水稻紅米品種選擇的分子標記設計

劉 盼，江良榮，黃榮裕，黃育民，王侯聰，鄭景生

（廈門大學生命科學學院，福建廈門361102）

隨著生活水平提高，人們開始注重營養保健，對功能性大米尤其是種皮富含微量元素和花青素的紅米、紫米和黑米有更多需求。紅米有活血補血、消腫散淤、潤膚止癢等功效，具有較高營養價值和藥用價值，在民間多被稱為神仙米、補血米、長壽米、藥米等。遺傳研究結果顯示，水稻的紅色種皮性狀大多數由1對顯性基因控制［1-3］，該基因位于第7號染色體上［3-7］。Sweeney 等［4］研究表明，Rc 基因編碼一個具有bHLH結構的Myc類轉錄因子，白米品種Rc基因的第6外顯子上有14bp的缺失，導致花青素無法合成而使種皮呈現白色。傳統的紅米品種株型差、產量低、口感不好，因此選育優質高產的紅米品種引起育種者重視，并育成許多優質高產的紅米品種如贛晚秈33號［8］、高優紅88［9］、南兩優紅3號［10］等。然而，采用傳統育種技術培育紅米新品種時，如用回交方法難以在回交世代選擇到紅米種皮基因型雜合或純合的單株，在分離后代難以選出紅米種皮基因型純合的株系，降低育種效率。然而，分子標記輔助育種技術不受外界環境條件影響，而且有較高選擇準確性和育種效率，因而受育種家重視。為快速、準確選育紅米水稻新品種，提高育種效率，本研究應用水稻第7號染色體上紅米品種和白米品種種皮的基因序列差異，設計可用于準確鑒別水稻紅米種皮基因型、呈共顯性的分子標記并進行驗證，為應用分子標記輔助快速、有效選育紅米水稻新品種提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 研究材料和田間種植

研究材料為前期引進或保存的種質資源 （表1）：紅米品種17個、白米品種7個和紫（黑）米品種6個及用白米品種蜀恢527和紅米品種培雜191雜交的部分F2分離群體單株，各材料均種植于廈門大學龍?；?。種植的株行距20 cm×20 cm，每行種8株，單本插植，田間管理與一般大田相同。成熟時各材料分別單株收獲，曬干后用糙米機脫殼后觀察糙米種皮顏色。

表1 不同水稻品種的種皮顏色及紅米種皮的分子標記檢測分析

1.2 水稻紅色種皮基因的分子標記設計

利用水稻7號染色體上的紅色種皮與白色種皮品種間的堿基序列差異，即白米種皮的第6外顯子缺失14bp，采用Vector NTI Advance 11軟件，設計3對可用于輔助選擇區分水稻紅色種皮性狀的共顯性分子標記（表2），然后用表1中的30個不同種皮顏色的水稻品種及R527/培雜191組合的F2群體中隨機選擇已鑒定種皮顏色的部分單株，用于驗證這3對紅米種皮分子標記。

表2 水稻紅色種皮性狀的功能性特異性分子標記引物

1.3 DNA提取

各材料取分蘗期的嫩葉于2 mL離心管中，帶回室內冷藏于-20℃冰箱或冰柜，參照王珍等［13］的方法快速提取DNA。

1.4 PCR反應體系和程序

PCR反應體系和反應程序具體參考鄭景生等［14］的方法。

1.5 PCR產物擴增檢測

PCR擴增產物的分離檢測采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用快速銀染法進行染色，記錄各條帶的基因型后照相保存，具體參考鄭景生等［14］的方法。

