魚腥草治療角膜炎的網絡藥理學分析

李 雙 陳紹文 韓林濤 田代志 莫國艷 李杜軍

湖北中醫藥大學1基礎醫學院，2中藥資源與中藥復方教育部重點實驗室，3中醫藥實驗中心，4眼科教研室 湖北 武漢 430065

魚腥草（Houttuynia cordata，HC），為三白草科植物蕺菜（Houttuynia cordataThunb.）的新鮮全草或干燥地上部分，始載于《名醫別錄》，被《本草綱目》列為上品，具有明目利尿、清熱解毒、消腫排膿的功效，被國家衛生部正式確定為“既是藥品，又是食品”［1，2］。其化學成分主要為揮發油、黃酮和生物堿，具有提高免疫力、抗感染［3-5］、抗菌、抗病毒［6-8］等多種藥理活性［9］，被譽為中藥廣譜抗生素，于2003年入選為我國治療SARS 的8 種藥物之一［10］。魚腥草制劑作為一種新型的抗病毒中藥制劑，已被廣泛應用于臨床眼疾治療［11-16］。對于角膜潰爛、干眼癥及病毒性角膜炎、結膜炎，魚腥草均有確切療效，不僅安全、有效，且使用方便、藥源廣泛、不影響繼續用藥等，是極具開發前景與應用潛力的資源之一。

近年來，魚腥草研究多聚焦于化學成分分離鑒定、藥理活性、適應證方面，幾乎為有效成分鑒定及其一般藥效學探討，缺乏更系統和深入的多成分、多靶點、多功效分子作用機制研究。尤其是魚腥草抗角膜炎作用的物質基礎與分子機制領域，當前只有相關的臨床療效觀察報道［10-16］，尚無藥效學研究報道，實驗研究更是空白。

中醫藥既強調整體性，又具多成分、多靶點、多途徑的特色。網絡藥理學作為當前的一種新研究理念，即能兼顧中醫藥整體性又具有多成分、多靶點、多途徑特色，是一種可系統性研究中醫藥的方法［17］?；诖?，本研究以魚腥草治療角膜炎為研究對象，采用網絡藥理學進行探討分析，應用各種生物信息學數據庫和在線分析軟件，獲得魚腥草成分、靶點、角膜炎等信息，經過分析，預測活性成分與潛在作用靶點，從整體水平觀察“魚腥草-作用靶點-角膜炎”復雜網絡關系，分析活性成分、作用靶點和疾病間的潛在關系，探究魚腥草治療角膜炎的作用機制，奠定深入開展魚腥草治療角膜炎實驗研究的基礎，為魚腥草治療角膜炎提供科學依據與臨床應用參考。

1 材料與方法

1.1 收集角膜炎相關蛋白質靶點以“keratitis”為關 鍵 詞 在 數 據 庫DisGeNET［18］（http：//www. disgenet.org）收集與角膜炎相關的蛋白質靶點。

1.2 構建角膜炎相關蛋白質的互作網絡利用數據庫STRING 11.0（https：//string-db. org/），結合角膜炎相關蛋白質，以得分高于0.7 為標準，選取高置信度蛋白質互作信息，將數據導入Cytoscape 3.7.2（http：//www. cytoscape. org）構建角膜炎相關的蛋白質互作（protein-protein interaction，PPI）網絡。

1.3 收集魚腥草的化學成分通過中藥系統藥理學分析（TCMSP）平臺［19］（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、中國科學院化學數據庫（http：//www.organchem. csdb. cn）及中醫藥百科全書數據庫（ETCM，http：//www. tcmip. cn/ETCM/index.php/Home/），查找魚腥草的化學成分，通過Pub-Chem、ChemSpider 等數據庫，收集各化學成分的CAS 號、SMILES 結 構 式、InChIKey 名、IUPAC 名等信息。將各化學成分的SMILES 結構式信息導入 在 線 平 臺SwissADME［20］（http：//www. swissadme.ch/）中，預測它們的吸收、分布、代謝和排泄（absorption distribution metabolism and excretion，ADME）參數、藥動學特性、類藥性、藥物化學友好性，以便篩選魚腥草的活性化學成分。

