表面活性劑強化LiCl溶液滅活空調霉菌的研究

李瑞青,楊自力,谷雨倩,游雨昕,凌 晨,張敏歆

表面活性劑強化LiCl溶液滅活空調霉菌的研究

李瑞青,楊自力*,谷雨倩,游雨昕,凌 晨,張敏歆

(東華大學環境科學與工程學院,上海 201620)

以空調系統中常見的黑曲霉(.)和桔青霉(.)孢子為對象,基于單因素全面實驗并結合SEM顯微觀察等方法,探究了添加表面活性劑(異辛醇,2-EH)對LiCl溶液滅霉的強化性能及潛在機理.結果表明:添加微量異辛醇(質量濃度為50×10-6～300 ×10-6)可大幅提高LiCl溶液的滅霉效率,且提升幅度隨添加量顯著增強,增幅達12.6倍;有效滅霉所必需的LiCl溶液觸發濃度由40%(高濃)大幅降低至20%(低濃);異辛醇的強化滅霉作用對中低濃度LiCl溶液尤為顯著,在濃度為20%的低濃度LiCl溶液中添加僅300 ×10-6g/g(即萬分之三)的異辛醇,所研究霉菌孢子的滅活率從7.8%提高至近100%.SEM微觀分析顯示:微量異辛醇與低濃度LiCl溶液的自身滅霉能力較弱,單獨作用于孢子時僅出現輕微皺縮,并無明顯結構破壞,但在低濃度LiCl加入微量異辛醇后,孢子出現顯著的結構破碎而滅活.研究結果可為提高溶液除濕空調滅霉能力提供新方法與依據.

霉菌；滅活；空氣品質；空調系統；表面活性劑

霉菌氣溶膠容易通過空調系統侵入室內[1-3],在室內適宜的環境下快速增殖,不僅引發兒童、老人罹患過敏性鼻炎、肺炎等呼吸道疾病[4-8],還會引起糧食等物資霉變[9-10].如何在空調通風系統中切斷霉菌氣溶膠侵入室內的路徑,對保障室內人員健康與物資安全至關重要.

傳統空調系統中常用表冷器冷卻空氣至露點溫度以下的除濕方式,會不可避免地會產生、積聚冷凝水,促進霉菌在系統內滋生,加劇對送風氣流的污染[11-13].相比之下,溶液除濕空調通過具有較低水蒸氣分壓力的吸濕溶液與空氣直接接觸,吸收空氣中的水分而實現除濕,避免了冷凝水的產生.同時,這種溶液與空氣直接接觸的方式能有效捕集氣流中的微生物顆粒而不產生氣態副產物.更重要的是,該系統常用的除濕劑(如LiCl、LiBr、CaCl2溶液等)是無毒無害的鹽水溶液,可與菌體細胞形成較大的滲透壓差而使菌體脫水失活,具有一定的滅菌能力[14].在常見的除濕鹽溶液中,LiCl溶液因其極佳的除濕性能、穩定無氣味、密度低容易輸送等優勢[15-16],在溶液除濕系統中得到廣泛應用.

研究者們對LiCl溶液滅活微生物氣溶膠的能力進行了廣泛探索.Robertson-Dwmers[17]采用接種培養法研究了LiCl溶液對金黃色葡萄球菌和黑曲霉活性的影響,發現LiCl溶液對上述菌體均具有滅活作用.而Park等[18]通過安德森采樣器收集LiCl溶液除濕系統入口和出口氣流中的微生物氣溶膠,發現系統對霉菌氣溶膠的凈化效率僅為44%,遠低于細菌氣溶膠(81%).Wang等[19]、谷雨倩等[14]的研究進一步指出:LiCl溶液對霉菌的滅活效率隨溶液濃度增加而增大,但只有濃度較高時(40%)才能有效滅活霉菌,濃度較低下(如30%)滅霉效果較差.

