CO2 點陣激光結合絲素蛋白載積雪草苷水凝膠治療兔耳增生性瘢痕的實驗研究

楊艷 商穎 呂強 張振

創面異常愈合通常會導致增生性瘢痕甚至瘢痕疙瘩的形成[1-2]。增生性瘢痕可能會導致局部功能障礙，給患者帶來巨大的負擔[3]。目前，瘢痕治療方法眾多，但效果不一，患者接受程度也不同[4-6]。瘢痕局部注射常伴有不良反應，且藥物無法在瘢痕組織中長期維持高濃度[7]；局部涂抹藥物具有特異性高、方便、副作用少等優點，但藥物難以滲透致密的瘢痕組織而導致療效不佳[8-9]。因此，提高藥物透皮效率是改善瘢痕治療效果的重要因素。

2009 年以來，激光輔助透皮給藥治療增生性瘢痕的研究有了相關報道[10]。CO2點陣激光作為一種常用剝脫性點陣激光，通過產生點陣排列的微小激光束破壞皮膚角質層和真皮層，形成致密的微孔通道，能夠迅速增加局部皮膚的藥物吸收[11]。Wang 等[12]在一項臨床研究中發現，CO2點陣激光聯合曲安奈德能改善瘢痕疙瘩并降低復發率，認為CO2點陣激光能很好地促進藥物透皮[13]。

絲素蛋白水凝膠（SNF）是一種具有良好生物相容性的天然納米纖維。SNF 作為一種親水-疏水-親水聚合物，能負載水溶性藥物或脂溶性藥物[14]。此外，SNF 通過緩釋給藥，延長了藥物在病灶內的滯留時間，有助于藥物持續發揮作用[15]，是一種理想的藥物載體。積雪草苷（AC）已廣泛用于抗瘢痕治療，具有抗炎、促進傷口愈合、減少瘢痕形成的作用[16-18]。但AC 是疏水性藥物，透皮困難。

本研究通過將疏水性AC 加載于SNF，形成SNF-AC，對其進行表征，探討SNF 作為藥物載體的可行性，并評價在CO2點陣激光作用下，SNF-AC 對兔耳增生性瘢痕的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器

AC（MCE，美國），高效液相色譜（Thermo Fisher，美國），C18 柱（Thermo Fisher，美國），原子力顯微鏡（Bruker Dimension ICON，德國），共焦拉曼光譜儀（InVia Qontor，Renishaw，英國），流變儀（Thermofisher Scientific，美國）。

1.2 絲素蛋白水凝膠制備

絲素蛋白溶液（質量分數6%）60 ℃下經過24 h濃縮到質量分數約20%，形成亞穩態納米顆粒，去離子水稀釋到質量分數2%，置于60 ℃恒溫干燥箱中孵育24 h 以上，形成穩定的水凝膠[19]。該制備過程由蘇州市現代絲綢技術國家工程實驗室，蘇州納米科技協同創新中心完成。

1.3 絲素蛋白載積雪草苷水凝膠制備

將疏水的AC 溶解在甲醇中，然后與SNF（質量分數2%）按體積比1:1 混合。200 r/min 攪拌24 h后，將混合溶液以10 000 r/min 離心30 min，分離絲素蛋白載積雪草苷水凝膠和甲醇。絲素蛋白載積雪草苷水凝膠用蒸餾水洗滌3 次以去除殘留的甲醇，制備成SNF-AC[14]。收集離心上清液計算未加載AC含量，采用高效液相色譜，C18 柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）測定溶液中AC 含量。流動相為乙腈/水（25∶75 至2 min；90∶10 至8 min；25∶75 至10 min），流速為1.0 mL/min。檢測波長為532 nm。AC 的加載效率（LE）和加載能力（LC）計算公式如下：

LE(%)＝(Wt-Wf)/Wt×100%

LC(%)＝(Wt-Wf)/Ws×100%

式中Wt 為AC 的總質量，Wf 為上清液中未加載的AC 的質量，Ws 為絲素蛋白水凝膠的總質量。

1.4 絲素蛋白載積雪草苷水凝膠表征

原子力顯微鏡（AFM）檢測樣品的形態。樣品1∶1 000 稀釋，在超聲中分散10 min，然后旋涂2 μL 溶液到干凈的云母表面，用氮氣吹干表面。共焦拉曼光譜儀（532 nm 半導體激光器）評估SNF 中AC 的負載情況。流變儀（Mars40）測量SNF 和SNF-AC 的流變性能。25 ℃下以0.1～100 rad/s 的頻率掃描范圍內連續采集貯存模量（G'）和損耗模量（G''），在0.1～100 s-1的剪切速度范圍內檢測SNF-AC 和SNF 的流動曲線。

