離子色譜法分析煙用天然香料中的有機酸和無機陰離子

李明雷，席 輝，付英杰，劉 雨，李 鵬，樸永革，孫世豪*，張建勛，李河霖*

1. 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2 號 450001

2. 吉林煙草工業有限責任公司，吉林省延吉市河南街天池路795 號 133001

有機酸是卷煙加料時施加到卷煙煙絲中的關鍵組分之一，能夠有效調節卷煙煙氣pH，改變煙氣煙堿存在狀態，從而降低煙氣刺激性，使煙氣吸味醇和［1-2］。然而有機酸在煙氣中的粒相轉移率和感官貢獻度差異顯著，低碳數的有機酸具有更高的轉移率和感官貢獻，其中，乙酸、乳酸、蘋果酸、檸檬酸、富馬酸等低碳數有機酸在卷煙煙氣中的釋放量受到較多關注［3-4］。此外，煙絲中含有的 Cl-、NO2-、SO42-和PO43-等無機陰離子會通過影響燃燒性能而影響卷煙的抽吸品質［5-7］，也常被作為卷煙設計中關注的化學指標。天然香料是一類重要的煙草添加劑，因其在賦予卷煙風格特征、改善卷煙抽吸品質方面的獨特作用，被廣泛應用于卷煙中［8-10］。有機酸和無機陰離子廣泛分布于天然香料中，是天然香料的重要構成組分。然而，天然香料來源廣泛、種類繁多、工藝多樣，導致其中有機酸和無機陰離子的濃度差異較大［7,11］，這種差異不利于卷煙設計過程中天然香料的選擇和搭配，進而可能影響卷煙品質。迄今為止，關于天然香料中有機酸和無機陰離子分布特征的研究并不多見。因此，了解天然香料中有機酸和無機陰離子的分布特征，對于天然香料的品質評價和卷煙調香時對天然香料的選用具有重要指導意義。

目前，氣相色譜法和液相色譜法是煙用香精香料、煙草及煙草制品中有機酸和無機陰離子檢測的主要方法［12］。采用氣相色譜法進行分析時，需要對目標物進行衍生化，前處理過程復雜［11,13］；液相色譜方法中的離子色譜法，因前處理簡單、無需有機試劑洗脫等成為分析工作者的首選［14-15］。鑒于此，本研究中采用超聲輔助萃取-離子色譜方法定量考察了202種煙用天然香料中的5種有機酸和4種無機陰離子［16-17］，采用單因素方差分析和主成分分析法分析相關數據，獲取了其在天然香料中的分布特征，并討論產品類型和原料種類對天然香料中有機酸和無機陰離子分布特征的影響，旨在為天然香料的品質評價和卷煙調香時天然香料的選用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

參照GB/T 21171—2018［16］的方法自制天然香料樣品，分別為圓柚精油（A）、香莢蘭凈油（B）、紅棗酊（C）、葫蘆巴油樹脂（D）、可可提取物（E）、楊梅濃縮物（F）、紅茶浸膏（G）；202種市售煙用天然香料樣品由各省級中煙工業有限責任公司提供，包括91種精油產品（1～91 號）、12 種凈油產品（92～103 號）、12 種酊劑產品（104～115號）、6種樹脂產品（116～121號）、6 種濃縮物產品（122～127 號）、53 種提取物產品（128～180號）、22種浸膏產品（181～202號）。所有樣品存放條件：溫度（4.0±0.5）℃、相對濕度85%±2%。

DL-蘋果酸二鈉水合物（≥98.0%，色譜純，上海阿拉丁科技股份有限公司）；富馬酸（≥99.0%，優級純）、檸檬酸鈉（≥99.5%，AR）、亞硝酸鈉（≥99.0%，高純試劑）（北京伊諾凱科技有限公司）；乳酸（≥90.0%，AR，北京百靈威科技有限公司）；乙酸鈉（≥99.0%，優級純，美國Alfa Aesar 公司）；氯化鈉（≥99.0%，AR，美國Sigma Aldrich 公司）；無水硫酸鈉（≥99.5%，AR）、無水磷酸三鈉（≥98.0%，AR）（天津市風船化學試劑科技有限公司）；實驗用水經GenPure 超純水儀處理，均為去離子水（電阻率＞18.2 MΩ·cm）。

