lncRNA-ATB介導的上皮間質轉化在胃癌進展中的機制研究

智亮輝 劉偉 李偉 甄四虎 焦喜林

在我國，胃癌是第三大高發惡性腫瘤，早期診斷率低，超過70%的患者初診時已處于進展期[1]，腫瘤發生局部侵襲和遠處轉移是其特有的生物學行為，也是導致患者死亡率升高的主要原因。上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細胞在特定的生理和病理情況下向間質細胞轉化的現象，是腫瘤發生浸潤、轉移的重要機制[2]。雖然目前包括手術、放療、化療和生物治療等胃癌的綜合治療手段有很大提高，但總體5年生存率仍低于20%[3-4]。因此探尋新的胃癌早期診治標志物及新的治療靶點、阻斷其侵襲轉移進程，對于延長胃癌患者的生存時間具有重大意義。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類保守性差、組織特異性強，長度超過200個核苷酸的RNA序列[5]。國內外研究表明lncRNA在多種惡性腫瘤中高表達，對腫瘤侵襲轉移等生物學行為發揮重要的調控作用[6]。其中lncRNA-ATB在肝癌、結腸癌、肺癌等腫瘤中均存在異常表達，并可做為診斷的生物標志物，及潛在的生物治療靶點[7]，但其在胃癌中的作用及具體調控機制尚待研究。微RNA(miRNA)是一類長度約22個核苷酸的非編碼RNA，可以作用于目的基因的3′非翻譯區(3′-untranslated region，3′-UTR)，誘發蛋白質翻譯抑制，阻止蛋白質合成，從而在細胞生物活動中發揮重要的調控作用[8]。近年來許多研究表明，miR-200家族參與調控多種腫瘤細胞的侵襲和轉移過程，其中miR-200a的表達與胃癌的侵襲和轉移密切相關[9]，但其具體機制尚待研究。本研究預測了lncRNA-ATB的下游結合分子，并探索其可能的作用機制。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取聯勤保障部隊第九八〇醫院2017年1月—2019年12月行胃癌根治性手術患者56例，其中女性36例，男性20例；年齡45～75歲，中位年齡58歲。納入研究標準：術前未進行過放化療的Ⅰ～Ⅳ期原發性胃癌患者，術前有胃鏡病理結果明確診斷。癌旁組織定義為距腫瘤邊緣5 cm以上的組織。所有臨床組織標本及病歷資料的使用，均與患者簽署知情同意書，并經醫院倫理委員會批準同意(倫理批號：2019-KY-54)。

1.2 主要試劑和材料

RNA提取及反轉錄試劑盒分別購自美國Thermo Fisher公司、日本TaKaRa公司；熒光實時定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒SYBRPremix Ex Taq TMⅡ購自日本TaKaRa公司；Lipo 2000脂質體轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司；lncRNA-ATB或β-catenin-3′UTR si序列克隆購自美國Creative Biogene公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；人胃癌BGC-823細胞株購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清、RPMI-1640培養基、0.25%胰酶、Penicillin-Streptomycin雙抗購自美國Hyclon公司；RIPA高效蛋白裂解液購自美國Sigma公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自美國Bio-Rad公司；E-cadherin、β-catenin、vimentin和GAPDH抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 lncRNA靶基因預測及驗證 使用TargetSCan數據庫預測lncRNA-ATB的靶基因作用序列(http：//www.targetscan.org/vert_72/)，利用熒光素酶報告基因技術驗證預測內容。miR-200a-modified胃癌細胞接種于6孔板，經過18h培養后，每孔加入1 μg熒光素酶轉染試劑進行轉染。用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定熒光素酶表達量。

1.3.2 qRT-PCR 收集離體半小時內胃癌及癌旁組織于凍存管中，迅速置于液氮中凍存。RNA提取及反轉錄試劑盒按照說明操作，最終得到cDNA置于-20℃保存備用。qRT-PCR按照說明書進行實驗，共重復3次。lncRNA-ATB引物序列：上游5-CTTCACCAGCACCCAGAGA-3；下游5-AAGACAGAAAAACAGTTCCGAGTC-3；內參GAPDH引物序列：上游5-TTGGTATCGTGGAAGGACTC-3；下游5-TGTCATCATATTTGGCAGGTT-3；miR-200a特異性引物由德國凱杰公司合成，引物序列：上游5-ATCCAGTGCAGGGTCCCGAGG-3，下游引物為miScript SYBR Green PCR Kit 提供的通用引物，qRT-PCR 反應條件為：95℃預變性45 s，75℃15 s，60℃30 s，35個循環，每組3個復孔，實驗重復3次。記錄各組反應的CT值，以2-△△CT表示目的基因的相對表達量。

