桑白皮黃酮提取物通過調控miR-223-3p表達對高糖誘導的小鼠足細胞損傷的影響

王愛媛 劉姝 吳衛平 房輝 張雅中 呂月 韓曉東 張婷 唐文君 劉慶賢

(唐山市工人醫院 1內分泌科，河北 唐山 063000；2神經內科；3心內科；4中醫科；5腎內科；6老年病科；7皮膚科)

糖尿病腎病是糖尿病的常見并發癥。研究表明，腎小球足細胞損傷是糖尿病腎病發生發展的重要環節〔1〕，尋找有效的方法降低或抑制足細胞損傷對于糖尿病腎病的治療具有積極意義。桑白皮是雙子葉植物?？粕３ニㄆず蟮母稍锔?，具有補虛、活血祛瘀、化痰止嗽、生津止渴等作用。研究顯示，桑白皮黃酮提取物可防治2型糖尿病大鼠非酒精性脂肪肝〔2〕，改善糖尿病小鼠物質代謝及能量代謝紊亂〔3〕。然而桑白皮黃酮提取物對糖尿病腎病足細胞損傷的作用還未知。非編碼RNA中的微小RNA(miRNA)已被證明與糖尿病腎病有關〔4〕。研究顯示，miR-223-3p在糖尿病腎病患者血漿中表達降低，且其表達與疾病嚴重程度有關〔5〕。目前，miR-223-3p在足細胞損傷中的作用還未知。本研究觀察桑白皮黃酮提取物對高糖刺激的足細胞及miR-223-3p表達的影響，旨在探討桑白皮黃酮提取物對高糖誘導的小鼠足細胞損傷的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗試劑 小鼠足細胞購自上海研生實業有限公司，桑白皮藥材購自廣東省藥材公司，胎牛血清(FBS)購自浙江天杭生物科技股份有限公司，膜聯蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，兔抗小鼠去氧腎上腺素(Nephrin)多克隆抗體購自英國Abcam公司，兔抗小鼠活化的半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3)和結蛋白(Desmin)多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗小鼠波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體購自美國Cell Signaling 公司，miR-223-3p 模擬物(mimcs)和抑制劑購自廣州銳博生物科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1桑白皮黃酮提取物的制備 參照文獻方法提取桑白皮黃酮〔6〕。將500 g桑白皮藥材(干燥粉末)與1 500 ml乙醇(80%)加熱回流提取1 h，重復3次。將濾液旋轉蒸發回收乙醇，濃縮至膏狀。加入大孔吸附樹脂、80%乙醇洗脫，收集洗脫液并回收乙醇，濃縮至膏狀，真空冷凍干燥，得到桑白皮黃酮。

1.2.2細胞培養和轉染 足細胞維持在含10% FBS的DMEM培養基生長，環境為37℃、CO25%、濕度97%。取對數增殖期的足細胞(5×104個)接種于6孔板中。參照LipofectamineTM2000試劑盒操作指示，分別將miR-223-3p mimcs、mimcs陰性對照(miR-NC)、miR-223-3p抑制劑(anti-miR-223-3p)及抑制劑對照(anti-miR-NC)轉染至足細胞。轉染時間為48 h。

1.2.3細胞分組處理 未轉染的足細胞和轉染后的足細胞，以2.5×104個/孔接種于24孔板中。未進行轉染操作的足細胞分為對照組、高糖組和高糖+桑白皮黃酮提取物組。對照組細胞使用完全培養基正常培養48 h；高糖組細胞使用含30 mmol/L〔7〕葡萄糖的完全培養基培養48 h；高糖+桑白皮黃酮提取物組使用含30 mmol/L葡萄糖和50 μg/ml桑白皮黃酮提取物的完全培養基共同培養48 h。miR-223-3p組和miR-NC組使用含30 mmol/L葡萄糖的完全培養基培養48 h，并分別記為高糖+miR-223-3p組和高糖+miR-NC組。anti-miR-223-3p組和anti-miR-NC組細胞均使用含30 mmol/L萄糖和50 μg/ml桑白皮黃酮提取物的完全培養基共同培養48 h，并分別記為高糖+桑白皮黃酮提取物+anti-miR-223-3p組和高糖+桑白皮黃酮提取物+anti-miR-NC組。每組設置3個復孔。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 收集1.2.3分組處理的足細胞，用試劑盒中5 μl Annexin V-FITC、5 μl PI依次室溫避光染色，上流式細胞儀檢測。

1.2.5細胞中ROS含量測定 收集1.2.3分組足細胞，加入含有20 μmol/L二氯熒光素雙醋酸鹽(DCFH-DA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液，重懸細胞，37℃孵育2 h。1 000 r/min離心5 min，吸棄上清液。PBS溶液清洗細胞2次，用重懸細胞后熒光顯微鏡檢測。激發波長500 nm，發射波長525 nm。以對照組的熒光強度為1，實驗組與對照組的熒光強度比值表示ROS含量。

