水稻優質抗稻瘟病新種質的創制

朱業寶，陳立喆，王金英，江 川

（福建省農業科學院水稻研究所/福建省稻種質資源庫（圃），福建福州350018）

關鍵字：水稻；優質；稻瘟病抗性基因；恢復系

水稻是中國最主要的糧食作物之一，以大米為主食占比超過一半，其對國家糧食安全起到重要作用。稻瘟病是水稻生產的重要病害之一。生產實踐表明，培育和利用抗稻瘟病品種是最經濟、有效防控稻瘟病的手段［1］。然而，由于稻瘟病菌株會發生定向變異，攜帶有單一或少數稻瘟病抗性基因的品種會隨著種植年限的增長，品種抗性會逐漸喪失［2］。因此，篩選并應用新的抗病種質資源，將對應于各種稻瘟病菌無毒基因的水稻抗性基因都聚合到同一栽培品種中，有助于培育廣譜、持久稻瘟病抗性新品種，對于水稻穩產、減少農藥的使用量，降低生產成本，減少污染,保證糧食安全均具有重要的意義。

隨著分子生物學的發展，國內外已克隆稻瘟病抗性基因至少有35個［3］，為稻瘟病抗性基因的檢測和利用提供重要保障。目前，科研工作者對稻瘟病抗性基因在水稻種質資源的分布進行了較多的研究［4-8］，這些研究為分子標記輔助選擇在新品種選育研究方面奠定了基礎。在分子標記輔助選擇育種也有較多研究者開展此項研究。陳建民等［9］利用與抗白葉枯病基因Xa23和抗稻瘟病基因Pi9連鎖的標記，將這2個抗性基因聚合到感病雜交稻恢復系閩恢3139，改良株系所配組合基本保持閩恢3139的農藝性狀和配合力，可直接應用于生產或作抗性育種親本。倪大虎等［10］利用分子標記輔助選擇和傳統育種相結合的方法，將稻瘟病基因Pi9和抗白葉枯基因Xa21和Xa23聚合于同一株系中，獲得了4個三基因聚合且農藝性狀較好株系。閆成業等［11］通過雜交、回交和分子標記輔助選擇技術，將抗褐飛虱基因Bph14和Bph15基因同時導入到水稻恢復系R1005中，獲得3個含雙基因株系，其中2個株系的農藝性狀和R1005相近。陳紅旗等［12］利用基因重組技術結合MAS技術，將分別攜帶稻瘟病抗性基因Pi-1和Pi-33和Pi-22個材料導入金23B中，抗病頻率提高到96.7%，說明隨著稻瘟病抗性基因聚合數目的增加，抗譜也顯著拓寬。前人研究結果進一步證明，分子標記輔助選擇改良材料稻瘟病抗性是切實可行的。

本研究通過前期已篩選到的攜帶多個稻瘟病抗性基因的國外引進種質資源IR79193-83-1-1-1為親本［13］，通過雜交將抗病基因轉移到恢復系材料中，對分離世代的不同基因組合材料進行稻瘟病田間抗性鑒定，同時對分離世代進行堿消值和堊白等米質性狀進行篩選，以期篩選到米質優、稻瘟病抗性強的新材料，為培育具有稻瘟病抗性強的優質水稻新品種打下理論與實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

抗性供體親本：國外引進抗性材料IR79193-83-1-1-1；抗性受體親本：恢復系親本幫恢609。

1.2 DNA提取和檢測

按Wang 的SDS抽提法提取水稻基因組DNA［14］。用于PCR擴增的引物相關信息見表1。引物由華大基因合成。研究選取稻瘟病基因Pi9、Pi5、Pikm、Pita4個基因，其功能標記PCR擴增方法參照表1相應文獻。PCR產物檢測在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，用4S GelRed核酸染料染色后，在凝膠成像系統上拍照。為確保結果準確、可靠，每個樣品擴增2次。

表1 稻瘟病相關基因的基因型鑒定涉及的引物序列及相關信息

1.3 群體構建與后代篩選

2016年海南以幫恢609為母本，IR79193-83-1-1-1為父本配制雜交組合，2017年將樂中稻種植F1，2017年海南陵水種植2 000株F2，通過表型篩選獲得株葉態較好材料105份，從F2開始，每代均開展米質和外觀篩選和稻瘟病基因分子標記輔助選擇，獲得惡白粒率低、堿消值高、攜帶抗病基因品系，并在上杭茶地稻瘟病鑒定基地進行抗性鑒定，通過連續多代的重復篩選與鑒定，獲得了抗性好，米質好的品系。

