HPLC法同時測定白喉烏頭中雙酯型二萜生物堿含量

阿不力米提·玉麥爾，阿卜杜拉·玉蘇普，庫爾班江·巴拉提

1. 喀什大學化學與環境科學學院（喀什 844007）；2. 伊犁師范大學化學與環境科學學院（伊寧 835000）

烏頭類生物堿是一類化學結構復雜和生物活性較強的中藥成分，絕大部分存在于烏頭屬（Aconitum）和翠雀屬（Delphinium）植物中，是烏頭類有毒中藥類的主要化學成分[1]。烏頭類生物堿被認為是烏頭屬中藥材的特征生物活性成分，但大多數烏頭屬藥材都含有大量的有毒雙酯型烏頭堿，治療量與中毒量非常接近，極易發生中毒事件[2]。

烏頭屬植物在中國有170余種，資源十分豐富[3]。烏頭類有毒中藥能祛風除濕，溫經止痛，常用于風濕麻痹[4]。關節疼痛，心腹冷痛，寒疝作痛，麻醉止痛等。從古至今被廣泛應用于臨床，如《傷寒論》載方113個。其中，附子者20個，占總載方量的18%[5]?！吨袊幍洌?005版）》收載的烏頭屬中藥有川烏、草烏、制川烏、制草烏、草烏葉、附子，其中附子炮制品包括鹽附子、黑順片、白附片、淡附片、炮附片等[6]。

在新疆天山北坡廣泛分布一種多年生草本植物交烏頭草，其主要有效化學成分是烏頭堿。因烏頭草外形，色澤與當年生草本植物野芹菜極為相似，隨著回歸大自然盒綠色天然植物的食用，烏頭草中毒日益增多[7]。

通過紫外光譜、紅外光譜、核磁共振、串聯質譜等方法對從烏頭類有毒中藥中分離的烏頭生物堿進行結構鑒定，已發現的生物堿有400多種[8]。如：烏頭中的劇毒成分烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿等；白花瓜葉烏頭中的大渡烏頭堿、13,15-雙去氧烏頭堿、吲哚烏頭堿、景陽堿、塔拉薩敏、查斯曼寧等幾種去甲二萜生物堿；甘青烏頭中異葉堿、阿替素、苯甲酰赫拉替辛坦烏辛、塔拉薩敏等；吉林烏頭中C19二萜生物巨針堿、β-谷甾醇、槲皮素、蘆丁等其他類成分[9]；瓜葉烏頭根中分得氨茴酰牛扁堿、牛扁堿、8-酰滇烏堿、偽烏頭寧、尼奧寧、6-表弗斯生、滇烏堿、印烏堿、查斯曼寧等12個C19二萜生物堿；工布烏頭的塊根中黃草烏堿丁、黃草烏堿丙等9個C19二萜生物堿直緣烏頭根中分得黃草烏堿甲、草烏甲素、膝烏堿、14-乙酰塔拉薩敏、茶花堿等11個二萜生物堿，其中黃草烏堿甲和茶花堿是首次從該植物中分離得到[10]；多根烏頭中分得12-表-歐烏堿、烏頭堿、脫氧烏頭堿、新烏堿和準葛爾烏頭堿；麗江烏頭中分得麗烏堿等，東川烏頭中分旬滇羥堿。

有研究初步證實二萜雙脂型烏頭類生物堿的水解途徑。二萜雙酯型烏頭類生物堿可先水解，失去乙?；蓡沃投粕飰A（如苯甲酰烏頭堿），繼續水解失去苯甲?；蔀躅^原堿[11]。

烏頭類生物堿的檢測方法有酸堿滴定法、分光光度法、高效液相色譜法、毛細管電泳法、高效液相色譜法-質譜法等。試驗用高效液相色譜法測定附子和白喉烏頭中的烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的含量。高效液相色譜法因其柱效高、分離好、穩定方便，能同時測定烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿，故應用最多。UV檢測器因其靈敏度高、穩定性好，線性范圍寬等優點而廣泛應用，適用于生藥、飲片、藥酒中烏頭堿的檢測。水-甲醇-二乙胺（75∶25∶0.1，V/V）被用于烏頭類生物堿的組織分布[12]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 試驗材料

白喉烏頭（2020年8月16日采自特克斯縣科克特勒克鄉）。

1.1.2 試驗試劑

新烏頭堿對照品（批號B10050，規格20 mg，上海士鋒生物科技有限公司）；烏頭堿對照品（批號B10051，規格20 mg，上海士鋒生物科技有限公司）；次烏頭堿對照品（批號B10049，規格20 mg，上海士鋒生物科技有限公司）；無水已醇（分析純，成都市料龍化工試劑廠）。

1.1.3 儀器與設備

FA2104型電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；星火牌C型玻璃儀器氣流烘干器（長城料工貿有限公祠）；SHZ-Ⅲ型循環水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；SY-2000型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-250DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；高效液相色譜儀（LC-2010，日本）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

