香葉木素預處理通過抗炎和抗氧化發揮對小鼠肝缺血/再灌注的保護作用

余 偉，黃長山，丁月超，黃 濤，馬 超，張 鍇，王 謙

(鄭州大學附屬腫瘤醫院肝膽胰外科，河南 鄭州 450008)

肝缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)是肝臟手術或肝移植的必要組成部分，在缺血過程中不可避免地會導致肝損傷，再灌注后肝功能也不太可能迅速恢復正常，且還會增加肝損傷[1]。在大多數情況下，肝臟手術后會出現炎癥和損傷，甚至嚴重的肝功能障礙；嚴重的肝I/R損傷還可能導致多器官衰竭甚至死亡[2]。因此，探索能減輕肝I/R損傷的策略對改善患者預后和降低死亡率具有重要意義。

肝I/R損傷涉及復雜的生理過程，如代謝紊亂、氧化應激和炎癥反應等[3]。香葉木素[diosmetin，Dio，5,7-二羥基-2-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-4-苯并吡喃酮，C16H12O6]是一種具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等多種活性的黃酮類化合物。Dio已被報道可減輕心臟、腎臟和其他臟器的I/R損傷[4-6]，且在脂多糖、對乙酰氨基酚等誘導的肝損傷小鼠模型中其能發揮肝保護作用[7-8]。據此推測Dio可能也具有抗肝I/R損傷的功能。而，Dio對肝I/R損傷的作用和機制仍不完全清楚。因此，本研究觀察Dio是否對肝I/R損傷發揮有益作用并探討相關機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑香葉木素(Dio；貨號：465944，北京百靈威科技有限公司)；小鼠白細胞介素(interleukin，IL)-1β(貨號：3748)、IL-6(貨號：4355)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate transaminase，AST)(貨號：10257)和乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)(貨號：12240)ELISA檢測試劑盒(均為江蘇酶免實業有限公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒(貨號：A003-1-2)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)測定試劑盒(貨號：E004-1-1)、還原性谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)測定試劑盒(貨號：A006-2-1)和總膽紅素(total bilirubin，TBIL)測定試劑盒(貨號：C019-1-1)(均為南京建成生物工程研究所)；改良Lowry法蛋白定量試劑盒(貨號：BTN101102)、RIPA裂解液(貨號：BTN131007)、蘇木精伊紅(Hematoxylin-eosin，HE)試劑盒(貨號：YT165)和辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素(HRP-Streptavidin；貨號：YT371)(均為北京百奧萊博科技有限公司)；SP免疫組織化學試劑盒(貨號：SP0041)和West Pico ECL超敏發光液(貨號：PE0020)(北京索萊寶生物技術有限公司)；IL-1β抗體(貨號：WLH3903)、caspase-3抗體(貨號：WL04004)、cleaved-caspase-3抗體(貨號：WL01992)、p38抗體(貨號：WL00764)、p-p38抗體(貨號：WL03428)和HRP標記山羊抗兔IgG(H+L)(貨號：WLA023)(均為萬類生物科技有限公司)；核因子(nuclear factor，NF)-κB p65抗體(貨號：8242)和p-NF-κB p65抗體(貨號：3033)(美國CST公司)；GAPDH抗體(貨號：BA2913)(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 實驗動物♂ SPF級C57BL/6J小鼠(6-7周，19～22 g)購自河南省實驗動物中心(動物生產許可證號：SCXK(豫)2017-0001)。小鼠被安置在鄭州大學實驗動物中心屏障環境動物房[每籠不超過5只小鼠，21 ℃～23 ℃，55%～65%濕度，12 h光照/黑暗周期，動物使用許可證號：SYXK(豫)2020-0008]。所有動物實驗均按照中國動物保健和使用委員會的指南進行，并經鄭州大學倫理委員會機構動物保健和使用委員會批準(批準號：2019-564)。