顯然,單純使用LiCl溶液滅活空調霉菌氣溶膠目前還存在滅霉效率低、有效滅霉所需溶液濃度過大,溶液在系統內有結晶風險等問題.滅霉效率普遍較低的原因是霉菌表面的疏水蛋白[20-21]使菌體具有極強的疏水性、難以與LiCl水溶液充分接觸.為此,本文提出向LiCl溶液中加入微量兼具疏水和親水基團的表面活性劑[22],通過其疏水基團與霉菌疏水蛋白形成表面吸附,降低霉菌的疏水性,從而促進溶液與霉菌的接觸以強化菌體滅活.相比于其他強化滅霉手段,該方法簡單高效,且不會影響空氣品質.

本文以除濕空調已成熟應用的表面活性劑異辛醇為例,以空調送風中常檢測出的致敏性黑曲霉、桔青霉等孢子為對象,通過設置單因素全面實驗并結合微生物培養、SEM顯微觀察等方法,研究添加表面活性劑前后LiCl溶液滅霉效率的變化,分析不同溶液濃度下表面活性劑對強化滅霉的影響規律,并探討表面活性劑添加前后菌體微觀結構變化及強化滅霉的潛在機理.研究結果可為進一步強化溶液除濕空調滅活霉菌氣溶膠提供新方法與依據,對降低室內人員的霉菌暴露風險具有重要價值.

圖1 霉菌的極強疏水性

1 材料與方法

1.1 表面活性劑選擇與添加量

選擇溶液除濕空調應用最廣泛[23]的表面活性劑異辛醇(即2-乙基己醇,2-EH),一種無色澄清的液體.聯合國發布的《全球化學品統一分類和標簽制度》(即GHS制度)[24]將2-EH的毒性定為第5級(最低級),弱于LiCl(第4級),與LiCl同屬于低毒類物質.雖然2-EH具有一定的揮發性,但在實際應用添加時極為微量,常為百萬分之一(×10-6)數量級[25-26], 2-EH在常溫下(20℃)的溶解度約為1000×10-6g/g,因此微量添加不會明顯影響所處理空氣的品質.為初步明確2-EH對強化除濕溶液滅霉性能的有效性及添加范圍,本文選取50×10-6、100×10-6、300×10-6等3種微量質量濃度.

1.2 菌種選擇與孢子懸液制備

本文選取在空調送風中常被檢出的致敏性曲霉菌、青霉菌[2]的代表菌種——黑曲霉(.)和桔青霉(.)孢子為研究對象,實驗用二代斜面菌株黑曲霉(CMCC(F)98003)和桔青霉(ATCC1109),均購自上海魯微科技有限公司,按如下步驟制備菌液:將所購斜面菌株分別轉接涂布于預制的PDA(購自青島高科園海博生物技術有限公司)固體培養基表面,隨后置于霉菌培養箱(SPX/MJX系列,上海力辰儀器)內28℃下恒溫培養3～5d,待培養基上長滿菌落后,將培養基置于超凈工作臺(SW-CJ-1D型,蘇州凈化設備公司)內,向其中緩緩加入20mL無菌蒸餾水,并用滅菌接種環在表面輕輕刮動將菌落表面孢子洗脫.為去除洗脫過程中夾帶的菌絲,將脫脂棉附于50mL離心管口過濾洗脫液,得到較純的孢子懸液,隨后在離心機(湘儀H1850)內離心7min(離心轉速:7000r/min);離心后棄去上清液,所得孢子中再加入無菌蒸餾水,重懸后再離心.重復兩次后將所得孢子與無菌蒸餾水混合稀釋配成孢子懸液,取樣并滴于計數板后在顯微鏡(CX23, Olympus,′400)下計數,調整稀釋比例直至孢子懸液濃度約為106CFU/mL,待用.

