歐洲鰻肌肉蛋白營養評價及體外模擬消化特性

孫夢瑩，石林凡，2，3，任中陽，2，3，陳 俊，2，3，郝更新，2，3，翁武銀，2，3*

（1 集美大學食品與生物工程學院 福建廈門 361021 2 鰻鱺現代產業技術教育部工程研究中心 福建廈門 361021 3 廈門市海洋功能食品重點實驗室 福建廈門 361021）

鰻鱺（Anguilla）是一種江河性洄游魚類，在全世界有19 種，其中日本鰻、歐洲鰻和美洲鰻屬于重要的養殖品種[1]。我國是鰻鱺養殖、生產和出口大國，2019年福建和廣東兩省的鰻鱺年產量高達20 萬t[2]。

高蛋白和高脂肪是鰻鱺肌肉的主要特征[3]，對鰻鱺加工產品的品質有重要影響。通常，富含油脂的鰻鱺主要被加工成烤鰻產品[4]?？决牸庸ぶ婿狑~肌肉蛋白和脂質不僅會發生分解和氧化反應，而且彼此間會發生相互作用，影響鰻鱺加工產品的營養品質。有研究報道，脂質在熱加工中容易發生氧化，在脂質次生氧化物的間接作用下蛋白質的結構和功能性質容易發生變化[5]。然而，關于加熱對鰻鱺肌肉蛋白消化特性的影響研究尚未見報道。

蛋白質的營養價值主要取決于必需氨基酸的種類、含量和組成，以及蛋白質消化和代謝的量，而吸收的氨基酸可以調節機體的新陳代謝[6-7]。Zhou 等[8]研究加熱處理對金華火腿肌原纖維蛋白體外模擬消化的影響時，發現100 ℃加熱的火腿中肌原纖維蛋白消化率高于70 ℃處理的火腿，而低于120 ℃處理的火腿。適度加熱促進蛋白多肽鏈的展開，而過度加熱導致蛋白質發生交聯和聚集，對蛋白質的消化率和生物活性產生影響[9]。還有研究表明，過度加熱導致食源性碳量子點的形成，抑制胃蛋白酶和胰蛋白酶的活性，進而影響蛋白質的消化[10]。

目前鰻鱺加工產品主要是烤鰻，產品單一且以出口為主。鰻鱺產業抵御市場的風險能力非常薄弱。有關鰻鱺加工的研究主要集中在鰻鱺產品的質量安全和監控等方面。鰻鱺肌肉蛋白的營養評價鮮有報道。本研究以歐洲鰻為原料，評價鰻鱺肌肉蛋白的營養品質，以及加熱對鰻鱺蛋白消化特性的影響，旨在為研發高品質的鰻鱺熱加工產品提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

歐洲鰻購于當地水產品批發市場。乙腈及甲醇，美國INC 公司；鄰苯二甲醛、氯甲酸-9-芴甲基酯，美國Agilent 公司；鹽酸、胰酶、胃蛋白酶，中國上海國藥集團化學試劑有限公司；十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulphate，SDS）、丙烯酰胺，美國Bio-Rad 公司。

1.2 儀器與設備

1200 高效液相色譜儀，美國Agilent 公司；AI600 多色熒光凝膠成像儀，美國GE Healthcare公司；Avanti J-25 高速冷凍離心機，美國Beckman公司；SK-SO35 多功能蒸汽焗爐，日本山崎（國際）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鰻鱺肌肉蛋白的提取 鰻鱺水溶性蛋白（water-soluble protein，WP）的提取參考Zheng 等[11]的方法。取鰻鱺白肉切成小塊，按質量體積比為1 ∶15 加入蒸餾水后進行勻漿，利用高速冷凍離心機離心，獲得的上清液在碎冰上靜置并去除凍結的油脂，經冷凍干燥后制備成WP。鰻鱺鹽溶性蛋白（salt-soluble protein，SP）的提取參考了Bertram等[12]的方法。將上述離心后的沉淀加入與20 mmol/L PBS（pH 7.0）混合配制為50 g/L 的溶液并進行勻漿，再次離心，獲得的沉淀和0.6 mol/L KCl溶液混合配制為100 g/L 的溶液并勻漿，離心后收集上清液，用蒸餾水透析除鹽，冷凍干燥后制備成SP。

1.3.2 鰻鱺油脂的提取 鰻鱺油脂的提取參考Lin 等[13]的方法并稍作修改。取鰻鱺白肉切成小塊，按質量體積比為1 ∶10 加入蒸餾水并進行勻漿，沸水浴15 min 后進行離心，在上清液中加入質量濃度為20 g/L 的白色硅藻土，4 ℃保存120 min 后，再次離心，獲得的上清液冷凍干燥后作為本研究的鰻鱺油脂使用。

