對TAG特定位置的酯鍵進行水解后再進行測定，該方法在OPO的檢測中較為成熟，因為胰脂肪酶能直接水解sn-1，3位脂肪酸，并能對sn-2位進行確定。有研究顯示，胃脂肪酶對TAG的sn-3位有一定的特異性[51]，能水解得到sn-3位脂肪酸。但是通過胃脂肪酶水解OPL建立檢測方法并沒有得到應用，原因可能是胃脂肪酶對中短鏈脂肪酸的水解活性強于長鏈脂肪酸[52-53]。

早在1988年就有研究采用GC分析TAG，如玻璃毛細管、熔融二氧化硅毛細管等對TAG定量分析[54]。但該方法的缺點是帶有PUFA的TAG極易在檢測中損失，因此該方法逐漸被淘汰。目前，無論是氣相色譜法還是液相色譜法都會結合質譜進行測定，從而得到更準確的結果，如氣相色譜質譜聯用(GC-MS)以及超高效液相色譜質譜聯用(UPLC-MS)等[55]。質譜可以通過準分子離子的準確質量分別精確計算TAG和甘油二酯(DAG)的分子式，并通過片段離子[M+H-FA]+推導出甘油骨架上的脂肪酸?；?。在TAG中，sn-1，3位的脂肪酸?；萻n-2位的更容易斷裂，并產生不同豐度的[M+H-FA]+[56]，因此可通過碎片的強度初步確定脂肪酸在甘油骨架上的位置。近年來，對OPL的位置異構體和對映異構體的分離開始采用銀離子高效液相色譜(Ag+-HPLC)或帶有手性色譜柱的液相色譜法分離，再結合帶有大氣壓化學電離離子源的質譜(APCI-MS)對分離的樣品進行檢測，結果表明TAG的異構體在一定條件下能被明顯表示，而且采用化學電離能規避電子碰撞電離在識別上的問題。

Kurvinen等[57]采用化學電離質譜法測定脂肪酸在TAG中相對分子質量分布，采用碰撞誘導解離串聯質譜法確定母乳和母乳替代品中脂肪酸在TAG中sn-2位和sn-1，3位的分布。Zou等[58]用Ag+-HPLC和手性高效液相色譜分別與APCI-MS聯用，對母乳脂質中TAG位置異構體和對映異構體(rac-OOP/rac-OPO)進行了分離和鑒定，但其他重要的TAG如1-月桂?；?2,3-二油?；视腿?LaOO)和OPL的位置異構體尚未分離。Nagai等[59]采用手性高效液相色譜法實現了TAG位置異構體與對映異構體的分離，采用Chiralpak IF-3 色譜柱同時分離POL、SOL(1-硬脂酸-2-油酸-3-亞油酸甘油三酯)和PSO(1-棕櫚酸-2-硬脂酸-3-油酸甘油三酯)混合TAG，聯合帶有ESI的質譜對其進行分析，采用乙腈作為流動相(可以減少峰拖尾，原因是乙腈增加了流動相的極性和密度)，可以識別sn-1位和sn-3位的UFA(O或L)，但是對OPL、LOP、PLO混合物不能完全分離。

張蘭威等[60]設計了一種母乳中rac-OPL對映異構體的檢測方法。提出先對母乳中OPL進行靶向收集，即采用連有C18色譜柱的液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀測定、收集；其次，利用帶有手性色譜柱(Lux Cellulose-1手性色譜柱)的液相色譜-大氣壓化學電離質譜(HPLC-APCI-MS)對收集的OPL進行測定。結果發現，rac-OPL的峰得到明顯的分離。該團隊[61]在之前的實驗中分別用帶有銀離子色譜柱和手性色譜柱HPLC-APCI-MS對母乳中主要TAG進行了位置異構體和對映異構體分析，得出了rac-OPL以及其對映異構體的相對含量，但對于rac-OPL、rac-POL、rac-PLO混合物的分離仍存在困難，且母乳中也存在基線未分開的情況。

綜上，檢測OPL的方法通常分為兩個步驟：分離和鑒定。常見的如高效液相色譜法能測出母乳中OPL含量，但是在結構上不能得到良好的鑒定。手性色譜法和銀離子色譜法已經被用于TAG的分析，但對于母乳中OPL的檢測報道較少。Ag+-HPLC分離原理是固定相中的銀離子與TAG中雙鍵的π電子之間的電荷轉移作用分離TAG，雙鍵數目及位置決定保留時間[62]；而分析TAG的手性色譜柱的填充物一般多采用纖維素或環狀糊精的衍生物，對對映異構體具有選擇性[63]。Ag+-HPLC /APCI-MS可以分離TAG的位置異構體但不能分離對映異構體，而手性色譜柱可以解決這一問題，所以實驗中可以通過兩種方法來達到OPL的分離鑒定。目前已經確定rac-OPL能進行分離，但由于母乳樣品的復雜性，分離效果達不到rac-OPL標準品的效果。也有學者提出使用一種新型算法[64]對油脂中的AAB型和ABC型TAG的異構體進行檢測，其原理是TAG通過質譜中碎片離子的響應強度制作校正曲線對樣品中的TAG異構體進行定量，但該方法目前沒有運用于母乳檢測中，而且該方法只區分TAG的位置異構體。所以，未來針對母乳的測定方法還需要探索，并且需要不斷優化條件以區分更多的脂質物質。

4 結束語

OPL作為中國母乳脂質中含量較高的TAG，近年來頗受重視。地理環境、飲食習慣等多種因素造成了中國母乳脂質OPL較OPO含量高?，F有OPL的檢測方法能用于對其位置異構體和對映異構體進行分離。但在研究OPL對嬰幼兒生長發育的影響上，仍舊缺少臨床數據。此外，OPL在人乳替代脂產品中的應用還較為匱乏。

總體來講，我們還需要更準確地鑒定母乳中OPL的結構，在考慮結構因素的同時與OPO進行功能上的對比，這能為采用OPL開發母乳替代脂提供更充分的理論依據。目前，需要研究者深入、全面地剖析OPL結構脂，探究其對生命近遠期健康的意義，為開發更接近母乳的嬰幼兒配方奶粉提供科學證明。