1.3 LiCl溶液制備

選取溶液除濕空調中的常用工質——LiCl溶液開展研究.LiCl除濕能力強,但當濃度大于40%時容易在常溫下結晶[16],因此實際應用中其濃度不宜超過40%.為探究微量2-EH對不同濃度LiCl溶液滅霉性能的影響(特別是低濃度下),本文制備了質量分數為10%、20%、30%、40%的LiCl水溶液,分別作為低濃組(10%、20%)、中低濃組(30%)和高濃組(40%).制備LiCl溶液時,采用電子天平(0.01g, FA1004型,邦西儀器科技有限公司)稱取粉末狀的分析純LiCl溶質(純度399.9%),緩慢加入盛有無菌蒸餾水的燒杯內,迅速攪拌直至完全溶解,冷卻至室溫后待用.

1.4 實驗工況及方法

為探究各2-EH添加量對不同濃度LiCl溶液滅活霉菌孢子的影響,采用單因素全面實驗法,兩種霉菌共有研究工況40組,每組工況獨立重復3次,共開展實驗120次,實驗工況水平如表1所示.由于實驗所選黑曲霉和桔青霉孢子易長成為菌落,且培養所需時間較短,采用應用最廣泛的平板菌落計數法確定各條件下的存活孢子數.

主要實驗過程如下:首先在室溫下分別取4.5mL已制備好的不同目標濃度的LiCl溶液(如表1)于試管中,以添加2-EH后的混合溶液為基準,提前換算各實驗工況所需目標2-EH添加量,用微量移液器(量程為0.1～2.5μL)準確吸取所需2-EH(分析純,純度399.0%,購自天津市科密歐化學試劑有限公司)并分別加至盛有不同濃度LiCl溶液的試管中,振蕩混合均勻.緊接著用滴管吸取0.5mL的孢子懸液,滴加至裝有2-EH和LiCl混合溶液的試管中,振蕩使其混合均勻.由于除濕溶液在實際系統內循環時也會與所捕集的霉菌保持接觸,本文實驗中霉菌孢子與溶液的暴露時長設為15min.暴露后即取1mL上述混合液,梯度稀釋至10-4后取100μL稀釋溶液接種于PDA固體培養基并涂布均勻,隨后迅速置于培養箱內在28℃下恒溫培養.為避免菌落在培養基上生長密度過大導致無法準確計數,培養2.5～3d(此時菌落全部長出,且單個菌落容易辨識)后開始拍照并記錄培養皿中菌落數.以上過程獨立重復3次.

表1 實驗工況水平

1.5 滅活效果分析指標

統計每組實驗得到的菌落數作為各實驗條件下存活菌體數,以原始菌液的活菌數為空白對照組,依據式(1)計算霉菌孢子滅活效率,以評判添加微量2-EH對LiCl滅活霉菌孢子的強化效果[27],所得結果均由3次獨立重復實驗(平均值±標準偏差)表示.

=(0-N)/0(1)

式中:為霉菌孢子滅活率,%;0為空白對照組菌落數,CFU/皿;N為實驗組菌落數,CFU/皿.

2 結果與討論

2.1 2-EH對LiCl溶液滅活霉菌的強化

2.1.1 對滅活黑曲霉(.)孢子的強化 圖2給出了添加微量(50′10-6～300′10-6g/g)2-EH后各濃度LiCl溶液對黑曲霉孢子活性的影響.由圖2(a～b)可見,與純LiCl溶液相比,添加2-EH后各實驗樣本中活性菌落數均明顯減少,且減少趨勢隨2-EH添加量的增加而增加.這說明從低到高濃度LiCl溶液下,2-EH均具有強化滅活黑曲霉孢子的作用,且強化效果隨2-EH添加量的增加而增大.相比于原始菌液(空白對照組,(81±2) CFU/皿),低濃度LiCl溶液(20%)作用后仍有(75±12) CFU/皿的黑曲霉孢子保有活性,未實現有效滅活;但向其中添加僅50′10-6g/g(十萬分之五)的微量2-EH時,其活菌數從(75±12)CFU/皿迅速降為(49±7)CFU/皿;當提高2- EH添加量至100′10-6g/g時,活菌數進一步大幅減少,僅為(4±3) CFU/皿.