1.4 稻瘟病抗性鑒定

稻瘟病自然誘發鑒定苗瘟，鑒定點選在福建省上杭縣茶地鎮的國家、省級水稻新品種抗性鑒定示范基地，該鑒定點屬福建省水稻稻瘟病常發病、重發病地區，旱圃法鑒定，按0～9級標準調查病情，調查和評價參照統一標準進行［19］。

1.5 表型性狀鑒定

農藝性狀評價于2020年在海南陵水試驗田進行，考察性狀包含成熟期、株高、有效穗、穗長、穗粒數、結實率、谷粒長度，谷粒寬度、千粒重等性狀，谷粒性狀用萬深大米外觀品質檢測儀（型號：SC-E）采集數據。農藝性狀、惡白粒率和堿消值評價標準參照水稻種質資源描述規范和數據標準［20］。

2 結果與分析

2.1 親本抗性、米質外觀及堿消值檢測

對親本幫恢609和IR79193-83-1-1-1進行稻瘟病自然誘發鑒定、堿消值測定和惡白粒率鑒定，結果表明幫恢609表現感病，堿消值為3級，惡白粒率85%左右，IR79193-83-1-1-1表現抗病，堿消值為7級，惡白粒率5%左右。

2.2 分子標記輔助改良幫恢609的稻瘟病抗性

表型篩選獲得株葉態較好材料105份，利用與Pi9、Pi5、Pikm、Pita等4個基因的功能性分子標記對材料進行檢測，選擇含有抗性基因的單株加代選擇，并在隔代上杭茶地進行稻瘟病抗性鑒定，最終篩選出5份農藝性狀優良、群體穩定的、含有目標基因（Pi9、Pi5）且田間表現抗稻瘟病的高代株系材料。

2.3 改良恢復系的主要農藝性狀分析

從F2代開始即對表型篩選獲得株葉態較好材料進行惡白粒率和堿消值鑒定篩選，在低世代篩選高堿消值株系，后代遺傳力高，低世代株系堿消值高且無分離，該株系下一代基本為堿消值高的材料，惡白粒率性狀的低世代篩選能提高效率。因此，在低世代進行堿消值和惡白率篩選很有必要，可以極大減少工作量。對5份改良系和親本在海南陵水成熟期進行農藝性狀調查（表2）。從表中可以看出，創制的5個株系，有效改良了堿消值和惡白情況，基本聚合了2個親本的優良性狀。

表2 親本及后代材料的表型考察結果

3 討論

稻瘟病抗性和優質稻育種一直是育種家的關注焦點。隨著眾多抗稻瘟病基因的定位和克隆，相關基因標記的開發和應用已成為水稻抗稻瘟病育種最重要的手段之一［21-23］。分子標記輔助選擇技術是隨著分子生物學及生物信息學技術的發展而產生的新的選擇手段，分子標記輔助選擇不受基因表達、環境條件及植株生長發育階段的影響，也不受雜交方式的影響，在植株的苗期或低世代即可進行篩選，具有較多的優點，特別是表型鑒定比較困難或表型檢測費時費力的目標性狀。本研究采用一次雜交，低世代進行分子標記輔助選擇，結合稻瘟病抗性鑒定，能在低世代即可淘汰非目標性狀株系，減少工作量并增加了選擇效率。

稻瘟病基因常與不良性狀連鎖［24］，本研究采用連續多代的堿消值測定和惡白粒率篩選，能夠快速獲得堿消值高，惡白粒率低的材料，減少工作量，避免了品種選育的盲目性，證明加強對分離低世代目標性狀鑒定篩選是優質稻育種的有效途徑。

研究利用已知攜帶抗稻瘟病基因，且米質外觀好，堿消值高的外引種質資源，與配合力好，但惡白粒率高和堿消值偏低的恢復系材料幫恢609雜交，通過對分離世代連續多代分子標記輔助選擇、田間稻瘟病抗性鑒定、外觀篩選和堿消值測定，最終獲得5份攜帶多個抗稻瘟病基因，且米質外觀好、堿消值高、抗稻瘟病強的中間材料，為下一步雜交水稻新品種選育和種質創新提供材料。