采用Agilent C18柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；流動相∶甲醇-水（20∶80）；流速0.8 mL/min；檢測波長235 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。結果表明新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿分離度良好，且樣品中的其他成分不干擾測定。

1.2.2 對照品及供試品溶液的制備

1.2.2.1 供試品溶液的制備

取白喉烏頭，置于研缽中粉碎后，稱取5 g，置于50 mL錐形瓶中，加入0.5 mL氨試液，精密加入無水乙醇25 mL，超聲波提取45 min，放冷，稱定質量。用無水乙醇補足減失的質量，搖均，過濾，濾液分別加入50 mL容量瓶中，加無水乙醇溶液溶解，并稀釋至度，搖均，即得。

1.2.2.2 對標準溶液的制備

準確稱取5 mg新烏頭堿、1.75 mg烏頭堿和2.5 mg次烏頭堿，分別置于10 mL容量瓶中，加無水乙醇溶液溶解并稀釋刻度，搖均，即得。

1.2.2.3 流動相的選擇

由于3種待測的烏頭類生物堿是堿性，且3種烏頭類生物堿的pH為7～10，所以流動相的pH會影響3種烏頭類生物堿的出峰時間。當流動相使用甲醇-水（20∶80，V/V）流動時，各種待測物質的出峰順序發生改變，但是各種物質間都達到很好的分離。所以試驗選擇甲醇-水作為流動相。

1.2.2.4 相應波長的選擇

將一定濃度的3種烏頭類生物堿的標準溶液分別在200～250 nm范圍內進行掃描，根據高效液相色譜235 nm作為3種烏頭類生物堿的檢測波長。

1.2.2.5 提取方法

分別取約5 g 2種樣品細粉，精密稱定，分別置于50 mL錐形瓶中，加入氨水0.5 mL，加入25 mL無水乙醇，稱其質量，混勻，超聲（功率100 kW）45 min，過濾，濾液分別加入50 mL容量瓶中，加無水乙醇溶液溶解并并稀至刻度，搖均，即得。

1.2.2.6 線性關系考察

精密吸取2，4，6，8和10 μL標準溶液，分別注入液相色譜儀，以峰面積為縱坐標進樣量（μL）為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.3 方法學考察

1.2.3.1 精密度試驗

取新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿質量濃度分別為5，1.75和2.5 μg/mL的對照品貯備液（將1.2.2.1的溶液稀釋100倍）10 μL進樣，連續5次，測定3種生物堿的峰面積積分比值，計算精密度（SRSD）。結果顯示，新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿SRSD分別為0.33%，0.36%和0.42%，表明精密度良好。

圖1 準溶液色HTPLC圖

圖2 樣品HTPLC圖

表1 精密度試驗

1.2.3.2 穩定性試驗

取1.2.2.2的供試品溶液，分別于0，4，8，16和24 h進樣測定。結果顯示，新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿SRSD分別為1.1%，1.6%和1.8%，表明溶液在24 h內基本穩定。

表2 穩定性試驗

1.2.3.3 重復性試驗

表3 重復性試驗

取同一批附子和白喉烏頭藥材3份，按1.2.2.1的方法制備成供試品溶液，并按1.2.1的色譜條件進樣測定，結果顯示，樣品中新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿平均含量的SRSD分別為0.97%，1.3%和1.5%。

1.2.3.4 加標回收率試驗

稱取已測知含量的樣品5分，每份0.19 g，分別精密加入1.00 mL新烏頭堿對照品溶液（質量濃度29.0 μg/mL）、1.00 mL烏頭堿對照品溶液（質量濃度20.75 μg/mL）和1.00 mL次烏頭堿對照品溶液（質量濃度0.200 μg/mL），按1.2.2.2的方法制備供試品液，測定含量并按式（1）計算回收率。

2 結果與分析

2.1 標注曲線的繪制

圖4 烏頭堿標準曲線

以峰面積值為縱坐標，新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿對照品的質量濃度C（μm/mL）為橫坐標，繪制標準工作曲線，如圖3～圖5所示。新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿的曲線方程分別為y=6 075x-131.8（r=0.99921），y=70 664x-1455.3，r=0.99918，y=857821x-7 967.6，r=0.99916。新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿分別在1～5，0.35～1.75和0.5～2.5 μg范圍內呈良好線性關系。

圖3 新烏頭堿標準曲線

圖5 次烏頭堿標準曲線

2.2 加標回收率試驗

回收率試驗結果見表4。

表4 加標回收率試驗（n=5）

2.3 樣品測定

按1.2.2.1的方法制備供試品溶液，按1.2.1的色譜條件進樣測定，根據3個成分的線性回歸方程，對附子和白喉烏頭提取液中的成分含量進行計算，如式（2）所示。

表5 樣品含量測定結果

3 結論

在試驗條件下，對照品及試樣中各組分均能達到基線分離，且峰形良好。用無水乙醇作提取劑，超聲提取45 min，提取效率最高。建立的高翔液相色譜法同時測定附子和白喉烏頭中新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿含量的方法，經方法學考察，全部達到檢測要求。通過測定不同批號的該草烏，發現其質量具有一定差異性。