N端截短CBM41對枯草芽孢桿菌來源普魯蘭酶酶學性質的影響

付巧 林啟蘭 薛強 熊海容 王亞偉，2

（1. 中南民族大學生命科學學院，武漢 430074；2. 武漢輕工大學生命科學與技術學院，武漢 430048）

普魯蘭酶（pullulanase，EC 3.2.1.41）是一種重要的生物催化劑和脫支酶，能高效裂解普魯蘭多糖、支鏈淀粉和其它支鏈多糖的α-1，6-糖苷鍵［1］。在糖化過程中，普魯蘭酶與糖化酶或β-淀粉酶復配使用來生產麥芽糖糖漿［2-3］，除了提高產糖率，還縮短了反應時間。在工業淀粉發酵生產酒精、氨基酸、核苷酸以及抗生素的過程中，應用普魯蘭酶可提高淀粉水解的效率［4-5］。

為了滿足工業生產的需求，研究人員對普魯蘭酶的3D結構進行解析，進而改變酶的結構以期獲得酶學性質的改良。在Protein Data Bank（PDB）數據庫中可以檢索到多個已解析的不同來源普魯蘭酶晶體結構。根據Thermotoga petrophila普魯蘭酶［6］、Bacillus subtilis普魯蘭酶［7］、Bacillus naganoensis普魯蘭酶［8］和Bacillus acidopullulyticus普魯蘭酶［9］的3D晶體結構對比發現，普魯蘭酶的保守功能區域具有較高的相似性，在N端結構中普遍存在著一種僅能與底物糖鏈分子結合卻不具有催化功能的結構域，即碳水化合物結合模塊（carbohydrate binding modules，CBMs），其中CBM41是普魯蘭酶分子中存在最廣泛的CBM結構域家族［10-11］。近年來隨著對普魯蘭酶研究的深入，科學家們取得了一些成果，發現N端結構對其酶學性質、酶的表達和動力學參數等顯示出不同程度的影響。例如Duan等［12］構建了Bacillus deramificans普魯蘭酶的N端截短突變體，截斷CBM41和X25后，酶的比活力提高到野生型的1.1倍，底物親和力下降。Jiao等［13］通過刪除Bacillus megaterium普魯蘭酶CBM41a-CBM41b-X結構域，將突變體的比活力提高8.7倍，且具有更好的熱穩定性。Chen等［14］截短B. acidopullulyticus普魯蘭酶N端的結構域CBM41-X25-X45，得到的突變體酶活力提高了2.9倍，熱穩定性和pH穩定性也有所提高。對普魯蘭酶CBM41的改造雖然獲得了一些性質得到改良的突變體，但對CBM41的關鍵作用位點及其催化功能的影響機制還有待進一步研究。

課題組前期以枯草芽孢桿菌168（Bacillus subtilis 168）的全基因組為模板，擴增出普魯蘭酶PulB基因序列，與已報道的普魯蘭酶（PDB：2E8Y）序列相似性高達99.72%，其中除第365位的氨基酸由K變為M，第553位的氨基酸由V變為A外，其余序列均一致。根據2E8Y模擬普魯蘭酶3D結構，發現在CBM41結構域的N端出現1-6個氨基酸形成的無規則片段，此區域柔性較大，易受溫度和pH的影響，通過刪去CBM41結構域N端前2、4、6個氨基酸，構建不同形式的N端截短突變體，以期獲得性質更加優良的菌株，對比截短突變體與野生型普魯蘭酶（WT）酶學特性上的差異，為簡化Bacillus subtilis 168普魯蘭酶編碼基因，解析CBM41結構域與功能的關系等方面的研究工作提供方法和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質粒 枯草芽孢桿菌168菌株由本實驗室保藏。表達載體pET-22b（+）和大腸桿菌Escherichia coli BL21（DE3）均獲贈于中國農業科學院飼料研究所。