雖然單獨將2-EH加入至黑曲霉純菌液中,活性菌落數也有所減少,但非常有限.這說明2-EH自身對黑曲霉的影響有限[28],遠低于2-EH與LiCl溶液的協同作用.如圖2(b)中單獨加入50′10-6g/g的2-EH,活性菌落數為(62±4) CFU/皿,但在30%的LiCl溶液中加入50′10-6g/g的2-EH,黑曲霉孢子全部被滅活(活性菌落數為0CFU/皿).這表明2-EH強化滅霉主要為與LiCl溶液的協同作用,而非2-EH自身的有限影響.

圖2(c)為不同2-EH添加量下各濃度LiCl滅活黑曲霉的效率變化規律.單純的中低濃度LiCl溶液(如質量分數<30%)對黑曲霉滅活率十分有限,不足20%,這與文獻[29]所得結果相似.而添加2-EH后滅活率均快速上升,當添加僅100′10-6g/g(萬分之一) 2-EH至20%的低濃LiCl溶液中,其滅活效率接近100%,與40%高濃LiCl溶液的滅活率相近.而當提升LiCl溶液濃度至30%時,提高其滅活率所需2-EH添加量則更為微小,僅需50′10-6g/g就可將黑曲霉全部滅活.由此可見,2-EH對中低濃度LiCl溶液滅活黑曲霉的強化效果十分明顯,微量添加后可接近完全滅活,本研究中2-EH的添加量為50′10-6g/g時,對10%低濃LiCl滅活黑曲霉的效率提升8倍,對30% LiCl的提升幅度為5.4倍;由于高濃(如40%)LiCl溶液自身對黑曲霉就有較強的滅活率,此時2-EH的強化效果未得到充分體現.添加微量2-EH對各濃度LiCl溶液滅活黑曲霉孢子的強化幅度可匯總如表2.

表2 2-EH添加量對各濃度LiCl溶液滅活黑曲霉效率的提升幅度(%)

注:表中括號內為純LiCl溶液對黑曲霉的滅活率,作為滅活率提升的比較基準.

2.1.2 對滅活桔青霉(.)孢子的強化 圖3(a～b)給出了添加微量2-EH前后各濃度LiCl溶液對桔青霉孢子的活性影響.與黑曲霉不同的是,由于桔青霉具有一定的耐鹽性[30],LiCl溶液處于低濃度(如10%與20%)時對桔青霉孢子無滅活作用.但添加微量2-EH至同一濃度的LiCl溶液后,其中的活性菌落數明顯減少且隨2-EH添加量的增大而趨于顯著.這說明2-EH與LiCl溶液協同作用下對桔青霉孢子具有較強的滅活作用,且隨2-EH添加量的增加而進一步增強.例如濃度為20%的LiCl溶液添加50′10-6g/g 2-EH后,其中活菌數從(195±13) CFU/皿降為(168±21) CFU/皿,而提高2-EH的添加量至100′10-6g/g時,活菌數大幅降至(4±2) CFU/皿,滅活強化效果尤為顯著.值得注意的是:若將2-EH單獨加入至桔青霉純菌液,其活菌數相比原菌液反而變多,這與Ida等[31]所觀察結果相似,這一方面可能是由于單獨加入表面活性劑促進了桔青霉孢子與培養基內營養物質的接觸與獲取,另一方面表面活性劑會增加桔青霉孢子內酶活性,從而促進了孢子生長.