1.3 儀器顯微鏡(IX53；日本Olympus公司)；酶標分析儀(DNM-9606；北京普朗新技術有限公司)；熒光酶標儀(SpectraMax Gemini EM；美國Molecular Devices公司)；全自動蛋白印跡處理系統(WB-600Auto；廣州博鷺騰生物科技有限公司)；eBlot接觸式化學發光成像系統(eBlot Touch Imager；上海易孛特光電技術有限公司)。

1.4 方法

1.4.1小鼠肝I/R損傷模型及實驗設計 適應性飼養3 d后，將32只小鼠按照隨機數字法分為假手術(Sham)組、I/R組、低劑量Dio組和高劑量Dio組，每組8只。I/R組按照Yang等[9]的方法，用異氟醚麻醉后，解剖腹部并用一個創傷性夾穿過門靜脈三聯體阻斷70%肝動脈/門靜脈血液，并于缺血1 h后，取出夾子行再灌注。Sham組除不進行肝I/R手術外，其余手術步驟同I/R組。低和高劑量Dio組行肝I/R手術前30 min分別通過腹腔注射10 mg·kg-1和40 mg·kg-1Dio，Sham組和I/R組通過腹腔注射等體積的含2% DMSO的生理鹽水。再灌注后24 h，用異氟醚麻醉小鼠，采集各組小鼠的血液和肝臟樣本。

1.4.2HE染色與組織學分析 肝組織樣品在4%多聚甲醛中固定48 h后，并用石蠟包埋。石蠟包埋的肝組織切為5 μm厚的連續石蠟切片后，依次經脫蠟、水合后，用HE染色。兩名研究人員按照Yang等[9]的方法使用光學顯微鏡以盲法評估組織學情況。

1.4.3ELISA法檢測血清中IL-1β、IL-6、LDH和AST的水平 根據制造商的說明，分別采用對應的試劑盒進行ELISA反應，用酶標儀在450 nm處讀取樣品的吸光度值，并根據各自的標準曲線計算血清中IL-1β、IL-6、LDH和AST的水平。

1.4.4試劑盒法檢測肝組織中氧化應激指標和TBIL的水平 將肝組織用冰PBS按照1 ∶9進行勻漿，3 600×g離心收集肝組織勻漿液。用改良Lowry法蛋白定量試劑盒測定肝組織勻漿液中蛋白含量。根據制造商的說明，用硫代巴比妥酸法(酶標儀在波長530 nm處讀取樣品的吸光度值)測量肝組織勻漿液中MDA含量，用化學熒光法(熒光酶標儀在發射波長530 nm處讀取樣品的熒光度值)測量肝組織勻漿液中ROS含量，用二硫代二硝基苯甲酸法(酶標儀在波長405 nm處讀取樣品的吸光度值)測量肝組織勻漿液中GSH含量，用亞硝酸鈉氧化法(酶標儀在波長450 nm處讀取樣品的吸光度值)測量肝組織勻漿液中TBIL含量。肝組織中上述氧化應激指標水平=肝組織勻漿液中上述氧化應激指標含量/肝組織勻漿液中蛋白含量。

1.4.5免疫組織化學染色觀察肝組織中IL-1β的表達 取肝組織切片(5 μm厚)，常規脫蠟、水合、阻斷內源性過氧化氫酶和封閉后，按照常規SP法程序依次孵育IL-1β抗體(1 ∶250稀釋)、Bio-山羊抗兔IgG(1 ∶200稀釋)和HRP-Streptavidin(1 ∶200稀釋)后，用DAB顯色，蘇木精復染，在顯微鏡下觀察染色情況。

1.4.6Western blot檢測肝組織中cleaved-caspase-3、p-NF-κB p65和p-p38蛋白表達 用RIPA裂解液提取蛋白，用改良Lowry法對蛋白定量后，用全自動蛋白印跡處理系統對上樣的蛋白進行電泳、電轉、封閉和抗體孵育。其中，caspase-3、NF-κB p65、p38和GAPDH抗體的稀釋比例均為1 ∶5 000，cleaved-caspase-3、p-NF-κB p65、p-p38和HRP標記山羊抗兔IgG(H+L)的稀釋比例均為1 ∶1 000。用West Pico ECL超敏發光液和eBlot接觸式化學發光成像系統對蛋白進行顯像并分析相對表達水平。

