家蠅蛹多肽的制備及促傷口愈合活性評價

張思晨，孫婷婷，趙志敏,，何國瑞，楊得坡,

(1.中山大學 藥學院，廣州510006； 2.廣東省現代中藥工程技術研究開發中心，廣州510006)

家蠅(MuscadomesticaL.)，為環裂亞目麗蠅科蠅屬完全變態昆蟲，一生經歷卵、蛹、幼蟲和成蟲四個階段，其幼蟲和蛹富含油脂、蛋白質等營養成分[1]。家蠅與其他近緣昆蟲的干燥幼蟲和蛹殼合稱為五谷蟲。據《本草求原》等傳統中醫典籍記載，五谷蟲經干燥研磨后，可外用治療臁、癰等感染創面[2]。目前，國內外均有將五谷蟲用于傷口愈合治療的基礎研究和臨床研究，研究對象涵蓋五谷蟲活蛆[3]、多肽[4]、溶菌酶[5]、脂肪酸[6]等。另外，其他來源的肽如墨西哥黃唇魚肉寡肽[7]、青蛙抗菌肽[8]、大豆蛋白源肽[9]、神經肽[10]等活性肽都被證實具有促進傷口愈合的活性。

傷口愈合是一個復雜的生物學過程，是恢復皮膚屏障完整性的關鍵。愈合過程分為止血、炎癥、增殖和重塑四個階段，這四個階段相互重疊、高度協調[11]。傷口形成后不久，凝血形成，在血小板迅速聚集的過程中釋放生長因子如轉化生長因子β1(TGF-β1)，生長因子在傷口早期迅速招募炎癥細胞[12-13]，炎癥細胞表達關鍵的生長因子和介質，不斷促進修復過程。傷口形成后幾小時內，角質形成細胞開始遷移并增殖以愈合傷口[14]。因此，角質形成細胞的遷移與增殖、生長因子等的表達，對于促進傷口愈合十分重要。鑒于多肽生物活性和安全性高的優點，一些多肽類藥物在促傷口愈合方面的研發成為近年來的熱門領域之一。家蠅蛹與幼蟲相似，含有十分豐富的生物活性肽類物質。但家蠅蛹多肽(peptides from housefly pupa，PHP)是否也具有促傷口愈合活性還未見報道，故本研究以家蠅蛹為對象，利用酶解法制備PHP并評價PHP的促傷口愈合活性，以期為家蠅蛹的高效資源開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

家蠅蛹，廣東盈亨生物科技有限公司提供。堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-糜蛋白酶、復合蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司；鄰苯二甲醛，上海麥克林生化科技有限公司；人永生化角質形成細胞株(HaCaT)，武漢大學中國典型培養物保藏中心；小鼠單核巨噬細胞株(RAW264.7)，中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所；DMEM高糖培養基、胎牛血清、青霉素及鏈霉素，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)，派普泰克生物科技(蘇州)有限公司；酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒，欣博盛生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

油浴鍋；pH 計；冷凍干燥機，德國 Christ 公司；多功能酶標儀，德國BMG公司；UltrafleXtreme MALDI-TOF/TOF 基質輔助激光解析飛行時間質譜儀(配備 355 nm Nd:YAG 激光器)，德國Bruker Daltonics公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PHP的酶解法制備及得率計算

以正己烷為溶劑，采用索氏提取法對家蠅蛹進行脫脂得到脫脂家蠅蛹粉。準確稱量10 g脫脂家蠅蛹粉于錐形瓶中，按料液比1∶20加入雙蒸水混勻，于4℃冷提10 min，隨后于100℃油浴鍋中加熱10 min使蛋白質變性，冷卻至酶解溫度后，使用NaOH溶液/HCl溶液調節至一定pH，立即加入一定量的蛋白酶，酶解一定時間。酶解結束后于100℃滅酶活10 min，冷卻至室溫后轉移提取液至離心管中，于5 000 r/min離心5 min，取上清液，冷凍干燥，即得PHP。PHP得率按照下式計算。

R=(m1-m2)/m0×100%

(1)

式中：R為PHP得率；m1為干燥的多肽質量，g；m2為加酶量，g；m0為脫脂家蠅蛹粉質量，g。

1.2.2 PHP中多肽含量及水解度測定

采用鄰苯二甲醛(OPA)法測定多肽含量及水解度。OPA法的原理是在堿性介質中OPA能與游離的氨基發生反應生成具有熒光性的異吲哚衍生物，在340 nm處有特征吸收[15]。OPA試劑配制參考Church等[16]的方法。

