基于HPLC法測定三種不同劑型貞芪扶正產品中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷的含量

倪 琳，王 娟

(1.甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅蘭藥藥業有限公司，甘肅 蘭州 730046)

貞芪扶正系列產品(片劑、膠囊劑、顆粒劑)是由黃芪、女貞子2味中藥組成的制劑，具有補氣養陰的功效，具有提高人體免疫功能、保護骨髓和腎上腺皮質功能的功效，常用于各種疾病引起的虛損，可配合手術、放射線、化學治療，促進正常功能的恢復[1-4]。貞芪扶正系列產品原有質量控制標準中，三個劑型原標準鑒別項、含量測定項中樣品前處理繁瑣，且采用的是薄層色譜掃描法測黃芪甲苷的含量，其樣品斑點分離不好，測定數據不準確，誤差較大。通過查閱文獻[5-12]，貞芪扶正系列產品一般采用LC-MS、HPLC法測定貞芪扶正膠囊中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷、紅景天苷等成分的含量，采用近紅外光譜法對貞茂扶正顆粒進行快速鑒別等，但有關統一貞芪扶正片、貞芪扶正膠囊、貞芪扶正顆粒質量標準的研究，國內相關文獻報道較少。本研究旨在建立簡單的樣品前處理HPLC法，統一貞芪扶正系列產品(片劑、膠囊劑、顆粒劑)中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷的含量測定方法，為貞芪扶正系列產品(片劑、膠囊劑、顆粒劑)的質量控制提供依據。

1 材料

1.1 儀器

電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；METTLER AE240型電子天平(瑞士梅特勒公司)；薄層加熱板(瑞士CAMAG公司)；Waters ACQUITY ARC型高效液相色譜儀(美國Waters)；硅膠G薄層板(青島海洋化工廠)。

1.2 試藥

1.2.1 對照品 黃芪甲苷對照品(批號110781-201717，以96.9%計)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(批號111920-201606，以97.6%計)，特女貞苷對照品(111926-201605，以93.3%計)，以上對照品均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2.2 供試品 由甘肅蘭藥藥業有限公司提供30批貞芪扶正系列產品(片劑、膠囊劑、顆粒劑)；試劑：甲醇、乙腈均為色譜純；其他試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 黃芪甲苷的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱選用CAPCELL PAK C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(32∶68)，蒸發光散射檢測器檢測；進樣量：對照品溶液10 μL、25 μL，供試品溶液20 μL；柱溫：30 ℃。理論板數按黃芪甲苷峰計算>4 000[13]。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對照11.60 mg至25 mL容量瓶中，加甲醇適量使溶解，定容，即得(此濃度適用于貞芪扶正片和貞芪扶正膠囊含量的計算)。再精密吸取2 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(此濃度適用于貞芪扶正顆粒的含量計算)。

2.1.3 供試品溶液的制備 取貞芪扶正片樣品20片，精密稱定，研細，取約1.5 g，精密稱定；取貞芪扶正膠囊樣品10粒，精密稱定，研細，取約1 g，精密稱定；取貞芪扶正顆粒(無糖型)樣品10袋，精密稱定，研細，取約2 g，精密稱定；分別置具塞錐形瓶中，精密加入含4%濃氨試液的80%甲醇溶液(取濃氨試液4 mL，加80%甲醇至100 mL，搖勻)50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用含4%濃氨溶液的80%甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續濾液25 mL，蒸干，殘渣用80%甲醇溶解，轉移至10 mL量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

取貞芪扶正顆粒(含糖型)樣品10袋，精密稱定，研細，取約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入含4%濃氨試液的80%甲醇溶液(取濃氨試液4 mL，加80%甲醇至100 mL，搖勻)50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用含4%濃氨溶液的80%甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續濾液25 mL，蒸干，殘渣加水10 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇液提取4次，每次50 mL，合并正丁醇液，蒸干，轉移至10 mL容量瓶，取上清液，用微孔濾膜過濾，即得。

2.1.4 陰性對照溶液的制備 按處方比例及工藝，取不含黃芪的陰性樣品按上述供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2.1.5 系統適應性試驗 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性溶液各10 μL，按照“2.1.1”項下的色譜條件進行測定，見圖1。結果樣品中黃芪甲苷達到基線分離，且陰性無干擾。

