煙草ACS 基因家族鑒定及二氯喹啉酸脅迫條件下的表達分析

潘 婷，李澤鋒，陳 凱，王 中，楊小年，朱麗穎，汪耀富，蒲文宣，曹培健，楊 軍，羅朝鵬*

1. 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2 號 450001

2. 湖南中煙工業有限責任公司技術中心，長沙市雨花區勞動中路386 號 410007

二氯喹啉酸屬于生長素類除草劑，主要用于防除稗草和闊葉類雜草，是我國稻田中常用的除草劑，年施用面積占稻作區面積的25%［1］。由于長期大量使用，近年來湖南、廣東和江西等煙稻輪作區煙草上陸續發生二氯喹啉酸藥害，給煙葉生產造成較大損失［2-3］。煙草二氯喹啉酸藥害產生的原因是前茬水稻使用二氯喹啉酸，造成土壤殘留，導致在后茬作物煙草上發生藥害。煙草二氯喹啉酸藥害已經成為影響我國煙葉安全生產的主要問題。

作為一種生長素類除草劑，其作用機制與生長素信號轉導以及泛素/26S蛋白酶體途徑密切相關［4］，涉及生長素受體（Transport inhibitor response 1，TIR1/Auxin signaling f-box，AFB；TIR1/AFB）、共受體 Aux/IAA（Auxin/indole acetic acid）、SCF 型 E3 泛素化連接酶（S-PHASE Kinase associated protein 1-Cullin1-F-Box（SCF）-type E3 ligase）、生長素響應因子（Auxin response factor，ARF）和生長素反應基因等。其中SCF 型E3 泛素化連接酶是泛素/26S 蛋白酶體途徑的主要催化酶，TIR1/AFB和Aux/IAA是SCF 型E3 泛素化連接酶的組分。Aux/IAA 除了作為共受體外，還是ARF 的抑制子。ARF 是一類轉錄因子，能夠特異地與生長素響應基因啟動子區域的生長素響應元件（Auxin response element，AuxRE）結合，激活或抑制生長素響應基因的表達［5］。生長素類除草劑的主要作用機制是：除草劑首先與TIR1/AFB 和Aux/IAA 結合，啟動生長素信號轉導，形成SCFTIR1/AFB-Aux/IAA-生長素復合體，進入泛素/26S蛋白酶體途徑，導致Aux/IAA發生泛素化降解，并解除Aux/IAA 對ARF 的抑制，進而激活生長素響應基因的表達［6-8］。生長素響應基因包括ACS和9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED）等［9］。

ACS 是乙烯合成的關鍵酶，可催化形成乙烯前體1-氨基環丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）。研究發現，二氯喹啉酸通過誘導ACS 過量表達而產生大量乙烯，導致植物生長受阻甚至死亡，可能是生長素類除草劑防治雜草的作用機制［10］。二氯喹啉酸也用于防治禾本科雜草馬唐，但由于長期大量使用，馬唐已產生了抗藥性。使用二氯喹啉酸處理馬唐，敏感株系中乙烯含量提高3 倍，而抗性株系中的乙烯含量沒有顯著變化。使用ACS 抑制劑進行預處理，能使敏感株系在藥害發生時乙烯含量下降89%，藥害癥狀程度減輕37%［11］。在稗草中也得到相似的研究結果［12］。說明植物發生藥害時可通過降低自身乙烯含量，而減輕藥害癥狀，降低藥害損失。目前已經完成ACS 基因家族鑒定的植物有擬南芥［13］、黃瓜［14］和蘋果［15］等，而煙草ACS 基因家族的系統鑒定與分析尚未見報道。為此，對普通煙草品種紅花大金元ACS 基因家族進行了鑒定，并對這些基因在二氯喹啉酸脅迫條件下的表達模式進行了分析，以明確煙草二氯喹啉酸藥害的發生機制。

1 材料與方法

1.1 材料

以5 葉期普通煙草品種K326 為材料，每株煙澆灌20 mL 濃度0.2 mg/kg 的二氯喹啉酸溶液（75%可濕性粉劑，成都科利隆生化有限公司），采集澆灌處理后2 h、6 h、1 d、7 d和14 d的煙草葉片和根組織，對照（以0 h 表示）澆灌同等體積的清水。每個時間點取3株，每株為1次生物學重復。

1.2 方法

使用擬南芥ACS家族蛋白序列在煙草和番茄基因組數據庫（https：//www.sgn.cornell.edu/）中進行比對（BLASTP，E值＜100），將獲得的序列進行家族保守結構域分析（PFAM：PF00155.18），鑒定普通煙草、林煙草、絨毛狀煙草和番茄ACS 蛋白。利用在線軟件Compute pI/Mw（http：//www.expasy.ch/tools/pi_tool.html）進行煙草蛋白質分子量和等電點預測。使用WoLF PSORT 軟 件 （https：//www.genscript.com/wolf-psort.html）進行亞細胞定位預測。利用MEGAX軟件進行多序列比對（MUSCLE法）和系統進化樹構建（鄰接法，bootstrap設置為1 000）。使用Genedoc軟件進行氨基酸序列比對和編輯。順式作用元件預測使 用 PlantCARE 數 據 庫（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/），啟動子長度選擇起始密碼子上游2 000 bp。