圖3(c)所示為不同2-EH添加量下各濃度LiCl滅活桔青霉效率的變化規律.由圖可知,各濃度LiCl溶液對桔青霉孢子的滅活率隨2-EH的添加量增加而快速上升.在20% LiCl溶液中添加100′10-6g/g 2-EH后,滅活率迅速提升至97.2%;單純的30% LiCl溶液對桔青霉孢子的滅活作用極為有限,滅活率僅約31.2%(如表3所示),而當添加100′10-6g/g 2-EH后,孢子全部被滅活,滅活率提升2.2倍,與40%的高濃LiCl溶液的滅活效果相同.添加微量2-EH對LiCl溶液滅活桔青霉具有顯著的強化作用,該強化效果對中低濃度的LiCl溶液尤為顯著.

以上實驗結果表明:低濃度LiCl溶液對霉菌滅活效果微弱,只有高濃度的LiCl溶液(40%)才有效滅活霉菌,這與Robertson-Dwmers[17]及谷雨倩等[14]的研究結論一致.主要原因是霉菌的細胞壁/膜對菌體有較強的保護作用,對外界環境的抗逆性較強,可有效抵抗鹽溶液的高滲脅迫作用.Bang等[32]進一步在除濕段后加紫外線處理段以提高空調系統的滅霉能力,但發現經過3h的紫外處理后,霉菌滅活率也僅為5.7%.武艷[29]通過微波輻射處理霉菌,由于微波輻射波長較長,具有更好的穿透性,霉菌的滅活率可提高到70%,但此類方法需要在空調系統內額外增加處理段、增大了系統的成本與復雜性.與上述技術相比,通過添加2-EH可對LiCl滅活霉菌起到明顯的促進作用.僅添加100×10-6g/g(萬分之一)的2-EH時,LiCl溶液對霉菌的滅活率即接近100%.該方法在實用性及經濟性等方面都表現出了較大的潛力.

表3 2-EH添加量對各濃度LiCl溶液滅活桔青霉效率的提升幅度(%)

注:1.表中括號內為純LiCl溶液對桔青霉的滅活率,作為滅活率提升的比較基準; 2.因濃度為10%和20%的LiCl溶液單獨作用時無滅活,故不列出其滅活率提升幅度(-).

2.2 強化滅活的潛在機理

上述實驗結果表明,添加微量(50′10-6～300′10-6g/g)2-EH可有效強化LiCl溶液對黑曲霉和桔青霉等霉菌的滅活能力.為進一步探究其強化滅活的潛在機理,以黑曲霉孢子為例,將其短時(15min)暴露于以下3種對照溶液:300×10-6g/g 2-EH; 20% LiCl; 20% LiCl+300×10-6g/g 2-EH,通過掃描電鏡(SEM, SU8010,Hitachi)觀察各溶液作用前后菌體的形態結構變化,結果如圖4所示.

由圖4可見,未經各溶液條件作用的原始霉菌孢子,其表面光滑、結構完整、呈規則球形;當孢子經20%的LiCl溶液作用后,其表面皺縮、菌體周圍出現外泄物,這是由于在LiCl鹽溶液中,霉菌孢子在鹽溶液的高滲脅迫[33]以及Li+對自由水極強的親和力而使菌體細胞蛋白脫水變性[34-35]等共同作用下,導致菌體細胞膜出現損壞及胞內物質泄漏,如圖4(a)所示.但由于霉菌孢子極強的疏水性,LiCl溶液無法充分與孢子表面作用,只能使部分霉菌孢子受損,大多數孢子仍可保持完整形態,佐證了圖2中低濃LiCl溶液對黑曲霉的滅活作用有限;當在微量(300′10-6g/g)2-EH中暴露相同時間后,雖然部分孢子表面出現輕微的皺縮和凹陷,但大部分孢子形態仍保持完整,如圖4(b),微量2-EH對黑曲霉孢子的活性影響十分有限,這與圖2(b)中單獨將2-EH作用于黑曲霉時其活性變化結果相吻合;但當在低濃LiCl溶液中添加300′10-6g/g 2-EH后,如圖4(c)所示,霉菌孢子立刻出現大面積的損壞與結構性破碎,胞內物質幾乎全部外泄,大部分菌體孢子被滅活.由于LiCl溶液與2-EH未發生化學反應或產生新的物質,導致孢子大面積滅活的原因一方面可能是溶于LiCl溶液的表面活性劑(2-EH)其疏水基團與霉菌表面疏水蛋白吸附結合,增強了霉菌孢子與LiCl溶液的混溶,使二者充分接觸,從而強化了LiCl溶液的滅霉效果;另一方面,已有文獻表明醇類物質會使細胞膜的通透性增大[36],這使溶液中的Li+、Cl-得以進一步滲入菌體細胞內部,從而促進滅活.但因篇幅所限,相關機理仍需進一步探究.此外,本文明確了表面活性劑對LiCl除濕溶液滅活霉菌的顯著強化效果及相應添加濃度范圍,但高效滅菌所需的除濕溶液與2-EH的最優協同濃度與詳細配比方案等,需進一步深入探討確定.