1.2.6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞中MDA和SOD水平 收集1.2.3分組足細胞，PBS清洗后，3500 r/min離心5 min。分別遵循MDA和SOD試劑盒操作說明，檢測上清中MDA和SOD水平。

1.2.7Western印跡檢測細胞中蛋白表達 收集1.2.3分組足細胞，用RIPA蛋白裂解液裂解細胞，4℃、12 000 r/min離心10 min收集在干凈的EP管中。使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒分析蛋白濃度。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等體積的蛋白質(20 μg)，并轉移到聚偏氟乙烯膜。分別用cleaved caspase-3、Nephrin、Desmin、Vimentin和GAPDH一抗孵育液4℃孵育過夜，與二抗免疫球蛋白(Ig)G孵育液37℃孵育2 h。并使用化學發光試劑和凝膠成像系統進行條帶可視化，Image J軟件以GAPDH為內參，進行條帶分析。

1.2.8實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測細胞中miR-223-3p表達 收集1.2.3分組足細胞，Trizol試劑提取細胞中總RNA。將RNA逆轉錄為cDNA根據RNA逆轉錄試劑盒進行，以cDNA為模板進行qPCR。引物序列：miR-223-3p上游 5′-GCCTTCTGCAGTGTTACGC-3′，下游5′-TAAGCATGAGCC ACAC TTGG-3′。采用2-△△Ct法計算足細胞中miR-223-3p相對于U6的表達水平。

1.3統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1桑白皮黃酮提取物影響高糖誘導的小鼠足細胞凋亡 高糖組足細胞凋亡率和cleaved caspase-3蛋白表達水平與對照組比較顯著升高(P<0.05)。與高糖組比較，高糖+桑白皮黃酮提取物組足細胞凋亡率和cleaved caspase-3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見表1和圖1、圖2。

表1 桑白皮黃酮提取物對高糖誘導的小鼠足細胞凋亡的 影響

1～3：對照組、高糖組、高糖+桑白皮黃酮提取物組；圖2、圖3同圖1 桑白皮黃酮提取物對高糖誘導的小鼠 足細胞凋亡的影響

圖2 桑白皮黃酮提取物對高糖誘導的小鼠 cleaved caspase-3蛋白表達的影響

2.2桑白皮黃酮提取物對高糖誘導的小鼠足細胞氧化應激的影響 與對照組比較，高糖組足細胞中ROS和MDA水平顯著升高(P<0.05)，SOD活力顯著降低(P<0.05)。與高糖組比較，高糖+桑白皮黃酮提取物組足細胞中ROS和MDA水平顯著降低(P<0.05)，SOD活力顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 桑白皮黃酮提取物對高糖誘導的小鼠 足細胞氧化應激的影響

2.3桑白皮黃酮提取物對高糖誘導的小鼠足細胞Nephrin、Desmin和Vimentin蛋白表達的影響 高糖組足細胞中Desmin和Vimentin蛋白表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，Nephrin蛋白表達水平顯著低于對照組(P<0.05)。桑白皮黃酮提取物組足細胞中Desmin和Vimentin蛋白表達水平比高糖組顯著降低(P<0.05)，Nephrin蛋白表達水平比高糖組顯著升高(P<0.05)。見表3和圖3。

表3 桑白皮黃酮提取物對高糖誘導的小鼠足細胞Nephrin、 Desmin和Vimentin蛋白表達的影響

圖3 Western印跡檢測Nephrin、Desmin和 Vimentin蛋白表達

2.4桑白皮黃酮提取物對高糖誘導的小鼠足細胞miR-223-3p表達的影響 對照組、高糖組和高糖+桑白皮黃酮提取物組足細胞中miR-223-3p表達水平分別為1.03±0.09、0.34±0.03、0.75±0.06。與對照組比較，高糖組足細胞中miR-223-3p表達水平顯著降低(P<0.05)。與高糖組比較，高糖+桑白皮黃酮提取物組足細胞中miR-223-3p表達水平顯著升高(P<0.05)。

2.5上調miR-223-3p表達對高糖誘導的小鼠足細胞損傷的影響 高糖+miR-223-3p組足細胞中miR-223-3p表達水平、SOD活力、Nephrin蛋白表達水平顯著高于高糖+miR-NC組(P<0.05)，凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表達水平、ROS、MDA水平、Desmin和Vimentin蛋白表達水平顯著低于高糖+miR-NC組(P<0.05)。見表4、圖4。