1.1.2 工具酶及試劑 限制性內切酶Nco I（1160A）、Xho I（1094A）、連 接 酶T4 DNA Ligase（2011A）、DNA分子量標記和蛋白質分子量標記均購于寶日醫生物技術（北京）有限公司，SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒（P0012AC）購自上海碧云天生物技術有限公司，質粒小量試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，底物支鏈淀粉（KV370014）購自上海源葉生物科技有限公司，牛肉膏（LP0029B）、酵母浸粉（LP0021）和蛋白胨（LP0042）購于賽默飛世爾科技（Thermo Fisher Scientific）公司，其余試劑均是國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 序列分析和結構模擬 使用SignalP5.0 （http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析預測已收錄于NCBI數據庫中Bacillus subtilis 168來源的普魯蘭酶（GenBank Accession No. NP_390871.2）蛋白質序列的信號肽，推斷該酶的胞內/外釋放特征。使用PyMOL軟件（http://pymol.org/）模擬研究中所獲得重組普魯蘭酶PulB的立體結構。

1.2.2 普魯蘭酶截短突變體的設計和構建 以枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 168基因組中普魯蘭酶基因（GenBank：QJR47579.1）為參考，采用引物如表1，通過PCR技術擴增目的基因PulB、PulBΔN2、PulBΔN4和PulBΔN6，使用限制性內切酶Nco I和Xho I對目的基因與載體pET-22b（+）進行雙酶切，酶切產物通過T4 DNA Ligase連接后轉化至大腸桿菌BL21中［15］，挑取陽性單克隆送交武漢擎科生物技術有限公司測序驗證，將測序正確的重組菌株培養保藏，分別標記為BL21-pET-22b（+）-PulB、BL21-pET-22b（+）-PulBΔN2、BL21-pET-22b（+）-PulBΔN4和BL21-pET-22b（+）-PulBΔN6。

表1 野生型及其截短突變體擴增用引物Table 1 Primers for amplification of wild-type and truncated mutants

1.2.3 截短突變體的誘導表達和純化 將轉化成功的陽性重組菌株接種到LB培養基中，37℃、220 r/min條件下振蕩培養，當菌液的OD600達到0.6-0.8時，加入終濃度為0.1 mg/mL的IPTG，30℃、220 r/min誘導16-20 h。將發酵液在4℃、5 000 r/min下離心5 min，離心得到的上清液作為胞外組分，收集離心后菌體并在高壓細胞破碎儀下破碎，4℃，8 000 r/min下離心10 min，得到的上清液作為胞內可溶組分。重組蛋白帶有組氨酸標簽，使用鎳柱親和層析法純化蛋白并進行SDS-PAGE電泳分析，檢測目的蛋白的表達情況［16］。

1.2.4 截短突變體的酶活性分析 采用3，5-二硝基水楊酸方法（簡稱DNS方法）［17］對普魯蘭酶酶活力進行鑒定，以0.5%支鏈淀粉為底物。在相應的溫度、pH下，取0.9 mL的底物放入到試管中，預熱5 min后，加入0.1 mL酶液與其反應30 min，迅速加入1.5 mL的DNS試劑終止酶解反應，并于沸水浴中煮沸5 min進行顯色反應，將上述反應液置于冰水中冷卻后測定OD540吸光度。一個酶活力單位定義為在pH 6.0和40℃條件下，每分鐘催化產生1 μmol葡萄糖所需的酶量。其計算公式如下：普魯蘭酶酶活（U/mL）=W×N×1 000/（180.16×30×0.1）。其中W（mg）為酶解產生的葡萄糖量，N為稀釋倍數，1 000為單位mmol轉換為μmol的系數，180.16 （g/mol）為葡萄糖分子量，30（min）為反應時間， 0.1（mL）為適當稀釋后酶液體積。

1.2.5 截短突變體的酶學性質分析

1.2.5.1 最適pH及pH穩定性測定 配制不同pH的緩沖液：50 mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉（pH 4.0-8.0）和50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0-9.0）。在最適溫度下，分別測定不同pH下的酶活力，酶活力最高點為最適反應pH，以最大酶活力值為100%計算其他pH下的相對酶活力。在室溫條件下，將粗酶液分別置于pH 4.0-9.0緩沖液中處理1 h后，以未處理的樣品作為對照，于最適溫度下測定其剩余酶活力。

1.2.5.2 最適反應溫度及熱穩定性測定 在pH 6.0反應條件下，分別測定不同溫度梯度（30-60℃）下的酶活力，酶活力最高點為最適反應溫度，以普魯蘭酶的最大酶活值為100%，計算不同溫度下的相對酶活力。將粗酶液分別置于30-60℃條件下處理1 h，處理后的酶液加入到底物中，于最適溫度下反應30 min，以未處理的樣品作為對照，分別測定其剩余酶活力。