ICS-5000 離子色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；CP2245電子天平（感量0.000 1 g，德國Sartorius公司）；Transferpette S移液器（德國Brand公司）；GenPure 超純水儀（美國Thermo Scientific 公司）；有機相針式濾器（尼龍，13 mm×0.22 μm，上海安譜實驗科技股份有限公司）；KQ-800DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

標準混合儲備液：分別準確稱取一定量5 種有機酸和4 種無機陰離子標準樣品，置于100 mL 容量瓶中，用去離子水定容。標準樣品稱量后需要轉換為離子濃度，于4 ℃冰箱中保存。

標準工作溶液：在標準混合儲備溶液的基礎上，采用等比稀釋的方式配制一系列濃度的標準溶液，即為標準工作溶液。

1.2.2 樣品前處理

天然香料前處理：稱取100.0 mg 樣品于50 mL離心管中，加入25 mL 去離子水，30 ℃水浴條件下超聲萃取30 min；取1 mL 上清液，經有機相針式濾器過濾后作為進樣溶液，進行有機酸和無機陰離子的離子色譜定量分析。每個樣品平行測定5 次，并計算相對偏差。色譜條件：

色譜柱：Dionex IonPac AS11-HC色譜柱（4 μm×250 mm）；保護柱：IonPac AG11-HC 陰離子保護柱（4 μm×50 mm）；柱溫：30 ℃；電導檢測器溫度：35 ℃；進樣量：25 μL；淋洗液：KOH 溶液；梯度淋洗程 序 ：0～10.0 min 1.25～9.00 mmol/L KOH，10.0～23.0 min 9.00～22.00 mmol/L KOH，23.0～30.0 min 22.00～50.00 mmol/L KOH，30.0～30.1 min 50.00～70.00 mmol/L KOH，30.1～35.5 min 70.00 mmol/L KOH，35.5～35.7 min 70.00～1.25 mmol/L KOH，35.7～41.0 min 1.25 mmol/L KOH；流動相：去離子水；流量：1.0 mL/min；抑制器電流：124 mA。

1.2.3 數據處理

利用Microsoft Excel 2010軟件對數據進行分析處理；利用SPSS V 26.0軟件對數據進行單因素方差分析（Analysis of variance，ANOVA），以P＜0.05 認為存在顯著性差異；采用SIMCA-P軟件進行主成分分析（Principal component analysis，PCA）。

2 結果與討論

2.1 天然香料中有機酸和無機陰離子的超聲輔助萃取-離子色譜法定量分析

標準工作溶液和自制天然香料樣品A～G的色譜圖如圖1所示。由標準工作溶液的色譜圖可知，5種有機酸和4種無機陰離子能夠得到有效分離，且色譜峰形尖銳、對稱、無拖尾現象。表明該離子色譜方法適用于天然香料樣品中的有機酸和無機陰離子的分離。由自制天然香料樣品的色譜圖可知，5種有機酸和4種無機陰離子在自制天然香料中均有分布，但其信號強度存在差異，精油、凈油和酊劑的色譜圖信號強度較低。

圖1 標準工作溶液和天然香料樣品的色譜圖Fig.1 Chromatograms of standard working solutions and natural flavor samples

2.1.1 標準曲線、檢出限和定量限

以目標化合物的色譜峰面積與其濃度進行回歸分析，得到5種有機酸和4種無機陰離子的線性回歸方程及其相關系數，分別以信噪比的3 倍和10 倍確定方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），結果如表1所示?？芍?，5種有機酸和4種無機陰離子在各自線性范圍內的線性關系良好（回歸方程的R2均大于0.999），檢出限和定量限的范圍分別為5.3～27.2 ng/mL 和17.5～90.7 ng/mL，日內和日間相對標準偏差（RSD）的范圍分別為0.66%～6.35%和1.25%～5.27%。因此，該方法的重復性、靈敏度和準確度較好，可滿足5種有機酸和4種無機陰離子的定量檢測要求。