所用引物見表 1。 內參引物為 26s-F：5′-GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3′，26s-R：5′-T CTCCCTTTAACACCAACGG-3′。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。第一鏈cDNA合成以Oligo（dT）為引物，使用AMV（Takara，寶生物工程大連有限公司）進行合成。定量PCR 使用2×SYBR Green qPCR Mix 試劑（KEMIX，北京密碼子生物科技有限公司），所用儀器為Bio-rad CFX96。根據Livak等［16］的方法進行相對表達量分析。

表1 引物信息Tab.1 Information of primers

2 結果與分析

2.1 煙草ACS家族鑒定及基本特征分析

根據擬南芥ACS 家族蛋白序列，分別鑒定普通煙草、林煙草、絨毛狀煙草和番茄ACS 家族蛋白。普通煙草有26 個ACS 基因（表2），林煙草12 個，絨毛狀煙草 11 個，番茄 14 個。23 個普通煙草 ACS 基因定位在染色體上，9 號染色體上的ACS 基因最多，有 3 個；3 個基因定位在 scaffold 上。ACS 基因外顯子數3～4 個。CDS 長度為1 002～1 476 bp，編碼的蛋白最長含有491 aa，最短含有333 aa。分子量37.49～55.31 kDa，等電點5.29～8.62。核苷酸序列同源性為35.3%～99.9%，氨基酸一致性為27.5%～100% 。Ntab0327960、Ntab0675660、Ntab0907580、Ntab0292120 和 Ntab0756340 等 5 個蛋白的不穩定系數小于40，屬穩定蛋白質，其余均為不穩定蛋白。蛋白總平均親水性均為負值，因此煙草ACS 全部為親水性蛋白。亞細胞定位預測表明，煙草ACS蛋白主要定位在細胞核或者細胞質中。

表2 煙草ACS家族的基本特征Tab.2 Essential characteristics of tobacco ACS family

2.2 系統進化分析

采用來源于普通煙草、林煙草、絨毛狀煙草、番茄和擬南芥5個物種共72條ACS的蛋白序列構建系統進化樹，結果見圖1。圖1 中顯示，ACS 家族進化形成3類，分別為Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類。其中Ⅲ類成員最少，普通煙草有5個成員。Ⅰ類成員最多，普通煙草有13個成員。相比較而言，擬南芥在Ⅱ類中成員最多（5個），在Ⅰ類中次之（3個），在Ⅲ類中只有1個成員。

圖1 煙草ACS家族的系統進化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of tobacco ACS family

2.3 氨基酸序列分析

ACS屬于以磷酸吡哆醛（PLP）為輔酶的酶家族，酶活性中心位于保守區域［17］。ACS 家族成員含有7個保守氨基酸基序（BOX1～BOX7）和11個保守氨基酸位點（以▼和*標示）。從氨基酸序列比對結果（圖2）中發現，所有煙草ACS 均含有保守位點E（BOX1中的·），該位點決定了ACS 催化反應的特異性［18］。BOX2中的Y位點與ACS的底物識別相關［19］，煙草有3 個 ACS 缺 少 該 位 點 ，分 別 是 Ntab0870430、Ntab0187580和Ntab0187590。

圖2 ACS氨基酸序列比對Fig.2 Amino acid sequence alignment of ACS

ACS 蛋白 C 端序列包含 1 個保守的絲氨酸（S）位點，該位點能夠被CDPK 磷酸化。還包含3 個MAPK磷酸化位點。根據ACS蛋白序列比對結果，I類成員C 端氨基酸序列較長，除Ntab0187580 外，均含有CDPK和MAPK磷酸化位點。Ⅲ類成員C端最短，沒有CDPK 和MAPK 磷酸化位點。Ⅱ類成員除Ntab0759760 外，均含有CDPK 磷酸化位點和TOE基序。

2.4 啟動子分析

啟動子是基因表達調控的重要元件［14］。煙草ACS基因啟動子區的激素相關順式作用元件分析結果（圖3）顯示，煙草ACS基因啟動子區含有脫落酸、茉莉酸、水楊酸、生長素和赤霉素5種激素反應共10種類型的順式作用元件。其中赤霉素反應相關的順式作用元件有3種，茉莉酸、水楊酸和生長素反應有2種，脫落酸有1種。絕大多數基因的啟動子區都含有ABRE、CGTCA-motif和TGACG-motif 3種類型的順式作用元件。在這3種類型元件中，ABRE的數量最多，特別是在Ntab0504530 和Ntab0060800 中含有7個ABRE元件。SARE與水楊酸反應相關，該元件只在Ntab0292120中發現。TGA-element和AuxRR-core是生長素反應元件，TGA-element在10個基因的啟動子中均存在，其中Ntab0115830 含有4個TGA-element。表明煙草ACS基因表達可能受脫落酸、茉莉酸、水楊酸、生長素和赤霉素5種激素的調控。