1.2.5.3 表觀解鏈溫度值測量 Tm值的測定采用差示掃描熒光定量法（differential scanning fluorometry，DSF）［18］，將20 μL純 化 后 的 蛋 白 質 與5 μL的100×SYPRO Orange染料混合離心，實時熒光定量PCR系統中以1℃/min的速度從20℃到80℃加熱樣品來測定Tm值。

2 結果

2.1 截短突變體的構建

如圖1，依據普魯蘭酶PulB的立體結構設計3種突變體，分別是依次刪除CBM41結構域N端的甲硫氨酸和纈氨酸的突變體PulBΔN2（M1），刪去甲硫氨酸、纈氨酸、絲氨酸、異亮氨酸的突變體PulBΔN4（M2）以及刪去甲硫氨酸、纈氨酸、絲氨酸、異亮氨酸和兩個精氨酸的突變體PulBΔN6（M3）。

圖1 枯草芽孢桿菌168來源普魯蘭酶結構示意圖Fig.1 Structure of pullulanase from B. subtilis 168

對構建的截短突變體菌株進行菌落PCR鑒定，如圖2所示，在2 000 bp條帶附近有一條約為2.1 kb的特異性條帶，與目的條帶大小相當，同時將獲得的重組突變體質粒送武漢擎科生物技術有限公司測序驗證，測序結果表明突變位點和設計位點完全一致，N端截短突變體構建成功。

圖2 截短突變體菌落PCR鑒定圖Fig.2 PCR identification of truncated mutants colonies

2.2 截短突變體的表達、純化及動力學參數測定

將帶有截短突變體基因的重組表達載體轉入大腸桿菌BL21中，加入IPTG誘導表達，發酵上清液中檢測不到酶活。SignalP5.0預測普魯蘭酶信號肽結果顯示該酶不含有信號肽，且普魯蘭酶的分子量約為80 kD，分子量太大也可能使其難以在胞外表達。超聲破碎菌體并進行鎳柱純化，使用SDS-PAGE凝膠電泳檢測表達情況，結果如圖3所示，野生型及截短突變體的胞內可溶組分中均出現1條分子量約80 kD的條帶，此條帶大小與目標蛋白的大小相當，說明普魯蘭酶PulB及其截短突變體在大腸桿菌中的表達為可溶性的蛋白形式。

圖3 野生型普魯蘭酶及其截短突變體純化后SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE analysis of the purified wild-type pullulanase and the truncated mutants

通過測定純化后重組蛋白酶活及蛋白濃度，計算得到比酶活，WT、M1、M2和M3比酶活分別為2.30、2.72、3.69和5.62 U/mg。以支鏈淀粉為底物分別對重組蛋白Km和Vmax值進行測定，WT、M1、M2和M3的Km值分別為23.89、29.01、17.29和19.08 mg/mL；Vmax值分別為4.06、2.35、3.92和 7.24 U/mg。

2.3 最適pH及酸堿穩定性

3個截短突變體最適pH均為6.0（圖4-A），與野生型一致。野生型和不同突變體的酸堿穩定性有一定差異（圖4-B），相比于WT，M1提高了pH穩定性，在磷酸緩沖液pH 5.0-8.0處理1 h后，M1剩余酶活力皆可達到50%以上，而WT剩余酶活力只剩不足43%；M2和M3在磷酸緩沖液pH 4.0-8.0處理1 h后，剩余酶活力普遍低于WT。

圖4 野生型及其截短突變體的最適pH及pH穩定性Fig.4 Optimal pH and pH stability of wild-type pullulanase and the truncated mutants

2.4 最適溫度及溫度穩定性

如圖5所示，截短突變體對最適溫度影響較小，野生型和截短突變體最適溫度曲線變化趨勢大致相同，最適溫度都在40-45℃。熱穩定性結果顯示野生型及突變體普魯蘭酶在30-50℃下穩定性很好，但是當處理溫度大于50℃剩余酶活力迅速下降，如在55℃下處理1 h后WT、M1、M2和M3剩余酶活力分別為45.29%、63.19%、51.75%和47.33%，各突變體比野生型殘余酶活有所提高，尤其是M1比WT殘余酶活提高了17.90%。

圖5 野生型及其截短突變體的最適溫度及熱穩定性Fig.5 Optimal temperature and thermostability of wildtype pullulanase and the truncated mutants