圖4 黑曲霉孢子在各條件作用前后的微觀結構變化

(a) LiCl單獨作用; (b) 2-EH表面活性劑單獨作用; (c) LiCl與2-EH協同作用

3 結論

3.1 添加微量2-EH(50′10-6～300′10-6g/g)可大幅提高溶液除濕空調中LiCl溶液滅活霉菌氣溶膠的效率,且滅霉效率提升幅度隨2-EH添加量顯著增強.

3.2 2-EH的強化滅霉作用對中低濃度LiCl溶液尤為顯著.在20%的低濃LiCl溶液中僅添加300× 10-6g/g(即萬分之三)的2-EH,黑曲霉的滅活率從7.8%提高至100%.

3.3 添加微量(300′10-6g/g)2-EH后,溶液除濕空調有效滅霉所必需的LiCl溶液觸發濃度由40%大幅降至20%.

3.4 微量2-EH和低濃LiCl協同作用下,霉菌孢子結構被嚴重破壞,胞內物質大面積外泄.

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Study of minor 2-EH surfactant on promoting LiCl liquid desiccant to inactivate mold in air-conditioning systems.

LI Rui-qing, YANG Zi-li*, GU Yu-qian, YOU Yu-xin, LING Chen, ZHANG Min-xin

(College of Environmental Science and Engineering, Donghua University, Shanghai 201620, China)., 2022,42(7)：3443～3449

Effects of minor 2-EH (2-ethyl-1-hexanol) surfactant on improving the inactivation ability of LiCl liquid desiccant on two species of resistant mold spores in air conditioning systems,.and.were studied. The results showed that minor addition of 2-EH (50′10-6～300×10-6) substantially enhanced the mold inactivation performance of LiCl liquid desiccant with an efficiency improvement of 12.6 fold. By adding only 300×10-6of 2-EH, the.spores were effectively inactivated (with efficacy of around 100%) by the dilute LiCl aqueous solution (20% mass concentration) instead of the concentrated 40% LiCl solution. The improvement was particularly significant for the dilute LiCl solution, which considerably reduced the essential solution concentration for effective mold inactivation. SEM analysis showed that the addition of minor 2-EH accelerates the cell structure damage and collapse of the mold spores exposed in the LiCl solution. The results may significantly improve the mold inactivation performance of the LiCl liquid desiccant air-conditioning system and reduce the risks of mold aerosol transmission.

mold；inactivation；indoor air quality；air-conditioning system；surfactant

X172,TU834

A

1000-6923(2022)07-3443-07

李瑞青(1997-),女,山西忻州人,東華大學碩士研究生,主要從事室內空氣品質的研究.發表論文1篇.

2021-12-06

國家自然科學基金資助項目(52008078);上海市科技英才揚帆計劃項目(19YF1401800)

* 責任作者, 副教授, ziliy@dhu.edu.cn