表1 5種有機酸和4種無機陰離子的線性參數、檢出限、定量限和相對標準偏差（n=5）Tab.1 Linear parameters, limits of detection, limits of quantification and relative standard deviations for 5 organic acids and 4 inorganic anions（n=5）

2.1.2 方法的回收率和精密度

參考文獻［16-17］的方法進行樣品前處理的選擇和優化，采用超聲方式輔助萃取天然香料樣品中的有機酸和無機陰離子，選擇溶劑體積為25 mL，水浴溫度為30 ℃。天然香料樣品G 中有機酸和無機陰離子的檢測濃度隨超聲時間的變化見表2?？芍?，有機酸和無機陰離子的檢測濃度隨超聲時間延長呈現先增加后平穩的趨勢，30 min后所測濃度不再有明顯變化。因此，選擇超聲時間為30 min。

表2 不同萃取時間時天然香料樣品G中5種有機酸和4種無機陰離子的檢測濃度Tab.2 Measured concentrations of 5 organic acids and 4 inorganic anions in natural flavor sample G with different extraction time （μg·mL-1）

選取不同類型自制天然香料樣品通過加標的方式考察方法的回收率和精密度。方法對天然香料樣品G中的有機酸和無機陰離子的回收率和精密度測試結果如表3所示?？芍?，9種目標物在不同濃度下的加標回收率在90.3%～98.2%之間，RSD 在0.99%～4.91%之間。采用相同的加標方式考察方法對樣品A～F 的回收率和精密度，結果顯示，不同濃度下9 種目標物的加標回收率在87.6%～108.0%之間，RSD在0.86%～7.58%之間。上述結果表明，該方法適用于不同產品類型天然香料中5 種有機酸和4 種無機陰離子濃度的批量檢測。

表3 天然香料樣品G中5種有機酸和4種無機陰離子的加標回收率和精密度 （n=5）Tab.3 Spiked recoveries and precisions of 5 organic acids and 4 inorganic anions in natural flavor sample G （n=5）

2.2 天然香料中有機酸和無機陰離子的分布特征

202 種天然香料中有機酸和無機陰離子濃度的檢測結果見表4。乳酸、乙酸、蘋果酸和檸檬酸在202種天然香料中的檢出率分別為96%、62%、51%和48%，表明大多數天然香料中均含有一定量的有機酸。而富馬酸僅在15種天然香料中檢出，表明富馬酸可能僅在很少一部分天然香料中存在。Cl-、SO42-和PO43-在202 種天然香料中的檢出率分別為89%、74%和51%，表明大多數天然香料中均有一定的陰離子分布。而NO2-僅在4 種天然香料中檢出，并且濃度低于0.012 mg/g。上述結果顯示，部分有機酸和無機陰離子在天然香料中的分布特征具有廣泛性，意味著在配制煙用香精時，天然香料的使用可能會對煙用香精中有機酸和無機陰離子的濃度造成影響。202 種天然香料中5 種有機酸和除NO2-之外的其他3種無機陰離子濃度的范圍較寬、標準差系數較大，顯示出天然香料中有機酸和無機陰離子的分布存在顯著差異。上述分析結果顯示，天然香料中有機酸和無機陰離子的分布特征具有廣泛性和顯著差異性，這種分布特征可能會影響天然香料的品質評價和卷煙調香時對天然香料的選用。

表4 202種天然香料樣品中有機酸和無機陰離子濃度的描述統計分析結果Tab.4 Results of descriptive analysis of organic acids and inorganic anions concentrations in 202 natural flavor samples