1.4 預測魚腥草活性化學成分的潛在靶蛋白將上步所篩得的活性成分SMILES 結構式在SwissTargetPrediction 平 臺［21，22］（http：//www. swisstargetprediction.ch）上，應用“反向藥效團匹配法”得到各活性化學成分的潛在靶點和生物活性結果。

1.5 構建魚腥草治療角膜炎的活性成分-潛在靶點網絡利用Cytoscape 3.7.2 的Merge 功能，將角膜炎相關蛋白的PPI 網絡、魚腥草活性成分-預測靶點網絡進行合并，構建魚腥草治療角膜炎的活性成分-潛在靶點網絡。

1.6 GO 富集分析、KEGG 通路富集分析將魚腥草治療角膜炎的活性成分-潛在靶點網絡中的靶點蛋白信息，導入WebGestalt（WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit，http：//www. webgestalt.org）［23］中，進行GO 分析（生物過程、細胞組分和分子功能）與KEGG 分析。

1.7 構建“成分-靶點-通路”網絡將上述所得的KEGG 信號通路、魚腥草活性成分、潛在作用靶點數據，導入Cytoscape 3.7.2 軟件，構建魚腥草治療角膜炎的“成分-靶點-通路”網絡。

2 結果

2.1角膜炎相關的PPI 網絡在數據庫DisGeNET 中，檢索到146 個與角膜炎相關的一級蛋白，見表S1（可掃描本文OSID 二維碼查看）。經STRING 10.0 數據庫檢索，篩選出48 個與一級蛋白互作的角膜炎相關二級蛋白。經軟件Cytoscape 3.7.2 整合分析，構建角膜炎相關蛋白的PPI 網絡（圖1），包含65 個角膜炎相關蛋白質和382 條角膜炎相關蛋白質的相互作用關系。

圖1 角膜炎相關蛋白質的PPI 網絡

2.2 魚腥草活性成分-預測靶點網絡經TCMSP平臺、中國科學院化學數據庫及ETCM 數據庫共檢索魚腥草化學成分72 個，見表S2（可掃描本文OSID二維碼查看，化學成分以阿拉伯數字編號表示），導入SwissADME 進行預測，以Lipinski 違規參數≤1進行篩選，得到54 個活性成分。將活性成分相關信息導入SwissTargetPrediction 平臺，經“反向藥效團匹配法”預測，得到各活性成分的靶點蛋白，整合可能性非零的預測靶點信息，導入Cytoscape 3.7.2 進行擬構，得到魚腥草活性成分-預測靶點網絡（圖2），包括含1 877 條活性成分-預測靶點聯系、48 個化合物節點和619 個靶點節點。

圖2 魚腥草活性成分-預測靶點網絡

2.3 與角膜炎相關的魚腥草活性成分-潛在靶點網絡應用Cytoscape 3.7.2 合并功能，將角膜炎相關的PPI 網絡、魚腥草活性成分-預測靶點網絡進行合并，刪除無交集靶點，構建角膜炎相關的魚腥草活性成分-潛在靶點網絡，見圖3。節點之間主要連接原則為：當魚腥草活性成分作用靶點與角膜炎靶點相同時，則活性成分節點與靶點節點聯系起來，此相同靶點即為魚腥草活性成分治療角膜炎的潛在靶點。該網絡由14 個成分節點、50 個靶點節點與160 條活性成分-潛在靶點聯系所構成。其中，50 個靶點中含9 個直接作用靶點（即圖3 中間小圓），包括白細胞介素（IL）-6、Toll 樣受體（TLR）9、腫瘤壞死因子（TNF）等，以及41 個間接靶點（即圖3 右側大圓），主要包括IL-10、TLR2、血管內皮生長因子-A（VEGF-A）等。

圖3 與角膜炎相關的魚腥草活性成分-潛在靶點網絡

應用Cytoscape 3.7.2之Network Analysis-Analyze Network 功能，分析此網絡中各靶點的度值（Degree），可了解與該靶點相互作用的蛋白與魚腥草活性成分數量（見表S3，可掃描本文OSID 二維碼查看）。通常，度值大小代表著對應節點與其他節點的聯系程度，暗示節點在網絡中的關鍵性大小，Degree越大，表明作用于此靶點的魚腥草活性成分數量或互作蛋白數量越多，暗示活性成分通過該靶點發揮作用的可能性就越大。分析結果表明9個直接靶點平均受2.22 個魚腥草成分作用，其中靶點CD38、MAPK8、TNF、CASP1 受2 個以上魚腥草成分作用，提示它們很可能是魚腥草活性成分發揮作用的潛在靶點。

