ING4、p53、p21、ER、PR與漿液性卵巢癌中 的表達及意義

宿曉曉，李珍，董杏，來夢杰，白忻如，張佩，張威，曾憲旭

(鄭州大學第三附屬醫院病理科，河南 鄭州 450000)

0 引言

卵巢癌(ovarian cancer)是女性生殖系統惡性腫瘤中導致女性死亡的主要原因。卵巢癌中最常見的是上皮性卵巢癌，其包括不同的組織學類型，不同的組織學類型來源可能不同[1]。其中，漿液性卵巢癌是最常見的類型。由于缺乏早期篩查的指標及患者對化療藥物的耐藥性，約有75%的患者在就診時已經是卵巢癌晚期[2]，其5年總生存率不到30%[3]。尋找治療卵巢癌的新的標志物及治療靶點是有必要的。ING4作為一種候選抑癌基因[4]。研究表明，ING4在細胞凋亡、細胞分化、細胞周期調控、DNA損傷修復及控制細胞衰老中起著重要作用[5,6]。本研究通過檢測漿液性卵巢癌中ING4、p53、p21、ER、PR的表達，研究它們在漿液性卵巢癌表達及臨床意義，為漿液性卵巢癌的治療提供臨床依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月至2020年3月鄭州大學第三附屬醫院病理科歸檔的組織蠟塊，所選患者年齡37~71歲，平均年齡52歲。其中59例漿液性卵巢癌(A組)，20例交界性漿液性囊腺瘤(B組)，21例漿液性囊腺瘤(C組)；Ⅰ、Ⅱ期32例，Ⅲ、Ⅳ期27例；中、高分化21例，低分化38例；淋巴結轉移11例，無轉移48例。所有患者均經病理確診，肝腎功能正常，手術資料完整，未進行放化療。本研究經鄭州大學第三附屬醫院倫理委員會批準通過[7]。

1.2 試劑

自武漢三鷹公司的ING4多克隆抗體購；購自美國羅氏診斷產品(上海)有限公司的p53、ER、PR多克隆抗體均；購自艾博抗(上海)貿易有限公司的p21多克隆抗體。

1.3 實驗方法

1.3.1 組織芯片制作

首先在HE切片上選取具有代表性的漿液性卵巢癌組織，在對應的蠟塊標本上標記，選定穿刺點，用穿刺針采集所選組織，按照6×8的序列將其整齊的注入在蠟塊列陣中。使用切片機以4μm厚度進行連續切片。

1.3.2 免疫組織化學染色

按上述方法獲得組織芯片蠟塊，切片并將片子放置在75℃烤箱中60min，然后放入二甲苯溶液中脫蠟，然后依次浸入梯度酒精中脫水，然后用水沖洗，然后將切片置于煮沸的EDTA溶液中修復20min；冷卻至室溫后放入濕盒中加適量3%H202封閉處理，PBS沖洗。按比例滴加稀釋好的一抗，包括ING4(1：600)、p21(1:200)、p53(即用型)、ER(即用型)、PR(即用型)，37℃孵育60min，PBS沖洗。滴加即用型二抗，37℃孵育30min，PBS沖洗。DAB顯色，蘇木素復染后封片、晾干。

1.4 結果判定

由兩位病理科主任醫師通過染色評分。雙盲法閱片，在高倍鏡下(×40)隨機選取5個視野進行陽性細胞數統計。評分標準：①根據陽性細胞百分比：陰性0分，1%~10%1分，10%~50%2分，≥50%3分；②根據著色深度：無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。兩項得分相加＜3分為陰性，≥3分為陽性[7-9]。

1.5 統計學分析

數據分析應用SPSS 26.0統計軟件，計數資料用例數或百分數表示，組間比較應用χ2檢驗及Fisher確切概率法；應用Spearman 相關分析分析漿液性卵巢癌組織中ING4、p53、p21、ER及PR蛋白之間表達的相關性。若P＜0.05表明差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同卵巢組織中ING4、p53、p21、ER及PR蛋白的表達情況

免疫組化結果如圖1所示。ING4和p53蛋白主要在細胞核中表達、在細胞質及細胞間質中有少量表達，呈棕黃色顆粒。p21、ER、PR蛋白主要在細胞核中表達，呈棕黃色顆粒。ING4蛋白的陽性表達率在C組最高，在B組和A組逐漸降低，且三者之間比較差異有統計學意義(P＜0.05)；A組中p53蛋白的陽性表達率高于B、C兩組，且A組同C組相比差異有統計學意義(P＜0.05)；C組中p21蛋白的陽性表達率高于A組和B組，C組和A組比較差異具有統計學意義(P＜0.05)。ER、PR蛋白的陽性表達率在A組、B組、C組中逐漸升高，且A組與B、C組比較差異有統計學意義(P＜0.05)(見表1)。