2 結果

2.1 Dio預處理減輕肝I/R損傷HE染色(Fig 1A)顯示，Sham組肝組織基本正常，I/R組肝組織出現大面積壞死和炎性細胞浸潤；低、高劑量Dio組由肝I/R誘導的病理改變得到明顯緩解。H&E染色量化數據(Fig 1B和1C)顯示，與Sham組相比，I/R組肝組織壞死面積和組織學評分均明顯增加(P<0.01)；施用Dio預處理明顯減小了肝I/R后的壞死面積和肝損傷評分(P<0.05或P<0.01)，且高劑量組效果更為明顯。ELISA結果(Fig 1D和1E)顯示，肝I/R后血清LDH和AST水平明顯升高(P<0.01)，施用Dio預處理能明顯降低肝I/R誘導的血清LDH和AST水平(P<0.05或P<0.01)，且高劑量組效果更為明顯。同時，Western blot結果(Fig 1F和1G)顯示，肝I/R后肝組織中cleaved-caspase-3表達水平明顯升高(P<0.01)，施用Dio預處理能明顯降低肝I/R誘導的肝組織中cleaved-caspase-3表達(P<0.05或P<0.01)，且高劑量組效果更為明顯。

Fig 1 Effect of Dio pretreatment on liver injury after liver I/RA: Representative images of H&E staining (scale bar=50 μm); B: Statistical results of necrotic area; C: Statistical results of liver histological score; D: The level of LDH in serum; E: The level of AST in the serum; F and G: cleaved-caspase-3 expression in liver tissues was detected by Western blot n=8); #P<0.01 vs Sham group; *P<0.05, **P<0.01 vs I/R group; △P<0.05 vs Low Dio group.

2.2 Dio預處理改善肝I/R后的肝功能并降低氧化應激和促炎因子水平氧化應激指標結果(Fig 2A-2C)顯示，與Sham組相比，I/R組肝組織中MDA和ROS水平明顯增加(P<0.01)，GSH水平明顯降低(P<0.01)；與I/R組相比，低、高劑量Dio組肝肝組織中MDA和ROS水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，GSH水平明顯增加(P<0.05或P<0.01)，且高劑量組變化更為明顯；說明Dio預處理能抑制肝I/R誘導的氧化應激。TBIL檢測結果(Fig 2D)顯示，低、高劑量Dio預處理均能部分逆轉肝I/R導致肝組織中TBIL水平增加(P<0.05或P<0.01)，提示Dio預處理改善肝I/R后的肝功能受損。同時，促炎因子檢測結果(Fig 3)顯示，低、高劑量Dio預處理均能部分逆轉肝I/R導致肝組織和血清中IL-1β水平以及血清中IL-6水平升高，Dio預處理減輕肝I/R后的肝部炎癥。

Fig 2 Effect of Dio pretreatment on oxidative stressand liver function after liver I/RA:The level of MDA in the liver; B: The level of ROS in the liver; C: The level of GSH in the liver; D: The level of TBIL in the liver n=8); #P<0.01 vs Sham group; *P<0.05,**P<0.01 vs I/R group; △P<0.05 vs Low Dio group.

Fig 3 Effect of Dio pretreatment on inflammatory factors after liver I/RA: The expression and distribution of IL-1β in liver (scale bar=50 μm); B: The level of IL-1β in serum; C: The level of IL-6 in serum n=8); #P<0.01 vs Sham group; *P<0.05, **P<0.01 vs I/R group; △P<0.05 vs Low Dio group.