2.4 GO 富集分析和KEGG 信號通路富集分析應用WebGestalt，對50 個潛在靶點進行GO 富集分析及KEGG 信號通路富集分析（P＜0.05）。經GO分析，潛在靶點被注釋入303 項GO 術語中，包括263 項生物過程、18 項細胞組分、22 項分子功能，并以這三項下前3 個GO 術語與作用于潛在靶點的活性成分數量進行綜合分析（圖4），潛在靶點明顯富集于炎癥反應、脂多糖細胞反應、NF-κB 轉錄因子活性的正調控等生物過程，多為細胞外間隙、胞外區、質膜外側之類的細胞組分，主要具有細胞因子活性、生長因子活性、趨化因子活性等細胞功能。

圖4 魚腥草活性成分治療角膜炎潛在靶點的GO 功能富集分析

KEGG分析表明，50個潛在靶點被富集入10條信號通路（P＜0.001），所富集入的靶點數量不小于10個，靶點富集率介于13%～29%之間，顯著富集的信號通路具體為：IL-17信號通路（hsa04657）、Toll樣受體信號通路（hsa04620）、百 日 咳（hsa05133）、美 國 錐 蟲 ?。╤sa05142）、炎癥性腸?。╤sa05321）、類風濕性關節炎（hsa05323）、肺結核（hsa05152）、瘧疾（hsa05144）、NOD樣受體信號通路（hsa04621）、沙門氏菌感染（hsa05132），結果見圖5及表S4（可掃描本文OSID二維碼查看）。

圖5 魚腥草活性成分治療角膜炎潛在靶點的KEGG 信號通路富集分析

2.5 魚腥草治療角膜炎“成分-靶點-通路”網絡的構建應用Cytoscape 3.7.2 將魚腥草治療角膜炎的15 個活性成分、50 個潛在靶點及其所富集的10條KEGG 信號通路進行整合，構建魚腥草治療角膜炎的“成分-靶點-通路”網絡圖，結果見圖6。從圖6可知，不同化學成分可作用于不同靶點，也可作用于同一靶點，同一靶點可參與多條信號通路，如魚腥草中（R）-芳樟醇（9）、綠蓮皂苷元（19）、樟葉木防己堿（27）等5 種成分都可作用于角膜炎靶點MAPK8，此靶 點 可 注 釋 入hsa04657、hsa04620、hsa05133、hsa05142 共4 條信號通路中，體現了中醫藥多成分、多作用途徑的特點；另一方面，同一成分可作用多個靶點，同一靶點又可受多個成分作用，如山柰酚-3-O-葡萄糖鼠李糖苷（36）、山柰酚-3-O-A-L-吡喃鼠李糖苷（42）共3 種成分既可作用于靶點CD38，也可作用于TNF 靶點；再者，綠蓮皂苷元（19）既作用于MAPK8，也作用于NTRK1；靶點MAPK8、TNF 不僅參與多條信號通路，還有多個互作蛋白，盡管NTRK1、CD38 在本研究中沒有富集入任何信號通路，但CD38 受多個魚腥草成分作用，還與TNF、IL-6相互作用，NTRK1 雖只被綠蓮皂苷元（19）作用，但與NGF、VEGF-A、IKBKG 相互作用，這種交叉互作的關系不但體現了中醫藥“多成分、多靶點、多途徑”的特色，也契合了中醫藥的整體性網絡調控理念。