通過谷胱甘肽標準曲線測定多肽的含量。具體方案為：配制系列梯度質量濃度的谷胱甘肽標準溶液(0.500、0.250、0.125、0.063、0.031、0.016、0.000 mg/mL)，分別取20 μL谷胱甘肽標準溶液與150 μL OPA試劑混勻，精確控制反應時間為2 min，在340 nm波長處檢測吸光度，以去離子水作為對照，繪制谷胱甘肽質量濃度(x)-吸光度(y)標準曲線，擬合得到標準曲線方程(y=1.599x+0.039，R2=0.999 9)；將待測樣品配成1 mg/mL的溶液，檢測方法同谷胱甘肽標準溶液組，再根據標準曲線方程計算多肽含量。

通過絲氨酸標準溶液測定水解度[15]。具體方案為：準確配制質量濃度為1 mg/mL的絲氨酸標準溶液，取20 μL絲氨酸標準溶液與150 μL OPA試劑混勻，精確控制反應時間為2 min，在340 nm波長處檢測吸光度，以去離子水作為對照；將樣品配制成1 mg/mL的溶液，檢測方法同標準溶液組，按照下列公式計算水解度。

D=h/htot×100%

(2)

h=[(A2-A0)/(A1-A0) ×0.951 6×1-β]/α

(3)

式中：D為水解度；h為多肽水解過程中裂解的肽鍵數；htot為總肽鍵數，取指定值7.6；A2、A1、A0分別為樣品組、絲氨酸標準溶液組、對照組的吸光度；α、β分別取指定值1.00、0.40。

1.2.3 PHP對HaCaT細胞增殖的影響

將HaCaT細胞接種于含10%胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素的DMEM培養基，在含有5% CO2及飽和濕度條件的37℃恒溫培養箱里進行培養。取對數生長期細胞，以2 × 103個/孔的密度接種于96孔細胞培養板，待細胞完全貼壁生長后，實驗組給予200 μg/mL PHP處理，空白對照組給予同體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)處理，以0.4 ng/mL EGF作為陽性對照。培養48 h后，采用MTT法檢測細胞數。按照下式計算細胞增殖率。

R1=A1/A0×100%

(4)

式中：R1為細胞增殖率；A1為實驗組吸光度；A0為空白對照組吸光度。

1.2.4 PHP對HaCaT細胞遷移的影響

采用經典劃痕實驗檢測PHP對HaCaT細胞遷移的影響。取對數生長期的HaCaT細胞(細胞培養方法見1.2.3)，以2 × 105個/孔的密度接種于12孔細胞培養板，待細胞完全貼壁生長后，棄掉舊培養基，加入含0.5%胎牛血清的培養基饑餓處理12 h。使用10 μL無菌槍頭在細胞層垂直劃痕，建立體外細胞創傷模型，用PBS反復沖洗至劃痕區域干凈。實驗組給予200 μg/mL PHP處理，空白對照組給予同體積的PBS處理，以0.4 ng/mL EGF作為陽性對照。分別于給藥后0、24、48 h于顯微鏡下拍照。利用Image J軟件進行指定劃痕區域愈合面積計算，按照下式計算遷移率。

R2=(S0-Sx)/S0×100%

(5)

式中：R2為細胞遷移率；S0為0 h時的劃痕面積；Sx為24 h或48 h時的劃痕面積。

1.2.5 PHP對RAW264.7細胞TGF-β1、TNF-α、IL-6表達的影響

RAW264.7細胞培養方法同HaCaT細胞(見1.2.3方法)。取對數生長期細胞，以5.5× 104個/孔的密度接種于96孔細胞培養板。待細胞貼壁后，實驗組分別給與50、100、200 μg/mL的PHP處理，空白對照組給予同體積PBS處理，以0.4 ng/mL EGF作為陽性對照。培養12 h后收集細胞上清液，采用ELISA試劑盒檢測TGF-β1、IL-6、TNF-α含量。

1.2.6 PHP分子質量分布分析

將樣品溶于雙蒸水，制成質量濃度為1 mg/mL的PHP溶液，采用基質輔助激光解析飛行時間質譜儀(MALDI-TOF-MS)檢測分子質量分布。分析條件：離子源加速電壓1為20.00 kV，加速電壓2為17.85 kV，離子延時提取140 ns，正離子譜檢測，質量掃描范圍(m/z)為500～4 000、1 000～20 000。

1.2.7 數據分析

所有實驗均重復3次，實驗結果以“平均值±標準偏差”表示，用GraghPad Prism 7.0.4軟件處理數據。以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 PHP制備酶的篩選

按1.2.1方法，采用不同的蛋白酶，在加酶量8 000 U/g、酶解時間1 h以及不同蛋白酶酶解溫度和pH(具體見表1)條件下制備PHP，比較不同蛋白酶對PHP得率、多肽含量及水解度的影響，結果如圖1所示。

表1 不同蛋白酶酶解條件

注：A～J分別表示胃蛋白酶、風味蛋白酶、復合蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、α-糜蛋白酶。