表4 上調miR-223-3p表達對高糖誘導的小鼠足細胞凋亡和氧化應激及Nephrin、Desmin和 Vimentin蛋白表達的影響

1～2：高糖+miR-NC組、高糖+miR-223-3p組圖4 上調miR-223-3p表達對高糖誘導的小鼠足細胞凋亡和cleaved caspase-3、Nephrin、 Desmin和Vimentin蛋白表達的影響

2.6下調miR-223-3p表達逆轉桑白皮黃酮提取物對高糖誘導的小鼠足細胞損傷的影響 與高糖+桑白皮黃酮提取物+anti-miR-NC組比較，高糖+桑白皮黃酮提取物+anti-miR-223-3p組miR-223-3p水平、SOD活力、Nephrin蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表達水平、ROS、MDA水平、Desmin和Vimentin蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖5、表5和表6。

1～2：高糖+桑白皮黃酮提取物+anti-miR-NC組、高糖+桑白皮黃酮提取物+anti-miR-223-3p組圖5 流式細胞術檢測小鼠足細胞凋亡和Western印跡檢測cleaved caspase-3、Nephrin、 Desmin和Vimentin蛋白表達

表5 下調miR-223-3p表達逆轉桑白皮黃酮提取物對高糖誘導的小鼠足細胞凋亡和氧化應激的影響

表6 下調miR-223-3p表達逆轉桑白皮黃酮提取物對高糖誘導的小鼠足細胞Nephrin、Desmin和 Vimentin蛋白表達的影響

3 討 論

足細胞是一種特異性終末分化的細胞，其位于基底膜外側，與腎小球基底膜和血管內皮細胞共同構成腎臟的濾過屏障，在維持腎小球正常的結構和功能中發揮重要作用〔8〕。在糖尿病腎病發展過程中，高糖可損傷細胞線粒體，引起ROS積累過多，通過氧化應激等多種途徑損傷足細胞，導致其脫落、活性降低甚至凋亡〔9〕。本研究顯示，高糖作用小鼠足細胞后，細胞中ROS和脂質過氧化產物MDA〔10〕水平顯著升高，而抗氧化酶SOD〔11〕活力顯著降低，表明高糖誘導足細胞產生了氧化應激反應。同時，高糖還可能通過上調cleaved caspase-3正調節足細胞凋亡，與前人報道一致〔12〕。這表明高糖處理損傷了足細胞。而桑白皮黃酮提取物干預后，高糖誘導的足細胞氧化應激反應和凋亡降低，說明桑白皮黃酮提取物可降低高糖誘導的足細胞損傷。

Nephrin是足細胞上特異的跨膜黏附蛋白，也是腎小球濾過屏障的重要組成部分。研究顯示，在糖尿病腎病患者及模型中，Nephrin呈低表達〔13〕。Desmin和Vimentin屬于細胞骨架中間絲蛋白，是構成足細胞胞體和初級突起細胞骨架的重要組成部分。研究表明，正常足細胞中Desmin和Vimentin表達較低，當足細胞受到損傷時Desmin和Vimentin表達升高〔14，15〕。本研究顯示，高糖處理可抑制足細胞中Nephrin的表達，促進Desmin和Vimentin表達，而桑白皮黃酮提取物可促進高糖誘導的足細胞表達Nephrin并抑制Desmin和Vimentin表達，表明桑白皮黃酮提取物可降低高糖誘導的足細胞損傷。

miRNA參與組織器官或細胞損傷的發生發展，與疾病的發展進程密切相關。研究顯示，miR-223-3p表達上調可能是心臟損傷后纖維性修復重要調控基因〔16〕；上調miR-223-3p表達可能通過抑制腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-6炎性因子的表達減輕脂多糖(LPS)刺激人臍靜脈內皮細胞造成的內皮損傷〔17〕。目前，miR-223-3p對高糖誘導的小鼠足細胞損傷的影響還未知。本研究顯示，高糖可抑制足細胞中miR-223-3p的表達，提示miR-223-3p可能參與足細胞損傷過程。通過轉染miR-223-3p mimics上調足細胞中miR-223-3p表達后，高糖誘導的足細胞氧化應激水平和凋亡降低，且Nephrin高表達，Desmin和Vimentin低表達，說明上調miR-223-3p表達可降低高糖引起的小鼠足細胞損傷。本研究還顯示，桑白皮黃酮提取物可促進高糖誘導的小鼠足細胞中miR-223-3p表達，下調miR-223-3p表達逆轉了桑白皮黃酮提取物對足細胞損傷的保護作用，提示桑白皮黃酮提取物可能通過上調miR-223-3p表達降低高糖引起的小鼠足細胞損傷。

綜上所述，桑白皮黃酮提取物可降低高糖引起的小鼠足細胞損傷，其作用機制可能與上調miR-223-3p表達有關，為桑白皮黃酮提取物防治糖尿病腎病足細胞損傷提供了一定的理論依據。