注：A．對照品；B.供試品(貞芪扶正片)；C.供試品(貞芪扶正膠囊)；D.供試品(貞芪扶正顆粒無糖型)；E.供試品(貞芪扶正顆粒含糖型)；F.陰性對照(1.黃芪甲苷)。圖1 黃芪HPLC圖譜

2.1.6 線性關系考察 (1)貞芪扶正片和貞芪扶正膠囊線性關系考察：精密吸取黃芪甲苷對照品(0.449 6 mg/mL)1 mL、3 mL、4 mL分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(黃芪甲苷的濃度為0.044 96 mg/mL、0.134 88 mg/mL、0.179 85 mg/mL)，各濃度進樣體積為20 μL。精密吸取黃芪甲苷對照品(0.449 6 mg/mL)5 mL置10 mL

量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(黃芪甲苷的濃度為0.224 8 mg/mL)，進樣體積為30 μL。精密吸取黃芪甲苷對照品(0.449 6 mg/mL)1 mL置5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(黃芪甲苷的濃度為0.089 92 mg/mL)，進樣體積為20 μL。以上得到系列進樣量的黃芪甲苷對照品，測得峰面積的積分值，以峰面積的積分值的對數為縱坐標(logA)，以對照品溶液的進樣量(μg) 的對數為橫坐標(logc)，作圖，得到經過原點的一條直線，回歸方程：logA=2.149 8logc+3.846 6，r=0.996 5。結果表明，黃芪甲苷在0.899 2～6.744 2 μg范圍內呈良好的線性關系。

(2)貞芪扶正顆粒線性關系考察：精密吸取黃芪甲苷對照品(0.089 9 mg/mL)2.5 mL、4 mL、5 mL分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(黃芪甲苷的濃度為0.022 5 mg/mL、0.035 97 mg/mL、0.044 96 mg/mL)，各濃度進樣體積為20 μL。精密吸取黃芪甲苷對照品(0.089 92 mg/mL)5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(黃芪甲苷的濃度為0.044 96 mg/mL)，進樣體積為30 μL。精密吸取黃芪甲苷對照品(0.089 92 mg/mL)5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(黃芪甲苷的濃度為0.044 96 mg/mL)，進樣體積為50 μL。以上得到系列進樣量的黃芪甲苷對照品，測得峰面積的積分值，以峰面積的積分值的對數為縱坐標(logA)，以對照品溶液的進樣量(μg) 的對數為橫坐標(logc)，作圖，得到經過原點的一條直線，回歸方程：logA=1.183 0logc+4.462 0，r=0.998 6。結果表明，貞芪扶正顆粒中黃芪甲苷在0.449 6～2.248 1 μg范圍內呈良好的線性關系。

2.1.7 精密度試驗 精密吸取同一濃度對照品溶液20 μL，按照“2.1.1”項下的色譜條件連續進樣6次，測定黃芪甲苷峰面積，RSD為1.39%，表明此方法精密度良好。

2.1.8 穩定性試驗 精密吸取同一批號供試品溶液20 μL，每隔2 h進樣測定1次，結果在12 h內，供試品(貞芪扶正片、貞芪扶正膠囊、貞芪扶正顆粒無糖型、貞芪扶正顆粒含糖型)溶液中黃芪甲苷峰面積穩定，RSD分別為3.03%、3.62%、1.03%、2.29%。

2.1.9 重復性試驗 取同一批號(貞芪扶正片批號：20190405；貞芪扶正膠囊批號：J20170309；貞芪扶正顆粒(無糖型)批號：K20191129；貞芪扶正顆粒(含糖型)批號：K20200201)供試品按擬定的含量測定方法依法測定黃芪甲苷含量，獨立測定6次，RSD分別為2.07%、1.27%、1.56%、1.94%。