2 結果與分析

2.1 水稻紅色種皮性狀的分子標記可準確鑒定不同品種的種皮顏色

30個水稻品種稻谷脫殼后觀察其糙米種皮顏色，看出：編號為1-17的水稻品種種皮為紅色，編號為18-24的水稻品種種皮為白色，編號為25-30的水稻品種種皮為紫色或黑色（表1）。用本研究設計的水稻紅色種皮性狀的分子標記HS-1、HS-2和HS-3對這30個水稻品種的DNA進行PCR擴增和凝膠電泳檢測（表1、圖1），結果表明：分子標記HS-1、HS-2、HS-3均能擴增出特異性條帶，紅米品種的條帶分別為193bp、106bp、131bp，非紅米品種（白米或紫米、黑米）的條帶分別為179bp、92bp、117bp。將各水稻品種的分子標記DNA擴增條帶結果與其糙米種皮顏色相比較，發現分子標記HS-1、HS-2和HS-3對30個水稻品種的種皮顏色DNA鑒定結果與表型的鑒定結果相同?？梢?，水稻紅色種皮性狀的分子標記HS-1、HS-2和HS-3均可用于鑒定水稻紅米品種和非紅米品種。

圖1 紅米種皮分子標記HS-1、HS-2和HS-3在不同水稻品種的電泳條帶

2.2 水稻紅色種皮性狀的分子標記可準確鑒定紅米品種雜交后代分離群體單株的種皮顏色

為進一步驗證水稻紅色種皮選擇的分子標記HS-1、HS-2、HS-3是否能準確鑒定紅米品種雜交后代群體單株的糙米種皮顏色，從白米品種R527與紅米品種培雜191 的雜交后代（F2）分離群體中，隨機選取種皮的顏色已經鑒別的部分單株的DNA用于PCR擴增、凝膠電泳檢測，圖2結果看出：HS-1、HS-2、HS-3對R527/培雜191 F2代分離群體單株均能擴增出3種不同基因型的條帶，即基因純合顯性的紅米、基因純合隱性的非紅米及基因雜合型的紅米，各單株糙米種皮顏色的DNA鑒定結果與其表型相吻合。說明水稻紅色種皮性狀的分子標記HS-1、HS-2和HS-3均可準確鑒定紅米雜交后代群體中各單株的糙米種皮顏色基因型，可快速準確選擇出紅米種皮基因型純合的單株。

圖2 分子標記HS-1、HS-2和HS-3在R527/培雜191 F2群體的部分單株電泳條帶

由此可見，水稻紅色種皮性狀的分子標記HS-1、HS-2和HS-3都可以準確鑒定水稻紅色種皮性狀，快速從雜交后代群體中篩選出紅米種皮基因型純合的株系。但從這3對標記的PCR擴增穩定性、擴增產物電泳所需時間和電泳條帶清晰度進行綜合分析看出，HS-2具有擴增穩定、條帶清晰、條帶間差異最明顯、引物片段小、電泳時間短的特點。綜上，研究認為，HS-2是分子標記輔助選育水稻紅米品種較為可靠的標記引物，可提高選育紅米品種的效率。

3 討論

分子標記輔助選育已成為當前選育作物新品種的一項重要技術，它在分子水平上對目標性狀的選擇不受其它基因或環境條件的影響，可避免等位基因間的顯隱性關系干擾，選擇結果很可靠，且可在育種的早世代完成，尤其是對感官難以鑒別的性狀，如抗病、食味品質、香味等具有較高的選擇效率，從而大大縮短育種周期。目前該技術已在水稻抗病蟲［15-17］的目標性狀選擇取得良好效果。紅米具有重要的營養保健功能而受到人們重視，為加快紅米育種效率，魏文嵩等［11］、張亭亭等［12］設計出可對紅米品種進行分子標記選擇的引物，有利提高紅米品種的育種效率。

本研究基于水稻第7號染色體上紅米與非紅米種皮基因序列差異，即白米品種第6外顯子缺失14bp，設計出3對水稻紅色種皮分子標記HS-1、HS-2和HS-3（表2），這3對標記可準確鑒定紅米和非紅米水稻品種、準確區分紅米雜交后代群體紅米種皮純合顯性、純合隱性和雜合基因型的植株，對有效選育紅米新品種具有很大幫助。其中，HS-2具有擴增穩定、條帶清晰、電泳時間短等特點而成為本研究推薦的MAS選擇紅米品種的首選分子標記。