由圖1A可見，胃蛋白酶酶解制備的PHP得率最高，為(74.71±2.11)%，其次是風味蛋白酶、復合蛋白酶、中性蛋白酶，PHP得率分別為(72.82±2.38)%、(62.19±1.31)%和(55.59±2.78)%。由圖1B可見，風味蛋白酶酶解制備的PHP多肽含量及水解度最高，分別為(32.67±0.42)%和(15.79±0.25)%。另外，中性蛋白酶、堿性蛋白酶、復合蛋白酶及胃蛋白酶也能制備出較高多肽含量及水解度的PHP。綜上，風味蛋白酶酶解法是一種能夠制備高得率、高多肽含量及高水解度PHP的方法。

2.2 風味蛋白酶酶解制備家蠅蛹多肽(peptide hydrolyzed with flavourzyme from housefly pupa, PHF)工藝優化單因素實驗

采用單因素實驗，考察酶解溫度、加酶量和酶解時間對PHF得率及水解度的影響，結果如圖2所示。

注：固定條件為pH 7.0、酶解時間30 min、加酶量8 000 U/g、酶解溫度60℃，優化時改變單一因素條件。

由圖2A可見，酶解溫度從30℃上升到60℃時，PHF得率及水解度顯著增加，60℃時PHF得率及水解度分別為(73.27±2.48)%、(7.57±0.20)%，但當酶解溫度升高至70℃時，PHF得率及水解度明顯降低。這可能與酶的活性有關，反應溫度過低會大大降低體系內分子運動程度，從而降低蛋白酶與底物的碰撞概率，反應溫度過高會導致蛋白酶全部或部分喪失催化活性[17]。由圖2B可見：當加酶量從4 000 U/g增加至8 000 U/g時，PHF得率及水解度增長迅速；當加酶量從8 000 U/g增加至12 000 U/g時，PHF得率增長緩慢，水解度基本不變。由圖2C可見：酶解時間從1 h延長至4 h時，PHF得率從(74.85±2.08)%增加至(79.45±1.77)%，水解度從(11.47±0.37)%增加至(17.04±0.04)%；酶解時間從4 h延長至5 h時，PHF得率不變，水解度增加不足0.5百分點，可見酶解時間過長(>4 h)并不能使PHF得率更高。綜上，確定制備PHF的最佳工藝條件為：酶解溫度60℃，加酶量8 000 U/g，酶解時間4 h。在最佳條件下， PHF得率為(79.45±1.77)%，水解度為(17.04±0.04)%。

2.3 PHP對HaCaT細胞增殖的影響

HaCaT細胞是傷口愈合過程中發揮重要功能的細胞，是再上皮化的關鍵細胞。不同蛋白酶酶解(酶解條件如表1所示)制備的PHP對HaCaT細胞增殖的影響如圖3所示。

由圖3可見，不同蛋白酶酶解制備的PHP對HaCaT細胞均無顯著的毒性作用。與空白對照組比較，除復合蛋白酶、胰蛋白酶外，其余8種蛋白酶制備的PHP及EGF均能不同程度地促進HaCaT細胞的增殖(P<0.05)。其中，酸性蛋白酶酶解制備的PHP促進HaCaT細胞增殖的作用最強，增殖率為(121.85±8.07)%，其次是風味蛋白酶、胃蛋白酶酶解制備的PHP，HaCaT細胞增殖率分別為(118.38±2.36)%、(116.96±2.79)%。

注：A～J分別表示胃蛋白酶、風味蛋白酶、復合蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、α-糜蛋白酶制備的PHP，下同。與空白對照組比較，*表示P<0.05。

2.4 PHP對HaCaT細胞遷移的影響

不同蛋白酶酶解制備的PHP對HaCaT細胞遷移的影響如圖4所示。

由圖4可見，與空白對照組比較，風味蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、復合蛋白酶酶解制備的PHP及EGF作用于HaCaT細胞24、48 h時，細胞遷移率均具有顯著性的提升(P<0.05),α-糜蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解制備的PHP作用于HaCaT細胞24 h時，細胞的遷移率顯著增加(P<0.05)，而中性蛋白酶酶解制備的PHP處理組在24、48 h時的細胞遷移率均無顯著變化。其中，PHF促進HaCaT細胞遷移的活性最佳，其作用的HaCaT細胞在24、48 h的遷移率分別為(50.59±2.68)%和(63.87±2.16)%。此時，空白對照組在24、48 h的遷移率分別為(35.93±3.97)%、(46.88±1.81)%。因此，后續對PHF進一步研究。

注：與空白對照組比較，*表示P< 0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

2.5 PHF對HaCaT細胞增殖與遷移的影響

為了進一步探究PHF的促傷口愈合活性，評估了PHF在不同質量濃度(PHF1,50 μg/mL;PHF2,100 μg/mL;PHF3,200 μg/mL)下對HaCaT細胞增殖與遷移的影響，結果如圖5所示。