2.1.10 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量[貞芪扶正片含黃芪甲苷1.213 3 mg/g、貞芪扶正膠囊含黃芪甲苷 2.414 4 mg/g、貞芪扶正顆粒(無糖型)含黃芪甲苷 0.546 5 mg/g、貞芪扶正顆粒(含糖型)含黃芪甲苷0.277 6 mg/g]的供試品適量[貞芪扶正片約0.75 g、貞芪扶正膠囊約0.5 g、貞芪扶正顆粒(無糖型)約1 g、貞芪扶正顆粒(含糖型)約2～3 g]6份，分別精密加入一定量的黃芪甲苷對照品溶液(濃度0.089 9 mg/mL、0.443 8 mg/mL、0.395 7 mg/mL、0.277 6 mg/mL)，按供試品含量測定方法依次測定，結果測得黃芪甲苷的平均回收率分別為99.08%、97.06%、98.92%、97.06%，RSD分別為2.76%、2.74%、2.55%、2.74%(n=6)。見表1。

表1 貞芪扶正系列產品(片劑、膠囊劑、顆粒劑)片中黃芪甲苷的加樣回收率試驗 (n=6)

2.2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱選用CAPCELL PAK C18(4.6 mm×250 mm 5 μm)；檢測波長：260 nm；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；流動相以乙腈-0.2%甲酸溶液(17∶83)為流動相；理論板數按毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰計算>3 000[13]。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品11.00 mg(含量以97.6%計)置100 mL容量瓶中，加甲醇適量使溶解，定容至刻度。[此濃度適用于貞芪扶正片、貞芪扶正膠囊、貞芪扶正顆粒(無糖型)]。再精密吸取3 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度搖勻，作為對照品溶液[此濃度適用于貞芪扶正顆粒(含糖型)]，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取貞芪扶正片樣品20片，精密稱定，研細，取約1.5 g，精密稱定；取貞芪扶正膠囊樣品10粒，精密稱定，研細，取約1 g，精密稱定；取貞芪扶正顆粒(無糖型) 樣品10袋，精密稱定，研細，取約2 g，精密稱定；取貞芪扶正顆粒(含糖型)樣品10袋，精密稱定，研細，取約5 g，精密稱定；置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流4 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 按處方比例及工藝，取不含黃芪的陰性樣品按上述供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2.2.5 系統適應性試驗 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性溶液各10 μL，按照“2.2.1”項下的色譜條件進行測定，見圖2。結果樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷達到基線分離，且陰性無干擾。

注：A．對照品；B.供試品(貞芪扶正片)；C.供試品(貞芪扶正膠囊)；.供試品(貞芪扶正顆粒無糖型)；E.供試品(貞芪扶正顆粒含糖型)；F.陰性對照(1.毛蕊異黃酮葡萄萄苷)。圖2 黃芪HPLC圖譜

2.2.6 線性關系考察 (1)貞芪扶正片、貞芪扶正膠囊、貞芪扶正顆粒(無糖型)線性關系考察：精密吸取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(0.107 4 mg/mL)2 mL、4 mL、6 mL、8 mL分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(毛蕊異黃酮葡萄糖苷的濃度為0.010 7 mg/mL、0.021 5 mg/mL、0.042 9 mg/mL、0.064 4 mg/mL、0.085 9 mg/mL、0.107 4 mg/mL)，各濃度進樣體積為10 μL。精密吸取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(0.107 4 mg/mL)6 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(毛蕊異黃酮葡萄糖苷的濃度為0.064 416 mg/mL)，進樣體積為20 μL。以上得到系列進樣量的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品，測得峰面積的積分值，以峰面積的積分值為縱坐標(A)，以對照品溶液的進樣量(μg)為

橫坐標(C)，作圖，得到經過原點的一條直線，回歸方程：A=3.430 4×106C+5.322 0×104，r=0.999 7。結果表明，貞芪扶正片、貞芪扶正膠囊、貞芪扶正顆粒(無糖型)中含毛蕊異黃酮葡萄糖苷在0.214 7～1.288 3 μg范圍內呈良好的線性關系。