1.5 兔耳增生性瘢痕模型

成年雄性新西蘭大白兔6 只，體質量約2 kg，單籠飼養2 周（SLAC，上海）。鹽酸賽拉嗪注射液（陸眠寧）聯合氯胺酮按每100 克體質量1.5 mg 肌內注射麻醉。在兔耳上用手術刀產生直徑為1 cm 的圓形傷口，去除全層皮膚和軟骨膜，保留軟骨。每個兔耳上產生4 個傷口，所有傷口均環繞兔耳中點，均勻分布。28 d 后兔耳創面愈合完全，可見直徑約0.9 cm 的增生性瘢痕，顏色鮮紅，質硬。本研究經上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院倫理委員會審核批準（SH9H-2019-TK206-1）。

將48 個成熟的兔耳增生性瘢痕隨機分為4 組（每組12 個）：①L+SNF-AC 組，CO2點陣激光處理后，在增生性瘢痕表面涂抹2.5 mg/mL SNF-AC 100 μL，每天2 次；②L 組，CO2點陣激光處理；③SNF-AC 組，只涂抹SNF-AC 2.5 mg/mL 100 μL，每天2 次；④Control 組，即空白對照組，無任何處理。激光治療參數：DeepFX 模式，能量密度25 mJ，覆蓋率20%，頻率300 Hz，10 號光斑大小，治療1 次。

分別在治療后第7、14 天，靜脈注射過量戊巴比妥鈉處死實驗兔，用帶表卡尺測量增生性瘢痕厚度，獲取兩處讀數，A 為單個兔耳增生性瘢痕組織最高處的厚度，B 為離該最高處1.0 cm 兔耳皮膚厚度（靠近兔耳中心點處）。計算相對厚度公式如下：相對厚度＝A/B（相對厚度變化值即為治療前后相對厚度的差值）。2 名皮膚科醫生肉眼評估瘢痕的血管分布情況。根據溫哥華瘢痕量表評估增生性瘢痕模型。大體觀察后將標本以4%多聚甲醛固定24 h，脫水，石蠟包埋，切片（厚度7 μm），分別行HE 染色和Masson染色，觀察各組增生性瘢痕的組織結構和膠原纖維的變化情況。

1.6 統計學分析

數據統計采用GraphPad Prism 軟件（Version 9.00，GraphPad Software，美國），數據以表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 絲素蛋白載積雪草苷水凝膠表征

原子力顯微鏡顯示，加載AC 后絲素蛋白納米纖維絲的直徑略有增加，但無明顯聚集，表明藥物黏附于絲素蛋白納米纖維絲并呈現均勻分布（圖1A、B）。SNF 的流變學特性，包括貯存模量（G'）、損耗模量（G''）和黏度，在加載AC 后沒有出現明顯變化（圖1C、D）。SNF-AC 的拉曼光譜既在450～650 cm-1表現出典型的AC 峰，又在1 669 cm-1表現出典型的SNF 峰，證明了AC 的成功加載（圖1E）。將4 mg/mL AC 加載到SNF 中，最終獲得含有2.832 mg/mL AC的SNF-AC，其LE 為70.8%，LC 為0.283%。

圖1 絲素蛋白水凝膠和絲素蛋白負載積雪草苷水凝膠的表征Fig.1 Characterization of SNF and SNF-AC

2.2 兔耳增生性瘢痕治療結果

治療后第7、14 天，4 組的相對瘢痕厚度均降低，第7 天時，L+SNF-AC 組＞L 組＞SNF-AC 組＞Control 組，且L+SNF-AC 組和L 組的相對厚度變化值顯著高于Control 組（L+SNF-AC 組vs Control 組，P＜0.01；L 組vs Control 組，P＜0.05，圖2A）。第14 天時，L+SNF-AC 組相對厚度變化值均高于其他3 組，但各組間均無統計學差異（P＞0.05，圖2B）。

瘢痕的血管分布評測發現，各組治療后均有所改善。L+SNF-AC 組的增生性瘢痕從鮮紫紅色變成與周圍皮膚顏色相近（圖3A、E、I）；L 組的增生性瘢痕顏色從鮮紫紅色變成膚色偏粉紅（圖3B、F、J）；SNF 組（圖3C、G、K）和Control 組（圖3D、H、L）略有改善，但顏色仍為紅色。第7 天時，血管分布評分改變（圖2C）：L+SNF-AC 組＞L 組＞Control 組＞SNF-AC組，且L+SNF-AC 組血管分布評分改變顯著優于其余3 組（L+SNF-AC 組vs L 組，P＜0.05；L+SNF-AC組vs SNF-AC 組，P＜0.01；L+SNF-AC 組vs Control組，P＜0.01）。第14 天血管分布評分改變（圖2D）：L+SNF-AC 組也顯著優于其余3 組（L+SNF-AC 組vs L 組，P ＜0.001；L+SNF-AC 組vs SNF-AC 組，P＜0.001；L+SNF-AC 組vs Control 組，P＜0.000 1）。