2.5 表觀解鏈溫度值測量

使用DSF法測定野生型和突變體普魯蘭酶表觀解鏈溫度Tm值，圖中的峰值所對應的溫度即為蛋白質的Tm值，提高熱穩定性的突變，其峰形右移；而降低熱穩定性的突變，其峰形左移。如圖6所示，與野生型WT進行比較，突變體M2峰形幾乎沒有變化，突變體M1和M3峰形右移。WT、M1、M2和M3的Tm值分別為48.57℃、50.03℃、48.43℃和49.50℃。

圖6 野生型及其截短突變體Tm值測定Fig.6 Tm determination of wild-type pullulanase and the truncated mutants

歸納上述結果如表2，相比于WT，突變體的比活力均有不同程度的提高，M1、M2和M3的比活力分別為WT的1.18、1.60和2.44倍；M2和M3的Km值分別降低0.72和0.80 mg/mL，M3的Vmax增加3.18 U/mg；M1和M3的Tm值比WT增加了1.57℃和0.93℃。

表2 普魯蘭酶及其截短突變體比酶活、動力學參數及Tm值比較Table 2 Comparison of specific activity，kinetic parameters and Tm of pullulanase and the truncated mutants

3 討論

CBM41是CBM家族中存在最廣泛的家族之一，它主要與降解糖原的催化結構域連接，CBM41形成一個β-三明治結構，其C-末端包埋在β-片層的內部，而N-末端位于β-片層的側面，直接暴露在親水環境中，因此N-末端結構對于酶的整體穩定性起重要作用［19］。

本研究通過刪去CBM41結構域N端氨基酸，獲得突變體M1、M2和M3。實驗結果表明，N端氨基酸截短在一定程度上增強酶的熱穩定性以及底物親和力，與野生型相比M1和M3的Tm值分別提高1.57℃和0.93℃，M1和M2的Km降低。這一觀點與前人的研究結果一致，王馨葉［20］截短Bacillus naganoensis普魯蘭酶N端不同長度氨基酸，獲得截短突變體ΔN5和ΔN106的半衰期增長，Km值減小。Nisha等［21］通過截短Geobacillus thermoleovorans普魯蘭酶的N端氨基酸，構建了N端1-257位氨基酸缺失的突變體，其酶活和熱穩定性都有明顯提高。分析Bacillus subtilis168來源普魯蘭酶蛋白結構發現，CBM41結構域的N端氨基酸沒有形成規則二級結構同時在三級結構中處于N端游離的末端。二級結構中無規則片段柔性較大，易受溫度、pH的影響，更容易失活，葉延欣等［22］發現影響熱穩定性的主要因素是α-螺旋含量和無規則片段含量，降低二級結構中無規則片段的含量使螺旋的含量增加可以提高酶的熱穩定性。CBM41結構域與酶-底物結合相互作用密切相關，去除N端氨基酸所形成的無規則片段使其結構更加緊湊，同時也使酶與底物結合的空間位阻變?。?3］，因此增強底物的親和力。

與M1相比M3的Km值增加，Tm降低0.53℃。M3多刪除的4個氨基酸中有兩個為精氨酸，精氨酸側鏈為長鏈，可更好的維持蛋白結構，刪除精氨酸可能使蛋白分子更容易變性，從而降低底物親和力。普魯蘭酶N端第6位精氨酸與第84位天冬氨酸形成氫鍵，Li等［24］的研究表明氫鍵是穩定蛋白二級結構的重要作用力，對維持熱穩定性有著重要意義，增加一個氫鍵，能使酶獲得0.6 Kcal/mol的能量來維持穩定性。因此M3的Tm值低于M1可能是由于其氫鍵損失導致。

4 結論

CBM41結構域N端截短6個氨基酸，普魯蘭酶最適反應溫度和pH無變化，提升了酶活性和Tm。與野生型普魯蘭酶相比，3個截短突變體中M3性質改良綜合優勢較為明顯，比活力是WT的2.44倍，Tm提高0.93℃，Km降低0.80倍。M2的底物親和力最強，然而比活力和熱穩定性低于M3；M1的Tm最高，然而酶活性最低。因此，經截短改造的突變體酶學性質有一定程度的改良，為解析普魯蘭酶結構與功能的關系提供了相關實驗依據和分析方法。