注：A、B分別為PHF對HaCaT細胞增殖、遷移的影響；C為PHF對HaCaT細胞遷移影響的定性分析，標尺1 000 μm；與空白對照組比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

由圖5A可見，與空白對照組比較，100、200 μg/mL PHF處理組的HaCaT細胞增殖率均有顯著提升(P<0.05)，分別提升至(108.20±1.62)%和(117.26±1.20)%。由圖5B可見，與空白對照組比較，PHF在24 h時以濃度依賴的方式促進HaCaT細胞的遷移，100、200 μg/mL PHF處理組HaCaT細胞在48 h時的遷移率均具有顯著性的提升(P<0.01)，且200 μg/mL PHF促HaCaT細胞遷移活性優于陽性對照組。由圖5C可見，給藥之后，HaCaT細胞逐步遷移至劃痕部位，48 h時，200 μg/mL PHF處理組HaCaT細胞遷移至部分融合。以上結果表明PHF能有效促進傷口的愈合。

2.6 PHF對RAW264.7細胞TGF-β1、TNF-α、IL-6表達的影響

進一步檢測了不同質量濃度的PHF對RAW264.7細胞活力及細胞因子TGF-β1、TNF-α、IL-6表達的影響，結果如圖6所示。

注：與空白對照組比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

由圖6A可見，與空白對照組相比，50 μg/mL的PHF及EGF對RAW264.7細胞的活力無顯著影響，而中、高質量濃度(100、200 μg/mL)的PHF可顯著提升RAW264.7細胞的活力。

TGF-β1是皮膚傷口愈合的關鍵轉化生長因子。已有研究表明，由T細胞釋放的TGF-β通過調節細胞增殖、遷移、分化、細胞外基質產生和免疫調節，對傷口愈合產生多效作用[18-19]。He等[20]報道蛙類來源的肽在巨噬細胞中通過誘導TGF-β1的表達，顯著激活下游依賴TGF-β的Smad信號通路，進而促進傷口愈合。由圖6B可見，PHF以濃度依賴的方式顯著促進RAW264.7細胞中TGF-β1的表達，200 μg/mL的PHF給藥后，細胞上清液中TGF-β1的水平增加至(304.00±8.00)pg/mL(空白對照組的水平為(214.77±5.82)pg/mL)。結果說明PHF可誘導TGF-β1的表達進而促進傷口愈合。

由圖6C可見，PHF以濃度依賴的方式顯著促進小鼠巨噬細胞中TNF-α的表達，50、100、200 μg/mL的PHF給藥后，細胞上清液中TNF-α的水平分別增加至(3 003.94±14.37)、(5 788.39±6.74)、(6 384.50±26.23)pg/mL(空白對照組的水平為(53.94±2.55)pg/mL)。由圖6D可見，與空白對照組相比，100、200 μg/mL的PHF顯著促進了小鼠巨噬細胞中IL-6的表達，表達水平分別提升至4.42、21.52倍。然而，與空白對照組相比，陽性對照組EGF對炎性細胞因子TNF-α、IL-6的表達沒有顯著差異，表明EGF不影響傷口愈合過程中的炎癥期。結果說明PHF促進了RAW264.7細胞中炎性細胞因子TNF-α、IL-6的表達，激活了傷口愈合過程中的炎癥信號。

2.7 PHF的分子質量分布

采用MALDI-TOF-MS分析PHF的分子質量分布，結果如圖7所示。由圖7A可見，信號峰在m/z范圍為500～1 300 時較為集中，信號最強的質子峰在m/z為560左右。由圖7B可見，m/z在2 000及以上時，基本無信號峰。以上結果說明，PHF的分子質量主要集中在500～1 300 Da。按照氨基酸殘基平均分子質量110 Da估算，PHF主要為含有4～11個氨基酸的多肽。

注：A.m/z范圍為500～4 000；B.m/z范圍為1 000～20 000。

3 結 論

本研究以家蠅蛹為原料，用10種不同蛋白酶酶解法制備家蠅蛹多肽(PHP)，結果表明風味蛋白酶酶解法對于制備高得率、高水解度和高多肽含量的PHP具有較好的優勢。細胞實驗結果顯示多種蛋白酶酶解制備的PHP對HaCaT細胞均有較好的促增殖活性及促遷移活性。其中，PHF(分子質量主要分布在500～1 300 Da之間)可能通過促進轉化生長因子TGF-β1及炎性細胞因子TNF-α、IL-6的表達，以影響細胞增殖、遷移及炎癥信號的傳遞從而加速傷口愈合。研究結果提示PHF具有被開發成新型天然促傷口愈合劑的潛力。今后將進一步對PHF進行純化，以明確發揮活性的多肽單體。