1.3.3 基本成分測定 水分測定參照GB 5009.3-2016 直接干燥法；粗蛋白質測定參照GB 5009.5-2016 凱氏定氮法；粗脂肪測定參照GB 5009.6-2016 索氏抽提法；灰分測定參照GB 5009.4-2016馬福爐灼燒法。

1.3.4 氨基酸組成分析及其營養評價

1.3.4.1 氨基酸組成的測定 參照Shi 等[14]報道

的氨基酸測定方法。樣品用6 mol/L HCl 溶解，在充滿氮氣的消化管中于110 ℃消化22 h，通過旋轉蒸發去酸后再用0.02 mol/L HCl 溶解，經0.22 μm 水系膜過濾后，利用高效液相色譜儀測定樣品的氨基酸組成。色譜柱為Agilent Zorbox Eclipse AAA 柱（4.6 mm×150 mm）；流動相A 為40 mmol/L的磷酸二氫鈉（pH 7.8），流動相B 為有機相（乙腈∶甲醇∶超純水=45∶55∶10，V/V）；流速為2 mL/min，梯度洗脫；紫外檢測波長為338.10 nm 和262.16 nm。其中，色氨酸采用堿水解后再利用高效液相色譜儀測定。

1.3.4.2 氨基酸營養價值評價 根據聯合國糧農組織/世界衛生組織（food and agriculture organization of the united nations/world health organization，FAO/WHO） 推薦的氨基酸評分標準模式和雞蛋蛋白質的氨基酸模式，分別按以下公式計算氨基酸評分（essential amino acid scores，EAAS）、必需氨基酸指數（essential amino acid index，EAAI）、生物價（biological value，BV）和蛋白質效率比（protein efficiency ratio，PER）[15]。

式中：n——比較的EAA 個數；a，b，c，...，h——待評蛋白質的EAA 含量（g/100g）；ae，be，ce，...，he——雞蛋蛋白質相應的EAA 含量（g/100g）。

1.3.5 模擬烤鰻加熱處理 將WP 和SP 分別與油脂按照鰻鱺肌肉基本成分組成的比例（脂肪20%、蛋白15%和水分65%）混合后，模擬烤鰻的加熱條件（80 ℃烘烤10 min，然后95 ℃蒸煮5 min，最后90 ℃烘烤3 min），對鰻鱺肌肉、WP 和SP 進行加熱，制備的樣品冷卻至室溫后供以下試驗使用。

1.3.6 體外模擬消化 參照Cinq-Mars 等[16]的方法進行體外模擬胃腸液消化試驗。將樣品分散于pH 1.5 的鹽酸水溶液中，配制的樣品溶液按質量比3∶100（酶/蛋白）加入胃蛋白酶，混勻后在37 ℃恒溫振蕩水槽中酶解60 min。獲得的模擬胃消化液利用1 mol/L NaOH 將消化液的pH 值調至7.5，按質量比4 ∶100（酶/蛋白）加入胰酶，混勻后在37 ℃恒溫振蕩水槽中酶解60 min。在消化過程中對消化液進行電泳分析，并對消化產物的游離氨基酸進行分析。

1.3.6.1 Tricine-SDS-PAGE 利用含有2% SDS、8 mol/L 尿素和20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）的蛋白變性劑溶解消化產物，根據Sch?gger[17]報道的方法進行Tricine-SDS-PAGE 分析。

1.3.6.2 游離氨基酸的測定 游離氨基酸的測定參照Liu 等[18]報道的方法并稍作修改。樣品溶液加入相同體積100 g/L 磺基水楊酸，混勻后室溫靜置120 min，離心后獲得的上清液于55 ℃下濃縮蒸干，再用0.02 mol/L HCl 溶解，按照1.3.4.1 節的方法對氨基酸組成進行測定。

1.4 數據統計與分析

采用SPSS 17.0 軟件對所得數據進行ANOVA 方差分析，顯著性檢驗方法為Duncan 多重檢驗，顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 鰻鱺肌肉組分分析

表1顯示了鰻鱺肌肉的基本成分。除了水分以外，鰻鱺肌肉中脂肪含量最高，表明鰻鱺屬于多脂魚類，這與羅鳴鐘等[3]的研究結果類似。通常魚類肌肉的水分含量為73%～82%[19]。然而，在鰻鱺肌肉中水分含量卻只有67.06%，這可能是鰻鱺肌肉脂肪含量高達19.72%的緣故。也有研究表明，大西洋鮭魚肌肉脂肪含量越高的部位水分含量越低[20]。