圖1 ING4、p53 、p21及ER、PR在不同組的表達(SP,×40)

表1 p53、p21、ER、PR和ING4在不同組織中的表達情況[n(%)]

2.2 ING4、p53、p21、ER及PR在漿液性卵巢癌中的表達及與病理特征的關系

p53的表達隨著漿液性卵巢癌病理分期增加、分化程度降低和淋巴結轉移有上升趨勢；p21的表達與漿液性卵巢癌分化程度的降低有升高的趨勢；ER的表達與淋巴結轉移有關；差異有統計學意義(P＜0.05)。PR的表達與病理分期、分化程度和淋巴結轉移無顯著相關性；本實驗中ING4陽性表達的例數較少，所以ING4陽性表達與臨床病理分期、分化程度和淋巴結轉移的關系尚不能確定(見表2)。

表2 漿液性卵巢癌組織中ING4、P53、P21、ER、PR的陽性表達及與病理特征的關系[n(%)]

2.3 漿液性卵巢癌中ING4、p53、p21、ER與PR的相關性研究

Pearson相關分析顯示：ING4表達與p21表達呈正相關，且差異具有統計學意義(r=0.029，P＜0.05)；p53的表達和p21的表達呈負相關，差異有統計學意義(r=0.137，P＜0.05)；ING4的表達與ER和PR的表達無顯著相關性(P＞0.05)(見表3)。

表3 ING4與p53、p21、ER、PR的相關性(r值)

3 討論

本實驗結果表明，ING4蛋白在漿液性卵巢癌組織中的表達較正常卵巢組織相比明顯降低，但由于其在漿液性卵巢癌中的陽性表達例數較少，因此ING4蛋白在漿液性卵巢癌組織中的表達與腫瘤臨床病理分期、分化程度和淋巴結轉移的關系尚不能確定。ING4是一種新型的腫瘤抑制因子，屬于II型腫瘤抑制因子家族?，F有的研究表明，ING4在乳腺癌[10]，前列腺癌[11]，子宮內膜樣癌[12]，宮頸癌[13]等腫瘤中存在缺失，突變或表達下調，表明ING4的表達與腫瘤的發生、發展有關[14-17]。越來越多的研究表明，ING4可以通過誘導細胞周期改變、細胞凋亡及細胞毒性自噬作用，在細胞中以p53依賴或非依賴的方式誘導腫瘤細胞的生長[18,19]。

p53蛋白是一種重要的腫瘤抑制因子，主要參與檢測包括細胞周期停滯、DNA修復、細胞衰老、細胞凋亡、細胞分化等多種細胞過程[18,19]。激活p53并且誘導腫瘤細胞凋亡是癌癥治療的一種有效方法。通常50%的人類p53基因發生突變，許多突變型p53蛋白通過多種機制獲得促腫瘤作用，而且增加的腫瘤細胞對化療和放療的耐藥性[20-22]。本實驗結果表明，p53的表達隨著漿液性卵巢癌病理分期增加、分化程度降低和淋巴結轉移有上升的趨勢。

p21蛋白屬于細胞周期抑制因子，研究表明，p21與腫瘤的增殖、分化、轉移及浸潤有關，其也可通過抑制細胞周期，促進細胞衰老[23,24]。本實驗結果顯示：p21的陽性表達率與卵巢癌分化程度的降低有增加的趨勢。有研究表明ING4介導的p21上調依賴于ING4與p53之間的直接相互作用，增強p53乙?；捌滢D錄活性，可上調p21的表達。p21蛋白表達水平升高，使細胞停滯在G1期，從而抑制組織細胞的生長[22][25]。

在內分泌器官中，雌/孕激素受體對預測惡性腫瘤及判斷其預后具有重要作用。以往研究表明，雌孕激素受體在卵巢癌中的表達特點及其預后仍存在爭議[6-7,26-28]。但在本研究表明，雌孕激素受體的表達情況與漿液性卵巢癌的臨床病理特征無顯著相關性。

在本研究中，ING4及p21蛋白表達與卵巢癌的發生呈負相關。p53的陽性表達與臨床分期、分化程度及淋巴結轉移有關。結合以往的相關研究，推測ING4與p53在卵巢惡性轉化過程中的相互作用減弱，p21的調節減弱，細胞周期調控喪失，凋亡機制喪失、增殖異常，導致卵巢組織癌變。ING4通過p53和p21途徑調控細胞周期，在上皮性卵巢癌中發揮重要作用，聯合檢測ING4、p53、p21有助于上皮性卵巢癌的早期診斷、精準治療及預測預后。