(2)貞芪扶正顆粒(含糖型)線性關系考察：精密吸取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(0.032 2 mg/mL)2 mL、4 mL、6 mL、8 mL分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(毛蕊異黃酮葡萄糖苷的濃度為0.006 4 mg/mL、0.012 9 mg/mL、0.019 3 mg/mL、0.025 8 mg/mL、0.322 1 mg/mL)，各濃度進樣體積為10 μL。精密吸取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(0.032 2 mg/mL)6 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(黃芪甲苷的濃度為0.019 32 mg/mL)，進樣體積為20 μL。以上得到系列進樣量的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品，測得峰面積的積分值，以峰面積的積分值為縱坐標(A)，以對照品溶液的進樣量(μg)為橫坐標(C)，作圖，得到經過原點的一條直線，回歸方程：A=3.424 2×106C+1.875 4×104，r=0.999 7。結果表明，貞芪扶正顆粒(含糖型)中毛蕊異黃酮葡萄糖苷在0.064 4～0.386 5 μg范圍內呈良好的線性關系。

2.2.7 精密度試驗 取同一濃度毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液(濃度為0.042 9 mg/mL)，進樣量：10 μL，注入液相色譜儀，連續進樣6次，測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積，RSD為0.21%，表明此方法精密度良好。

2.2.8 穩定性試驗 取同一供試品溶液(貞芪扶正片批號：20190405；貞芪扶正膠囊批號：J20191004；貞芪扶正顆粒(無糖型)批號：K20191129；貞芪扶正顆粒(含糖型)批號：K20170311)，每隔2h進樣1次，結果在12 h內，供試品溶液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積穩定，RSD分別為0.33%、0.26%、0.61%、0.54%。

2.2.9 重復性試驗 取同一批號[貞芪扶正片批號：20190405；貞芪扶正膠囊批號：J20191004；貞芪扶正顆粒(無糖型)批號：K20191129；貞芪扶正顆粒(含糖型)批號：K20170311]供試品按擬定的含量測定方法依法測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量，獨立測定6次，RSD分別為0.76%、1.30%、0.78%、0.87%。

2.2.10 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的供試品適量[貞芪扶正片約0.5 g、貞芪扶正膠囊約0.2～0.3 g、貞芪扶正顆粒(無糖型)約0.4 g、貞芪扶正顆粒(含糖型)約0.4～0.6 g]6份，分別精密加入一定量的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液(濃度0.107 4 mg/mL)，按供試品含量測定方法依次測定，結果測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均回收率為97.83%、98.27%、98.78%、98.71%；RSD為3.08%、2.74%、2.12%、2.57%(n=6)。見表2。

表2 貞芪扶正系列產品(片劑、膠囊劑、顆粒劑)片中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的加樣回收率試驗 (n=6)

2.3 特女貞苷的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱選用CAPCELL PAK C18(4.6 mm×250 mm 5 μm)；進樣量：5 μL；柱溫：30 ℃。流動相：以甲醇-水(40∶60)為流動相，檢測波長為224 nm。理論板數按特女貞苷峰計算>4 000[13]。

2.3.2 對照品溶液的制備 取特女貞苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.079 9 mg的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 貞芪扶正片：取20片，精密稱定，研細，取約1 g；貞芪扶正膠囊：取本品10粒，精密稱定，研細，取約1 g；貞芪扶正顆粒(無糖型)取本品10袋，精密稱定，研細，取約2 g，貞芪扶正顆粒(含糖型)取約5 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，即得。

2.3.4 陰性對照溶液的制備 按處方比例及工藝，取不含女貞子的陰性樣品按上述供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2.3.5 系統適應性試驗 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性溶液各10 μL，按照“2.3.1”項下的色譜條件進行測定，見圖3。結果樣品中特女貞苷達到基線分離，且陰性無干擾。

注：A.對照品；B.供試品(貞芪扶正片)；C.供試品(貞芪扶正膠囊)；D.供試品(貞芪扶正顆粒無糖型)；E.供試品(貞芪扶正顆粒含糖型)；F.陰性對照(1.特女貞苷)。圖3 女貞子 HPLC圖譜