2.3 不同產品類型天然香料中有機酸和無機陰離子的分布特征

根據 GB/T 21171—2018［18］中的定義，將 202 種天然香料分為精油、凈油、酊劑、樹脂、濃縮物、提取物和浸膏，分析不同產品類型天然香料中有機酸和無機陰離子的分布特征。結果如表5所示，同一產品類型天然香料中有機酸和無機陰離子的濃度范圍較寬，這可能與其原料種類和加工工藝有關。不同產品類型天然香料中有機酸和無機陰離子濃度均值的單因素方差分析（Analysis of variance，ANOVA）結果顯示：乙酸在濃縮物、浸膏和提取物中的濃度均值較高，在精油中的濃度均值最低，在其余產品類型天然香料中的濃度均值居中；乳酸在提取物、浸膏和酊劑中的濃度均值較高，在精油中的濃度均值最低，在其余產品類型天然香料中濃度均值居中；蘋果酸、檸檬酸和PO43-在浸膏、濃縮物和提取物中的濃度均值顯著高于精油、凈油、酊劑和樹脂；Cl-在提取物中的濃度均值最高，在精油中的濃度均值最低，在其余產品類型天然香料中的濃度均值居中；SO42-在浸膏、樹脂和提取物中的濃度均值較高，在精油和凈油中的濃度均值較低。結果表明，天然香料中有機酸和無機陰離子的分布特征可能與天然香料樣品的產品類型相關。根據不同產品類型天然香料中有機酸和無機陰離子的濃度差異，可以將天然香料初步分為3類：第一類是有機酸和無機陰離子濃度均值較低的精油和凈油；第二類是有機酸和無機陰離子濃度均值居中的酊劑和樹脂；第三類是有機酸和無機陰離子濃度均值較高的濃縮物、提取物和浸膏。

表5 202種不同產品類型天然香料樣品中有機酸和無機陰離子濃度的描述統計分析結果①Tab.5 Results of descriptive analysis of organic acids and inorganic anions concentrations in 202 natural flavor samples of different product types （mg·g-1）

202 種天然香料中有機酸和無機陰離子的主成分分析結果如圖2所示?？芍?，第一、第二主成分方差貢獻率分別為84.1%和4.1%，總方差貢獻率為88.2%，表明主成分分析結果可說明天然香料樣本的整體情況。精油和凈油樣品大多數呈現聚集現象并相互重疊；濃縮物、提取物和浸膏樣品大多數也呈現聚集現象并相互重疊；酊劑和樹脂樣品則較為分散，在兩類聚集體中各有分布。天然香料產品類型的不同導致其中的有機酸和無機陰離子分布存在一定差異，精油和凈油與濃縮物、提取物和浸膏差異明顯，酊劑和樹脂與精油、凈油、濃縮物、提取物和浸膏難以區分，這與上述不同產品類型天然香料中有機酸和無機陰離子濃度的描述統計分析結果相一致。表明天然香料中有機酸和無機陰離子的分布特征可以作為區分天然香料產品種類的重要指標，并且通過主成分分析方法有可能實現市售天然香料產品類型的鑒定。

圖2 202種天然香料樣品中有機酸和無機陰離子濃度的主成分分析得分圖Fig.2 Principal component analysis scores of organic acid and inorganic anion concentrations in 202 natural flavor samples

不同產品類型天然香料中有機酸和無機陰離子的分布特征可能與其對應的提取方式相關。精油通常是采取蒸餾、壓榨等提取方式獲取油水混合物，再通過油水分離除去水相，這可能導致易溶于水的有機酸和無機陰離子損失，造成其在精油中的濃度較低［17］。酊劑和凈油是采用乙醇等有機溶劑對天然原料或浸膏等萃取得到的產物，有機酸和無機陰離子在部分溶劑中的溶解度受限，即其在溶劑中的濃度較低［20］。樹脂類樣品是將天然滲出的油樹脂盡可能除去揮發性組分后得到的產物，有機酸和無機陰離子在除去揮發性組分的過程中會有所損失，即其中有機酸和無機陰離子的濃度同樣較低。而濃縮物、提取物和浸膏是采取濃縮富集的方式制備的，最大程度上保留了原料中的有機酸和無機陰離子［21］。通過離子色譜方法獲取的數據很好地反映了不同產品類型天然香料的上述特征。