表1 鰻鱺肌肉基本成分（%，濕重；n=3）Table 1 Compositions of eel muscle（%，wet weight；n=3）

2.2 氨基酸組成分析

蛋白質的氨基酸組成是決定蛋白質營養價值的重要依據，因此對鰻鱺肌肉及其WP 和SP 的氨基酸進行測定，結果如表2所示。在鰻鱺肌肉WP的EAA 中，賴氨酸占比最高，其次是亮氨酸。類似的趨勢也在鰻鱺SP 的EAA 中觀察到。除了纈氨酸和苯丙氨酸，SP 中的其它6 種EAA 占比都高于WP。有研究報道，賴氨酸可以促進機體生長發育和礦物質的吸收，進而增強免疫力[21]，亮氨酸可以調節肌肉中蛋白質的合成[22]。Mohanty 等[23]對27種食用魚類肌肉氨基酸進行分析，結果發現冷水魚魚肉的賴氨酸高達16.1%，海水魚魚肉的亮氨酸高達10.4%，而黃鰭結魚的賴氨酸和亮氨酸分別為7.6%和9.4%，與鰻鱺肌肉最接近，這可能是黃鰭結魚和鰻鱺都屬于淡水魚的緣故。鰻鱺肌肉EAA 介于WP 和SP 之間。鰻鱺肌肉中EAA 占總氨基酸比例達到37.81%，高于FAO/WHO（2013）的成人氨基酸標準模式（27.60%），說明鰻鱺肌肉是滿足成人食用的優質蛋白。鰻鱺肌肉的必需氨基酸指數（EAAI）為84.27，高于其它魚類如草魚（72.43）[24]，表明鰻鱺肌肉的必需氨基酸組成較為合理，營養價值較高。根據EAAI 值的結果，還可以發現鰻鱺SP 的營養價值高于WP。蛋白質對人體的BV 與EAA 的含量密切相關，因此p-BV 值大小趨勢與EAAI 相同。通常，PER 大于2.0 被認為是高質量的蛋白質，1.5～2.0 為中等質量的蛋白質，而小于1.5 則認為低質量的蛋白質[25]。鰻鱺肌肉的p-PER 為1.93，與羅非魚（1.93）相近[26]，低于鯖魚與鯡魚[27]。這是由于歐洲鰻養殖在淡水中，因此其肌肉營養價值與淡水魚相近，但是，SP 的p-PER 高達3.90，可以與海水魚類蛋白相媲美。

表2 鰻鱺肌肉及其分離蛋白的氨基酸組成、必需氨基酸指數（EAAI）、蛋白質效率比（p-PER）和生物價（p-BV）（g/100 g，蛋白干重；n=3）Table 2 Amino acid profiles，essential amino acid index（EAAI），predicted protein efficiency ratio（p-PER），and predicted biological value（p-BV） of eel muscle and its isolated protein（g/100 g，dry weight basis；n=3）

參考FAO/WHO（2013）的標準氨基酸模型，對鰻鱺肌肉及其提取蛋白質的營養價值進行評價，結果如表3所示。WP 的第一限制氨基酸為甲硫氨酸+半胱氨酸，鰻鱺肌肉和SP 中的第一限制氨基酸為纈氨酸。除苯丙氨酸+酪氨酸外，SP 中必需氨基酸評分（EAAS）均高于WP，鰻鱺肌肉EAAS 介于WP 和SP 之間。鰻鱺肌肉的EAAS 評分最高的為色氨酸，據報道，色氨酸可以增強人體的免疫能力，其代謝產物褪黑素更是具有抗氧化和抗衰老等多種生理功能[28]。值得注意的是，除色氨酸外，苯丙氨酸+酪氨酸的評分也很高，結果表明鰻鱺肌肉必需氨基酸均衡性好。

表3 鰻鱺肌肉及其分離蛋白的必需氨基酸評分（EAAS，%）Table 3 Essential amino acid scores（EAAS，%）of eel muscle and its isolated protein

2.3 體外模擬消化

2.3.1 Tricine-SDS-PAGE 利用Tricine-SDSPAGE 對鰻鱺蛋白的體外模擬消化過程進行評價（圖1）。鰻鱺WP 分子質量為12～97 ku 范圍內可觀察到多條清晰的蛋白條帶。當WP 經胃蛋白酶消化15 min 后，只有97，55，45 和12 ku 及以下出現較淡的蛋白條帶。伴隨消化時間的延長，SDS-PAGE 中的蛋白條帶數量逐漸減少（圖1a）。當模擬胃消化產物經胰酶消化15 min 后，僅在55 ku 處出現較淡的蛋白條帶。當鰻鱺SP 經胃蛋白酶消化15 min 后，大于100 ku 的蛋白條帶立即消失（圖1b）。隨著胃蛋白酶消化時間的延長，除了80 ku 附近的蛋白條帶以外其它蛋白條帶逐漸變淡。當模擬胃消化產物經胰酶消化后，30 ku 以上的蛋白條帶迅速消失，30 ku 以下的涂布狀條帶隨著消化時間的延長逐漸變淡。這些結果表明，WP比SP 更容易被胃蛋白酶消化降解。Minkiewicz 等[29]在比較鯉魚肌肉的肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的體外模擬消化時，也發現肌漿蛋白比肌原纖維蛋白容易消化。鰻鱺肌肉除了WP 和SP 以外，還富含膠原蛋白，因此伴隨胃蛋白酶的消化，膠原蛋白逐漸明膠化并溶解出來，在SDS-PAGE 中會呈現出一些與WP 和SP 消化不一樣的蛋白條帶（圖1c）。然而，這些蛋白條帶在胰酶消化中也都逐漸消失。