2.3 Dio預處理對NF-κB及p38通路的影響Western blot結果(Fig 4)顯示，與Sham組相比，I/R組肝組織中NF-κB p65和p38的磷酸化水平明顯增加(P<0.01)；與I/R組相比，低、高劑量Dio組肝肝組織中NF-κB p65和p38的磷酸化水平明顯降低(P<0.01)，且高劑量組變化更為明顯；說明Dio預處理能抑制肝I/R誘導的NF-κB和p38的活化。

Fig 4 Effect of Dio pretreatment on activation of NF-κB and p38 after liver I/RA: Western blot electrophoretogram of NF-κB p65, p-NF-κB p65, p38, and p-p38 protein expression in liver tissue; B: Relative expression level of p-NF-κB p65/NF-κB p65; C: Relative expression level of p-NF-κB p65/NF-κB p65 n=8); #P<0.05 vs Sham group; **P<0.01 vs I/R group; △P<0.05 vs Low Dio group.

3 討論

肝I/R損傷對肝臟手術或肝移植患者的預后有嚴重的不良影響[2]，而目前并沒有很好的預防或治療辦法。本研究以小鼠肝I/R模型探討了Dio預處理對I/R后肝損傷的影響，結果表明，Dio預處理可降低I/R后的肝損傷，提示，Dio是潛在的對抗I/R后肝損傷的防護劑。

氧化應激在肝I/R損傷的整個病理生理過程發揮重要作用。在肝I/R過程中，ROS的大量積聚是I/R后導致肝損傷的啟動和發展的重要因素[10]，同時如SOD和GSH等抗氧化酶耗竭并導致清除氧自由基的能力降低[10-11]，造成肝組織氧化損傷。脂質過氧化物終產物MDA可在一定程度上反映組織氧化損傷程度[10-11]。本研究顯示，Dio預處理能降低肝I/R小鼠肝組織中ROS和MDA水平，并能增加清除氧自由基的能力(GSH水平增加)，從而減輕氧化應激。氧化應激也可啟動肝I/R后的炎癥和細胞凋亡等現象。炎癥參與肝I/R損傷的整個病理生理過程，其中，炎癥因子的相互作用導致肝臟中炎性細胞的募集和浸潤，加劇了炎癥級聯反應[12]。已有研究表明，IL-1β和IL-6的上調可通過加重炎癥反應直接導致肝損傷[13-14]。本研究證實了Dio預處理能降低肝I/R小鼠的IL-1β和IL-6水平，并降低了肝損傷指標LDH、AST和TBIL以及改善肝臟組織學形態表現。此外，凋亡是I/R損傷過程中的一種常見現象，據報道，在肝I/R期間，約50%～70%的內皮細胞和40%～60%的肝細胞經歷了凋亡[15]。因此，有效阻斷細胞凋亡是減輕肝損傷和維持肝功能的重要途徑之一。本研究觀察到Dio預處理明顯降低了肝I/R小鼠肝組織中cleaved-caspase-3的表達，提示，Dio預處理能降低I/R后肝組織中細胞凋亡。

本研究進一步對Dio預處理發揮肝I/R后的肝保護的作用機制進行了探索。眾所周知，肝I/R損傷進程中，NF-κB活化后，啟動促炎細胞因子的產生和細胞凋亡，抑制NF-κB活化可減輕肝I/R損傷[16-17]。本研究也觀察到肝I/R可上調p-NF-κB p65的表達，相反，Dio預處理可明顯降低其表達；說明Dio預處理可減弱肝I/R后肝組織中NF-κB活化。此外，p38激活與白細胞募集和激活的啟動有關，其并能進一步導致細胞損傷[18]。本項研究的結果表明，Dio預處理能抑制肝I/R后肝組織中p38的磷酸化。

總之，本結果顯示Dio預處理可減輕肝I/R損傷，且這一作用可能與減弱NF-κB和p38活化以及氧化應激有關。并且，本實驗還提示了，Dio可能是一種潛在用于抗肝I/R損傷的肝防護劑。