1.3.3 細胞培養及轉染 人胃癌BGC-823細胞株及敲低lncRNA-ATB后的人胃癌BGC-823細胞株(課題組前期已構建并驗證)在含10%胎牛血清的RPMI-1640細胞培養基中進行培養，培養條件為5% CO2、37℃。

1.3.4 Western blot實驗 取生長狀態良好且處于對數生長期的人胃癌BGC-823細胞及敲低lncRNA-ATB后的人胃癌BGC-823細胞株，用無菌的PBS清洗細胞2遍，用胰酶消化處理細胞，3 000 rpm離心5 min，棄去上清，在細胞沉淀中加入適量RIPA快速細胞裂解緩沖液提取細胞總蛋白，冰浴15 min，混合液在4℃離心15 min(13 000 r/min)后收取上清液，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定提取液濃度，再向提取裂解液中加入5×SDS上樣緩沖液以備電泳，95℃加熱5 min，并在SDS聚丙烯酰胺凝膠上進行蛋白電泳，將目的條帶轉移到PVDF膜上。然后加一抗(兔抗E-cadherin、β-catenin、vimentin抗體，稀釋比分別為1∶200、1∶300、1∶200)4℃搖床過夜，第二天，去除一抗，PBS清洗2遍，每次10 min，再加入羊抗兔IgG HRP二抗(稀釋比為1∶1 0000)，常溫避光搖床孵育2 h，將熒光ECL檢測試劑中的A液和B液等體積混合配成顯影液，滴加到PVDF膜上，使用LAS4010儀器進行曝光。實驗重復5次。GADPH作為內參對照。應用Image J軟件進行半定量分析。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 生物信息學預測lncRNA-ATB與miR-200a及β-catenin的結合位點

lncRNA-ATB通過競爭性結合miR-200a調控β-catenin的表達(圖1)。利用熒光素酶報告基因技術驗證在胃癌細胞BGC-823中敲低lncRNA-ATB，miR-200a熒光素酶活性較敲低前表達明顯下降，差異有統計學意義(t=75.262，P<0.001)(圖2)。敲低β-catenin后，miR-200a熒光素酶活性較敲低前表達明顯下降，差異有統計學意義(t=47.656，P<0.001)(圖3)。

圖1 生物信息學預測lncRNA-ATB與miR-200a及β-catenin的結合位點Figure 1 Bioinformatics prediction of binding sites for lncRNA-ATB and miR-200a and β-catenin

圖2 在BGC-823細胞中轉染sh-lncRNA-ATB序列后測定miR-200a熒光素酶活性Figure 2 Determination of miR-200a luciferase activity after transfection of sh-lncRNA-ATB in BGC-823 cellsNote：***P<0.001.

圖3 在BGC-823細胞中轉染sh-β-catenin-3′UTR后測定miR-200a熒光素酶活性Figure 3 Determination of miR-200a luciferase activity after transfection of sh-β-catenin- 3′UTR in BGC-823 cellsNote：***P<0.001.

2.2 胃癌及癌旁組織中lncRNA-ATB和miR-200a表達水平比較

lncRNA-ATB在胃癌組織中的表達水平高于癌旁組織，差異有統計學意義(t=-15.825，P<0.001)(圖4)。miR-200a在胃癌組織中的表達水平低于癌旁組織，差異有統計學意義(t=11.629，P<0.001)(圖5)。

圖4 lncRNA-ATB在胃癌及癌旁組織中的表達水平Figure 4 Expression of lncRNA-ATB in gastric cancer and para-cancer tissuesNote：***P<0.001.

圖5 miR-200a在胃癌及癌旁組織中的表達水平Figure 5 Expression of miR-200a in gastric cancer and adjacent tissuesNote：***P<0.001.

2.3 胃癌組織中lncRNA-ATB與miR-200a的表達水平相關性分析

在胃癌組織中lncRNA-ATB與miR-200a表達水平呈負相關(r=-0.317，P=0.017)(圖6)。

圖6 胃癌組織中lncRNA-ATB和miR-200a表達相關性Figure 6 Correlation between lncRNA-ATB and miR-200a expression in gastric cancer

2.4 胃癌組織中lncRNA-ATB及miR-200a的表達與臨床病理特征的關系

胃癌組織中lncRNA-ATB及miR-200a表達水平與淋巴結轉移、TNM分期分化程度、脈管內有無癌栓有關(P<0.05)，而與患者性別、年齡無關(P>0.05)(表1)。

2.5 敲降lncRNA-ATB后EMT相關指標的變化

在胃癌細胞BGC-823中敲降lncRNA-ATB后，vimentin(t=9.032，P=0.011)及β-catenin表達量(t=25.117，P<0.001)降低，E-cadherin表達量(t=-14.697，P<0.001)升高，差異具有統計學意義(圖7)。

圖7 在胃癌細胞BGC-823中敲降lncRNA-ATB后vimentin、β-catenin、E-cadherin表達水平Figure 7 Expression levels of vimentin，β-catenin and E-cadherin after knockdown of lncRNA-ATB in gastric cancer cell BGC-823Note：*P<0.05，***P<0.001.