圖2 兔耳增生性瘢痕治療后相對厚度變化和血管分布變化Fig.2 Relative thickness change and vascularity change of rabbit ear hypertrophic scars after treatment

圖3 兔耳增生性瘢痕（標尺：2.5 mm）Fig.3 Rabbit ear hypertrophic scars (Scale bar:2.5 mm)

增生性瘢痕HE 染色顯示，治療后第14 天L+SNF-AC 組增生性瘢痕表面趨于平整，而其余3 組增生性瘢痕表面均有不同程度凸起（圖4）。Masson染色結果顯示，治療后第14 天，L+SNF-AC 組和L組的膠原纖維較整齊，接近正常皮膚組織，而SNFAC 組和Control 組的膠原排列紊亂（圖5）。

圖4 兔耳增生性瘢痕HE 染色Fig.4 HE staining of rabbit ear hypertrophic scar

圖5 兔耳增生性瘢痕Masson 染色（標尺：50 μm）Fig.5 Masson staining of rabbit ear hypertrophic scar (Scale bar:50 μm)

3 討論

增生性瘢痕的臨床治療方法有手術治療和非手術治療，但均無法達到理想的治療效果[20]。在非手術方式中，藥物是主要的治療方法。其中，局部涂抹藥物具有方便、無痛、穩定、副作用小、不經胃腸道環境影響等優點，但增生性瘢痕角質層增厚，真皮增生，藥物的滲透被阻礙，很難達到有效的治療濃度[9]。CO2點陣激光主要用于臨床治療面部皺紋、淺表性瘢痕、色素沉著障礙和改善皮膚質地[21]。此外，CO2點陣激光可在皮膚表面產生微孔通道，破壞皮膚屏障，誘導傷口愈合反應，可很好地促進藥物透皮[22]。

SNF 是一種生物相容性較好的天然生物材料，能夠有效加載不同親疏水性的藥物，在保持藥物活性的同時實現長效的可控釋放，是藥物的理想載體[14]；且SNF 具有高載藥特性，其藥物加載能力比傳統藥物載體脂質體高7 倍[15]。這些特性使SNF 能廣泛應用于多個領域。例如，Ding 等[23]將SNF 載去鐵胺，用于治療糖尿病創面，SNF 載去鐵胺比單獨使用去鐵胺能更有效地促進血管生成，緩解慢性炎癥反應，加快創面愈合。Wu 等[24]將阿霉素加載到SNF，實現化療藥物在局部長達8 周的緩釋，有效抑制了腫瘤的生長。SNF 不僅提高了藥物的穩定性，而且通過緩釋調控，有效加強藥物的藥理作用[25]。本研究成功將抗瘢痕藥物AC 加載到SNF，并結合CO2點陣激光，增加藥物的滲透，提高瘢痕的治療效果。

本研究結果顯示，治療后第7 天，L+SNF-AC 組和L 組增生性瘢痕相對厚度相比Control 組顯著改善，提示CO2點陣激光處理增生性瘢痕后，能夠顯著減少增生性瘢痕的厚度。CO2點陣激光可通過光熱作用，去除表皮和部分真皮，上調多種金屬基質蛋白酶，促進組織重塑[26]，已被用于改善增生性瘢痕的顏色和質地[27]。Zhang 等[28]研究發現，CO2點陣激光能夠促進增生性瘢痕的膠原重塑，從而減少瘢痕厚度。

此外，L+SNF-AC 組的血管分布改善顯著，瘢痕組織內的充血減輕?？赡艿脑颍孩貱O2點陣激光能夠加速并促進藥物透皮。多個研究證明，經過CO2點陣激光處理后，體外皮膚中5-氟尿嘧啶、順鉑或甲氨蝶呤的含量顯著增加[13，29，30]。②AC 可減少炎癥細胞浸潤，抑制炎癥介質如IL-6、TNF-α 的表達[31]，而瘢痕組織內的慢性炎癥反應會導致血管生成，成纖維細胞增殖，膠原沉積[1]。③相比于AC，SNF-AC 能夠通過長期緩釋AC，顯著減少傷口愈合中炎癥因子IL-6 和TNF-α 含量，從而減輕傷口炎癥反應，并促進傷口愈合，減少瘢痕形成[15，25]。本研究中，SNFAC 利用CO2點陣激光產生的臨時微孔通道，進入并布滿于微孔通道內，當通道閉合，已進入瘢痕組織內的SNF-AC 固定在局部起到緩釋藥物的作用，最終達到持續治療增生性瘢痕的作用。

綜上所述，在CO2點陣激光協同下，SNF-AC 對增生性瘢痕具有良好的治療效果，有助于減少增生性瘢痕的相對厚度，并改善血管分布。SNF 可作為抗瘢痕藥物積雪草苷的有效載體。這為實現藥物透皮后的局部給藥以及增生性瘢痕的治療提供一種創新且可行的治療方法。