2.4 不同原料種類天然香料中有機酸的分布特征

將202種天然香料按照原料種類進行區分，選取其中同一原料種類數量較多的柑橘類（苦橙油、檸檬油、圓柚油等12種）、辛香料類（肉桂皮油、丁香油、八角茴香油等13種）、棗類（大棗浸膏、紅棗凈油、冬棗提取物等13 種）、茶葉類（巴拉圭茶提取物、綠茶浸膏、紅茶浸膏等8種）、梅子類（話梅提取物、梅子提取物、烏梅浸膏等6種）和煙草類（巴西煙草提取物、津巴布韋煙草提取物、白肋煙浸膏等17種）6個原料種類共計69 種天然香料進行有機酸濃度描述統計分析，結果如表6所示?？芍?，同一原料種類天然香料中有機酸濃度的范圍較寬，這可能與其原料來源、提取方式和加工工藝相關。不同原料種類天然香料中有機酸濃度均值的ANOVA分析結果顯示：辛香料類和柑橘類天然香料中乙酸、乳酸、蘋果酸和檸檬酸的濃度均值顯著低于其余類天然香料；棗類、茶葉類天然香料中乙酸和乳酸的濃度均值較高，蘋果酸和檸檬酸的濃度均值居中；梅子類天然香料中乳酸的濃度均值較低，乙酸、蘋果酸和檸檬酸的濃度均值較高，其中，檸檬酸的濃度均值是其余原料種類天然香料的20倍以上；煙草類天然香料中檸檬酸的濃度均值居中，乙酸、乳酸和蘋果酸的濃度均值較高。富馬酸僅在棗類天然香料中有檢出，但濃度均值相對較低。結果顯示，不同原料種類天然香料中有機酸的濃度均值存在一定差異，天然香料中有機酸的分布特征與原料種類關系密切。文獻中顯示，柑橘類和辛香料類天然香料的成分主要是柑橘果皮和辛香料中的萜烯類化合物，有機酸的濃度則較低［19,22］。富馬酸作為棗類原料中的特征有機酸類成分［23］，在13種棗類天然香料中的檢出率高達69.2%，而在其余189種中的檢出率僅有3.2%。青梅類原料中的檸檬酸在其有機酸總濃度中的比例高達90%［24］，這可能是梅子類天然香料中檸檬酸的濃度均值顯著高于其他類天然香料的原因之一。煙草類天然香料中除富馬酸外的其他4 種有機酸濃度均值居中，這一結果與乙酸、乳酸、蘋果酸以及檸檬酸廣泛分布在煙葉中的結論相一致［6］。

表6 不同原料種類天然香料樣品中有機酸濃度的描述統計分析Tab.6 Descriptive analysis of organic acid and inorganic anion concentrations in natural flavor samples with different raw materials （mg·g-1）

3 結論

①天然香料中有機酸和無機陰離子的分布特征具有廣泛性和差異性。②天然香料中有機酸和無機陰離子的分布特征與產品類型相關，濃縮物、提取物和浸膏中的有機酸和無機陰離子濃度均值高于精油和凈油，酊劑和樹脂中有機酸和無機陰離子的濃度均值居中，這可能是由于不同產品類型天然香料對應提取方式存在差異所導致的結果。③天然香料中有機酸的分布特征與原料種類相關，棗類天然香料中的富馬酸濃度均值和梅子類天然香料中的檸檬酸濃度均值高于其他原料種類的天然香料，這可能是由于原料自身所含有機酸濃度存在差異所導致的結果。④天然香料中有機酸和無機陰離子的分布特征可以作為天然香料品質評價的指標，為卷煙調香過程中天然香料的選擇提供參考。