2.3.6 線性關系考察 精密吸取特女貞苷對照品(0.082 8 mg/mL)2 mL、4 mL、6 mL、8 mL分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(特女貞苷的濃度為0.016 556 mg/mL、0.033 1 mg/mL、0.049 7 mg/mL、0.066 2 mg/mL、0.082 8 mg/mL)，各濃度進樣體積為10 μL。精密吸取特女貞苷對照品(0.082 8 mg/mL)6 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(特女貞苷的濃度為0.049 7 mg/mL)，進樣體積為20 μL。以上得到系列進樣量的特女貞苷對照品，測得峰面積的積分值，以峰面積的積分值為縱坐標(A)，以對照品溶液的進樣量(μg)為橫坐標(C)，作圖，得到經過原點的一條直線，回歸方程：A=1.323 2×106C+1.403×103，r=0.999 8。結果表明，貞芪扶正系列產品中含特女貞苷在0.165 5～0.993 3 μg范圍內呈良好的線性關系。

2.3.7 精密度試驗 取同一濃度特女貞苷對照品溶液(濃度為0.082 8 mg/mL)，進樣量：5 μL，注入液相色譜儀，連續進樣6次，測定特女貞苷峰面積，RSD為0.25%，表明此方法精密度良好。

2.3.8 穩定性試驗 取同一供試品溶液[貞芪扶正片批號：20190405；貞芪扶正膠囊批號：J20190619；貞芪扶正顆粒(無糖型)批號：K20170222；貞芪扶正顆粒(含糖型)批號：K20170355]，每隔2 h進樣1次，結果在12 h內，供試品溶液中特女貞苷峰面積穩定，RSD分別為0.35%、1.81%、0.26%、0.35%。

2.3.9 重復性試驗 取同一批號[貞芪扶正片批號：20190405；貞芪扶正膠囊批號：J20191004；貞芪扶正顆粒(無糖型)批號：K20191129；貞芪扶正顆粒(含糖型)批號：K20170311]供試品按擬定的含量測定方法依法測定特女貞苷含量，獨立測定6次，RSD分別為0.48%、1.55%、1.16%、1.03%。

2.3.10 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的供試品適量[貞芪扶正片約0.1～0.2 g、貞芪扶正膠囊約0.1 g、貞芪扶正顆粒(無糖型)約0.2～0.4 g、貞芪扶正顆粒(含糖型)約0.5～0.7 g]6份，分別精密加入一定量的特女貞苷對照品溶液，按供試品含量測定方法依次測定，結果測得特女貞苷的平均回收率分別為99.62%、98.28%、97.01%、101.37%，RSD分別為2.13%、2.61%、1.67%、3.03%(n=6)。見表3。

表3 貞芪扶正系列產品中特女貞苷的加樣回收率試驗 (n=6)

2.3.11 樣品的測定 按“2.1.3”“2.2.3”“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，分別進樣，測定峰面積，計算貞芪扶正系列產品中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷的含量。見表4。

表4 貞芪扶正系列產品中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷的含量測定結果

3 討論

(1)樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的提取方法的選擇。采用甲醇超聲和加熱回流提取樣品、稀乙醇加熱回流和甲醇加熱回流提取樣品，采用甲醇分別測定不同提取時間：超聲1 h、1.5 h以及加熱回流1 h、2 h、4 h、5 h樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量，結果采用甲醇加熱回流4 h提取樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量較高。采用稀乙醇和甲醇分別加熱回流4 h提取樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷，結果采用甲醇加熱回流4 h提取樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量較高，故本研究采用甲醇溶液加熱回流4 h的提取方法。

(2)樣品中黃芪甲苷的提取時間的確定。采用含4%氨試液的80%甲醇溶液超聲和加熱回流提取樣品，分別測定不同提取時間：超聲30 min、40 min、60 min、90 min以及加熱回流1 h、2 h樣品中黃芪甲苷的含量，結果加熱回流1 h樣品中黃芪甲苷的含量較高，故本研究采用含4%氨試液的80%甲醇溶液加熱回流1 h的提取方法。

(3)色譜柱的選擇。選用Capcell pak C18色譜柱、Diamonsil C18色譜柱、Phenomenex C18色譜柱3 個不同品牌色譜柱測定樣品中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷的含量基本一致，結果3個品牌色譜柱均能使樣品中3種成分達到基線分離，且重現性較好，能夠滿足系統適用性試驗要求。