圖3 普通煙草ACS啟動子激素相關順式作用元件分析Fig.3 Analysis on hormone-related cis-acting elements of NtACS promoter

2.5 表達模式分析

相對表達量分析結果（圖4）顯示，煙草ACS 家族絕大多數成員受二氯喹啉酸誘導而上調表達。上調幅度較大的基因有Ntab0759760、Ntab0856230、Ntab0650880、Ntab0187590 和 Ntab0805630，分別上調 137、126、71、42 和 39 倍。相反，Ntab0504530 和Ntab0187580在葉片和根系中均下調表達。

圖4 普通煙草ACS家族基因表達分析Fig.4 Expression analysis of NtACS gene family

大部分基因在葉片中的上調幅度較大，在根系中則相對較小。但Ntab0292120 和Ntab0650880、Ntab0003870、Ntab0474970 和 Ntab0060800 5 個基因則相反，在根系中上調幅度較大，在葉中較小。Ntab0883620、Ntab0907570 和 Ntab0675660 3 個基因只在葉片中上調表達，在根系中表達量變化不大。Ntab0474970在葉中和根系中的表達趨勢相反，在葉片中上調表達了19 倍，在根系中卻下調表達了10倍。

大部分基因在二氯喹啉酸溶液處理后24 h表達量最高，但Ntab0907570 和Ntab0675660 兩個基因在處理后14 d 表達量最高，Ntab0504530 在處理后7 d表達量最高，Ntab0003870在處理后6 h表達量最高，Ntab0569080在處理后2 h表達量最高。

3 討論

有研究發現，ACS 蛋白C 端是酶活性調控的主要區域。該區域長度差異較大。Ⅰ類成員C端序列最長，含有1個CDPK磷酸化位點和3個MAPK磷酸化位點。這些位點的磷酸化能夠穩定ACS 蛋白活性，從而增加乙烯產生量［20-22］；而非磷酸化，會造成蛋白迅速被26S 蛋白酶體途徑降解，從而降低乙烯產生量。Ⅲ類成員C 端長度最短，不含有任何已知的調控位點。Ⅱ類成員C端長度較長，含有1個TOE基序和1個CDPK磷酸化位點。TOE基序是E3連接酶的結合位點，E3連接酶的結合會促進Ⅱ類ACS蛋白的降解。TOE基序中含有1個CDPK磷酸化位點，該位點的磷酸化能夠抑制26S 蛋白酶體與ACS 的C端結合，從而維持ACS 蛋白的穩定性并增加乙烯產生量；而非磷酸化會造成ACS 迅速被26S 蛋白酶體途徑降解［23］。在 TOE 基序中，WVF 這 3 個氨基酸是E3 連接酶與ACS 結合所必需的。在煙草中，除WVF 形式外，還有 WGF、WVS 和 WVV 3 種突變形式，這些突變形式是否會影響TOE與E3連接酶的結合，進而影響ACS的穩定性和乙烯的產生量，還需要進一步試驗驗證。

生長素和乙烯之間存在相互作用，生長素能促進乙烯合成，乙烯也能促進生長素合成［24］。作為一種生長素類除草劑，二氯喹啉酸通過誘導ACS 過量表達而產生大量乙烯，從而導致雜草死亡，可能是二氯喹啉酸除草的作用機制之一［4］。本研究結果表明，在二氯喹啉酸處理后，大部分ACS 家族成員都上調表達，和雜草中的表達相似，推測煙草二氯喹啉酸藥害跟除草的作用機制相似，都是通過誘導ACS 過量表達，造成乙烯大量積累，從而使煙草表現出藥害癥狀。

二氯喹啉酸作為一種生長素類物質，其作用與生長素信號途徑密切相關，而ARF 等生長素信號途徑相關轉錄因子能夠直接結合到生長素響應基因啟動子區的生長素響應元件上，從而調控生長素響應基因的表達［5］。對煙草ACS啟動子分析發現，至少有11個ACS含有生長素反應元件TGA-element，有4個含有元件AuxRR-core，說明ARF可能調控這些基因的表達。因此，推測二氯喹啉酸調控ACS表達，其過程是：二氯喹啉酸首先與生長素受體結合，通過生長素信號途徑和泛素/26S 蛋白酶體途徑，激活ARF。ARF 結合到ACS 啟動子區的生長素反應元件上，啟動這些基因大量表達，最終造成乙烯的過量積累。

4 結論

普通煙草紅花大金元ACS家族有26個成員，全部為親水性蛋白，主要定位于細胞核或者細胞質中，進化形成3 類。Ⅰ類成員含有CDPK 和MAPK 磷酸化位點，Ⅲ類成員不含有CDPK 和MAPK 磷酸化位點，Ⅱ類成員含有CDPK 磷酸化位點和TOE 基序。啟動子區含有脫落酸、茉莉酸、水楊酸、生長素和赤霉素共5種激素反應的10種順式作用元件。二氯喹啉酸能誘導大部分煙草ACS基因的上調表達。