表1 胃癌組織中lncRNA-ATB和miR-200a表達水平與臨床病理特征的關系Table 1 Relationship between lncRNA-ATB and miR-200a expression levels and clinicopathological features in gastric cancer

3 討論

侵襲和轉移過程一般是指惡性腫瘤細胞與細胞外基質松解脫離，經過淋巴或血運等途徑到達身體其它部位或器官并形成定植的過程。該過程是一個多階段、多步驟的過程，多個基因及其產物參與調控[10]。EMT以上皮細胞表型喪失，間質特征獲得為主要特征，在組織纖維化及腫瘤的侵襲和轉移過程中發揮重要作用。在該過程中腫瘤細胞失去極性和細胞間連結，轉變成具有運動能力的間質細胞，可通過局部浸潤或脈管系統到達遠隔組織[11]。E-cadherin是上皮細胞的標志性蛋白，擔負上皮細胞間黏附和連接作用，維持上皮細胞的形態、極性及完整性。當E-cadherin表達下調時，上皮細胞間黏附力減弱，促進EMT的發生[12]。

近年研究發現miRNA在調控腫瘤生物學行為方面發揮重要作用[13]。miRNA是一種由內源基因編碼的長度約22個核苷酸的非編碼RNA，其特異性堿基序列可與目的基因3′-UTR特異性結合，導致目的基因降解或誘發蛋白質翻譯抑制，從而發揮負調節的作用，進而影響細胞的分化及存活[14]。近年許多研究表明，miR-200家族參與調控了多種腫瘤細胞的侵襲和轉移過程，對于miR-200的研究逐漸深入[15-16]。miR-200是一種與EMT密切相關的miRNA家族，其家族成員包括miR-141、miR-429、miR-200a、miR-200b和miR-200c，其中miR-200a可通過直接作用于E-cadherin的轉錄抑制因子β-catenin而調控EMT的進程[17-18]。

有研究表明lncRNA-ATB在多種惡性腫瘤的發生發展中發揮重要的調控作用，廣泛參與了惡性腫瘤細胞的進展過程[19]，其在結直腸癌和肝癌的發展進程中的作用已經得到證實[20-21]。但lncRNA-ATB在胃癌中的具體作用機制尚無研究報道。生物信息學分析發現，lncRNA-ATB與miR-200a、miR-200a與β-catenin有直接的結合位點。

本研究采用生物信息學方法預測lncRNA-ATB與miR-200a及β-catenin可以直接結合，在胃癌細胞BGC-823中，采用熒光素酶報告實驗證實，敲降β-catenin的3′-UTR后，miR-200a的表達水平顯著降低。敲降lncRNA-ATB后，miR-200a的表達水平顯著降低，這些結果進一步驗證了上述推斷。采用qRT-PCR方法檢測了胃癌及癌旁組織中lncRNA-ATB和miR-200a 的表達水平，lncRNA-ATB和miR-200a表達的相關性分析提示，lncRNA-ATB對miR-200a表達具有明確的負調控作用。分析了這兩種RNA與胃癌患者臨床病理特征之間的關系，結果顯示，lncRNA-ATB在胃癌組織中較癌旁組織呈高表達狀態，在Ⅲ、Ⅳ期胃癌較Ⅰ、Ⅱ期表達水平明顯升高，淋巴結轉移陽性組較陰性組lncRNA-ATB表達水平明顯升高。miR-200a在胃癌組織中較癌旁組織呈低表達狀態，在Ⅲ、Ⅳ期胃癌較Ⅰ、Ⅱ期表達水平明顯降低，淋巴結轉移陽性組較陰性組miR-200a表達水平明顯降低。在胃癌細胞中敲降lncRNA-ATB后，E-cadherin表達升高，β-catenin和vimentin表達下降，研究證實lncRNA-ATB通過與miR-200a結合促進了胃癌細胞EMT進程。在胃癌進展階段發揮關鍵作用。

綜上所述，本研究檢測了lncRNA-ATB和miR-200a在胃癌組織及癌旁組織中表達，并驗證了二者呈負相關，探索了lncRNA-ATB可能通過與miR-200a結合，調控EMT過程從而促進胃癌的發生發展，為研究胃癌侵襲轉移潛在的分子機制提供了一定的前期研究基礎。