圖6 魚腥草治療角膜炎的“成分-靶點-通路”網絡圖

3 討論

本研究應用網絡藥理學對魚腥草治療角膜炎的活性成分、潛在靶點及分子機制進行分析探討與預測。在魚腥草已分離鑒定的72 個化學成分中有14 個成分可能是其治療角膜炎的活性成分，包括（R）-芳樟醇（9）、新綠原酸（17）、綠蓮皂苷元（19）、山柰酚（24）等；在146 個角膜炎相關靶點有50 個為魚腥草治療角膜炎的潛在靶點，其中有9 個直接作用靶點，包括MAPK8、CD38、TNF 等。魚腥草化學成分中黃酮類和揮發油為主要活性成分，魚腥草素（39）、甲基正壬酮（49）、月桂醛（5）、山柰酚（24）、槲皮素（50）是魚腥草發揮抗炎、抑菌、抗病毒、抗氧化等藥理作用的有效成分；其中魚腥草素（39）、甲基正壬酮（49）是魚腥草注射液、魚腥草滴眼液等中成藥的主要藥效物質，可通過作用TNF-α、IL-1β、TLR4、IL-10、COX2、IL-6、TGF-β1 等靶點發揮抗炎、抑菌、抗氧化活性［2］；山柰酚（24）能作用于靶點TNF-α、IL-1β、IL-6 等而發揮抗氧化、抗炎、抗凋亡與 神 經 保 護 作 用［24，25］；槲 皮 素（50）亦 可 作 用 于TNF-α、IL-1β、IL-6 等靶點發揮其抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抑菌等多種藥理活性［26］?，F有研究報道提示，TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-8、IL-6 等與單純皰疹性角膜炎、真菌性角膜炎直接相關［27，28］，其中，TNF、TLR9、IL-6、CXCL8（又名IL-8）也是本研究所預測的直接靶點?？梢?，本研究中魚腥草治療角膜炎之活性成分與潛在作用靶點的預測結果在一定程度上已被既往相關研究所佐證。

GO 分析結果顯示，潛在靶點主要參與炎癥反應、脂多糖細胞反應、NF-κB 轉錄因子活性正調控之類的生物過程，具有細胞因子、生長因子、趨化因子的活性，是細胞外間隙、胞外區、質膜外側的細胞組分（圖4），涉及了炎癥反應、炎癥調控、凋亡、免疫等多種作用，主要體現在按功能分類時，可被分為炎癥反應與信號的CXCL8、cAMP、IL-6 等，先天免疫 的 CLEC7A、S100A8、IRAK1 等，凋 亡 的CASP1、S100A8、CHI3L1 等，調控炎癥反應的IL-6、TNF、IL-1β、CXCL8 等。而且，潛在靶點顯著富集于與炎癥、感染（細菌、寄生蟲）、免疫相關的通路上，包括IL-17 信號通路、Toll 樣受體信號通路、百日咳等10 條KEGG 信號通路（圖5）。據報道，魚腥草具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗氧化等多種藥理作用［2］，包括魚腥草揮發油降低COX2 表達并抑制PGE2 釋放；黃酮類抑制IL-6、NO 產生；萜類化合物結合一些參與感染與炎癥的蛋白質或酶而抗炎；生物堿類抑制NO 產生而抗炎；魚腥草素對大腸桿菌、金葡球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、假絲酵母等具有一定的抑菌效果；成分甲基正壬酮、月桂醛、辛醛等具有直接抗Ⅰ型單純皰疹病毒（HSV-1）、流感病毒、Ⅰ型人類免疫缺陷病毒（HIV-1）的活性；成分槲皮素、槲皮苷和異槲皮苷可通過抑制NF-κB 激活而抑制HSV-2 感染；總黃酮和多酚具顯著清除羥基、超氧陰離子自由基的能力。此外，還有研究表明，魚腥草可抑制或阻止高滲透壓、VEGF 高表達所致的角膜上皮損傷［29］。這些研究結果不但證實本研究的分析結果：魚腥草的潛在靶點顯著富集于與炎癥、感染（細菌、寄生蟲）、免疫相關通路，還暗示魚腥草對細菌、病毒、寄生蟲病因性角膜炎存在潛在治療作用。

綜上所述，魚腥草中（R）-芳樟醇（9）、新綠原酸（17）、綠蓮皂苷元（19）等活性成分可能作用于MAPK8、CD38、TNF 等靶點，通過IL-17 信號通路、Toll 樣受體信號通路、百日咳等信號通路而發揮抗炎、抑菌、抗病毒、增強免疫等活性作用。因此，“多成分、多靶點、多途徑”是魚腥草達成治療細菌、病毒、真菌、外傷、免疫力低下等各種病因性角膜炎的根本途徑，也是角膜炎的治則、治法所在，既為臨床應用提供科學依據，也奠定了后續進一步開展實驗研究的基礎。