鰻鱺WP 和SP 與油脂混合后經過加熱后，體外模擬消化的結果如圖1c，1d，1f 所示。加熱后的WP 在SDS-PGAE 中只出現小于10 ku 的蛋白條帶，但隨胃蛋白酶的消化蛋白條帶數量先增加后減少（圖1d）。這可能是在與油脂加熱過程中WP出現聚集和交聯，但在胃蛋白酶消化中逐漸溶解出來。然而，與油脂共同加熱的WP 明顯比未加熱的WP 不易被胃蛋白酶消化（圖1a 和1d）。雖然SP 與油脂加熱后沒有出現WP 那樣產生大分子，但是與油脂共同加熱的SP 在胃蛋白酶消化中比未加熱的SP 多了一些蛋白條帶（圖1e）。模擬胃消化產物經胰酶消化后，WP 只有在55 ku 附近存在一些蛋白條帶，而SP 卻出現更多的蛋白條帶。這些結果表明了與油脂共同加熱后，SP 還是比WP 不容易消化。相對于未加熱的鰻鱺肌肉，經過加熱的鰻鱺肌肉也出現了WP、SP 與油脂共加熱類似的現象（圖1f）。

圖1 鰻鱺肌肉及其蛋白體外模擬消化產物的Tricine-SDS-PAGE 圖譜Fig.1 Tricine-SDS-PAGE patterns of in vitro digested products of eel muscle and its isolated protein

2.3.2 游離氨基酸 對鰻鱺肌肉及其蛋白體外模擬消化產物中的游離氨基酸組成進行分析，結果如表4所示。未加熱的WP 和SP 經體外模擬消化后，其消化產物中都有高含量的亮氨酸和苯丙氨酸等游離氨基酸。WP 消化產物中還富含精氨酸和賴氨酸，而SP 消化產物中富含丙氨酸和酪氨酸。亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸為必需氨基酸，精氨酸和酪氨酸則屬于半必需氨基酸，而且丙氨酸常用作營養補充劑，它們在機體免疫能力的增強、肌肉蛋白的合成與分解中起到重要的作用[22，30-32]。同樣，在鰻鱺肌肉模擬消化產物中主要游離氨基酸也是精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和賴氨酸，占游離氨基酸總量的66.60%，表明這些游離氨基酸可能可以作為評價鰻鱺肌肉消化產物的營養指標。

不管鰻鱺肌肉WP，還是鰻鱺肌肉SP，它們與油脂共同加熱再經過體外模擬消化后，模擬消化產物中的游離氨基酸總量均出現一定程度的增加，表明加熱后可以促進蛋白消化。Semedo 等[33]研究蒸煮、烘烤和油炸對魚肉體外模擬消化影響時，也發現不管采用哪種加熱方式加熱后的魚肉都更容易被消化。而且，加熱會使鰻鱺肌肉蛋白消化產物中的酪氨酸含量出現一定程度的下降（表4），這可能是魚肉在熱加工中形成的食源性碳量子點抑制了酪蛋白的消化[10]。值得注意的是，經過加熱后模擬消化產物中的主要游離氨基酸的比例都出現了下降的趨勢，也表明鰻鱺肌肉蛋白與油脂共同加熱后會導致營養價值出現一定程度的下降。

表4 鰻鱺肌肉及其蛋白體外模擬消化產物的游離氨基酸組成（g/100 g，干重；n=3）Table 4 Free amino acid in vitro digested products of eel muscle and its isolated protein（g/100 g dry weight；n=3）

3 結論

通過對鰻鱺肌肉WP 和SP 的氨基酸組成分析，利用體外模擬消化分析蛋白與油脂加熱前后的消化特征。結果表明，鰻鱺WP 中精氨酸含量明顯高于SP，而SP 中必需氨基酸和呈味氨基酸高于WP，且SP 的氨基酸營養價值高于WP。不管是加熱還是未加熱，鰻鱺肌肉WP 均比SP 容易被消化。經過加熱后，蛋白模擬消化產物中游離氨基酸占比明顯增加，表明加熱可以促進鰻鱺肌肉蛋白質的消化降解。然而，根據模擬消化產物的游離氨基酸的分析結果，表明加熱會導致鰻鱺肌肉蛋白質的營養價值下降。